המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר ג&#39;יימס (Zhijian) חן (UT Southwestern, ביולוגיה מולקולרית) לאספקת ריאגנטים חיוניים, כולל את MAVs - / - עכברים, ודר &#39;רן יום ראשון (אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס, פרמקולוגיה ורפואה המולקולרית ) למתן כרומוזום המלאכותי של חיידקי γHV68 למחקר זה.

1. זיהום עכבר עם γHV68 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי המלטה שש עד שמונה שבועות ישן, מגדר בהתאמה (8-12 עכברים / קבוצתי) משמשים להדבקה בנגיף. אפשר להתאקלם עכברים במשך ארבעה ימים מלאים (96 שעות) לאחר משלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדי פרוטוקול באמצעות וירוס צריכים להתבצע בקבינט של רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) באמצעות BSL2 אמצעי זהירות רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה נגיפית (40-1 x 10 5 יחידות שלט יוצרים [pfu]) של γHV68 ב30 μl של PBS סטרילי לעכבר ממש לפני הניסוי. שמור על השעיה נגיפית על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסת קטמין / xylazine (1.5 קטמין מ&quot;ג ומשקל 0.15 מ&quot;ג xylazine/20 גרם גוף, 100 μl / עכבר) להרגעת עכבר. ודא כי העכברים סוממו על ידי ביצוע קמצוץ בוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים שקטים ורגועים עם קטמין מ&quot;ג 1.5 וxylazine 0.15 מ&quot;ג למשקל גוף 20 מ&quot;ג (100 μl / עכבר) בזריקה תוך הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק השעיה נגיפית (30 μl / עכבר) intranasally, במבחינת ירידהאופנה, לנחיר אחד של העכברים המסוממים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lay עכברים בצד אחד ל5-10 דקות כדי להקל על המשלוח דרכי הנשימה של הנגיף לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים למקם אותו בחזרה בכלוב עכברים ומוניטור עד שהם התאוששו באופן מלא מתרופות הרגעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים שונים לאחר פגיעה, להקריב את עכברים על ידי 2 מחנק וקציר הריאות לאחר הבטחת מוות / איבוד ההכרה עמוקה CO. ריאות מקום לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל סטריליים בורג כתרים המכילים 500 μl של 1.0 מ&quot;מ חרוזי Zirconia / סיליקה. שמור צינורות על קרח. דגימות חנות ב -80 ° C, אם לא ימשיך לשלב הבא באותו היום. הטחול או רקמת כבד יכול להיות שנאסף בשלב זה לניתוח של חביון הנגיפי בהתאם למסגרת זמן של ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של DMEM הקר סרום נטול לתוך הצינור והומוגני הריאות ב 30 שניות חרוז מכות. צ&#39;יל צינורות על קרח לדקות לפחות 1. חזור על תהליך זה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאות צנטריפוגה lysates ב16000 RCF ב 4 ° C למשך דקת 1 ולהשתמש supernatant לקבוע כייל נגיף ידי assay פלאק באמצעות monolayer NIH3T3 או BHK21 (ראה סעיף 5 לפרטים נוספים). </li></ol> 2. קבע γHV68 קינטיקה צמיחה רבת שלבים בפיברובלסטים עובריים של עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול fibroblasts הסוג פראי העכבר עוברי (MEFs) ואלה חסרים בגן מארח למשנה confluent צפיפות (כ 80%) לפני תאי ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול MEFs לתוך צלחת 24 גם ב -10,000 תאים / היטב לmultipilicity-of-זיהום נמוך (משרד פנים) ביום שלפני הזיהום. ניסויים בדרך כלל מתבצעים בtriplicates ובמשרד פנים בין 0.001-0.05 משמשים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן γHV68 השעיה המכילה כמות רצויה של וירוס (0.5 מ&quot;ל לטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולכסות MEFs עם 0.5 מ&quot;ל של השעיה לγHV68 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ברקמות תרבות חממה, רוק בכל 30 דקות, ותאפשר להמשיך דגירה עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת השעיה נגיפית, ולכסות את תאים עם 0.5 המ&quot;ל ג טריomplete DMEM בינוני המכיל 8% בסרום שור עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים שונים לאחר פגיעה, למסוק הבינוני ותאים לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל צנטריפוגות סטריליים. מייד להקפיא צינורות ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרור γHV68 מMEFs על ידי הקפאה ב-80 ° C, בהפשרת 37 ° C אמבט מים וvortexing. שלושה מחזורים של הקפאה והפשרה מיושם בדרך כלל לדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע כייל נגיף ידי assay פלאק באמצעות monolayer NIH3T3 או BHK21 (ראה סעיף 5 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו כייל נגיף ועקומת עלילת γHV68 רב שלבי צמיחה בMEFs. </li></ol> 3. נתיחה מולקולרית של שכפול ממוסס γHV68 בפיברובלסטים עובריים של עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זיהום נגיפי כמתואר בשלבים 2.1-2.6 לסעיף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים שונים לאחר פגיעה, להשליך supernatant. יש לשטוף את תאים עם תאי trypsinize הקר PBS ו. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב1000 RCF בטמפרטורת חדר למשך דקה 1. בטל supernatant ותאי חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ דנ&quot;א כולל (מארח והגנום נגיפי) ו-RNA כלל על פי שיטות שפורסמו בעבר 5,6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR בזמן האמת באמצעות דנ&quot;א ופריימרים ספציפיים לתעתיקי ממוסס נגיפיים, כגון RTA (ORF50), ORF57 וORF60 מוחלט. לקבוע את הכמות היחסית של הגנום תאי γHV68 בהתייחסות לגן משק מארח (למשל, β-יקטין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר זיהום הדנ&quot;א הגנומי, טיפול עם RNase ללא DNase הוא קריטי להכנת cDNA עם פריימר רנ&quot;א המוחלט וOligo (dT) 11-19. להתייחס התייחסות 5 לפרטים נוספים על חילוץ רנ&quot;א כולל טיפול עם RNase ללא DNase וRT-PCR. לבצע PCR בזמן האמת באמצעות cDNA ופריימרים כאמורים לעיל, כדי לקבוע את הכמות היחסית של תעתיקים נגיפיים בהתייחסות לזה של גן המשק מארח. </li></ol> 4. יצירת רקומביננטי כרומוזום מלאכותי חיידקים באמצעות γHV68 Methoד מתואר כאן משמש להציג מוטציות לגן γHV68 כי הוא מעורב באינטראקצית מארח וירוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קטע DNA (כ -1.5 ק&quot;ג) של רצף פרוע סוג או רצף נושא מוטציות רצויות באזור המרכז באמצעות PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כרומוזום מלאכותי חיידקים (BAC) שמכיל 7 transposon הכנסה סביב אתר המוטציה, שמנטרל את גן הגן של עניין, על ידי טיהור midi קנה מידה (OriGene) באופן ספציפי. החנות BAC DNA ב 4 ° C (להימנע מהקפאה / פשרה של BAC-DNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect BAC-DNA וה-PCR מוצר המכילים מוטציות רצויות של הגן של עניין לתאים (למשל, NIH3T3 או BHK21), שהם מתירנית מאוד לשכפול ממוסס γHV68, עם Lipofectamine 2000 (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי פיצול עד השפעת cytopathic (CPE) מופיעה בmonolayer. איסוף וירוסים המכיל supernatant ואם יש צורך, להגביר וירוס בNIH3T3 או BHK21 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים עם NIH3T3רקומביננטי וירוס ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 1800, 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> γHV68 הנגועים NIH3T3 תאי קציר ולהכין הגנום נגיפי circularized באמצעות הפרוטוקול של הירט 8,9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך תאים מוסמכים DH10B אלקטרו MAX (Invitrogen) על ידי electroporation ומסך למושבות שהתנגדות לchloramphenicol (סנטימטר), אבל רגישה לkanamycin (קאן) (גן סנטימטרים עמידים הוא בעמוד שדרת BAC, ואילו גן קאן עמיד הוא בtransposon הכנסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מושבות S הסנטימטרים R קאן בchlorophenicol בינוני מכיל ולהכין BAC DNA עם טיהור מיני או midi קנה מידה (OriGene). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את המוטציה הרצויה בגן היעד באמצעות PCR, באמצעות פריימרים ספציפיים לאיגוף אזורים של אתר מוטציה, ורצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר אין סידור מחדש בכרומוזום BAC ידי עיכול עם אנזימי הגבלה נבחרים ואלקטרופורזה ג&#39;ל דופק שדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect רקומביננטי BAC לתוך תאי NIH 3T3 או BHK21 עם Lipofectamine2000 (Invitrogen) להכין רקומביננטי γHV68. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור passaging תאים עד CPE מופיע בmonolayer. איסוף וירוסים המכיל supernatant ולהגביר רקומביננטי γHV68 בNIH3T3 או BHK21 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע כייל נוגדנים של נגיף רקומביננטי ולאפיין vivo הנגיפי צמיחת נכסים לשעבר וin vivo כמתואר בסעיפי 1 ו 2. </li></ol> 5. קבע כייל נגיף ידי assay פלאק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול NIH3T3 תאים למשנה confluent צפיפות (כ 80%) לפני תאי ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול NIH3T3 לתוך צלחת 24 גם ב20,000 תאים / גם ביום שלפני הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן supernatants וירוסים התוקפים מדולל-10-קיפול עם DMEM בינוני המכיל 8% סרום עגלים נולד (NCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולכסות NIH3T3 תאים עם 0.5 מ&quot;ל של γHV68 השעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ברקמות תרבות חממה, רוק וכל 30 דקות, ולאפשר דגירה להמשיךעבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת השעיה נגיפית ותאים עם כיסוי בינוני 0.5 מ&quot;ל DMEM המכיל 2% NCS ו0.75% methylcellulose (סיגמא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ברקמות תרבות חממה. ספירת הפלאק ביום 6 לאחר פגיעה. צביעת monolayer, למשל עם סגול גביש, עשויה להקל על ספירת פלאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב כייל הנגיף בlysates הרקמות החי או תא lysates תוך שימוש בנוסחא הבאה: כייל (pfu / מ&quot;ל) = ע x N x 1000 μl / מיליליטר ÷ μl V. N, הממוצע של מספר לוחית בדילול מתאים; ד &#39;, דילול קיפול (כמו 5, 10, 100 .....) V (μl), הנפח של supernatant סדרתי המדולל לכל גם הוסיף. </li></ol> 6. נציג תוצאות: שלוש דמויות מייצגות מוצגות כאן, כוללות שכפול γHV68 מס ובריאות של MAVs סוג פראי - / - עכבר 10, γHV68 פנוטיפים שכפול ממוסס בפיברובלסטים עובריים של עכבר (MEF), וrecombinנמלת γHV68 נושאה מוטציות בתוך האתרים זרחון כי הם מווסתים על ידי IKKβ MAVs התלוי. שלושה ניסויים אלה מהווים מסייעים תכנית להגדיר את התפקידים של רכיבים חיסוניים מולדים בשכפול ממוסס γHV68 in vivo ו vivo לשעבר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" /> איור 1 γHV68 עומסים בתוך הריאות של MAVs + / + וMAVs -. / - עכברים. ) איתות מולדת שני מסלולים עיקרית במורד זרם של MAVs. את ממסרי MAVs מתאם מולקולת איתות מקולטנית cytosolic RIG-I-כמו להפעיל גורמים רגולטוריים אינטרפרון (IRFs) NFκB וכי, בתורו, מעלה לווסת את ביטוי הגנים של ציטוקינים מעודדים דלקת ואינטרפרונים. B) + / + וMAVs MAVs - / - עכברים נגועים ב40 pfu γHV68 intranasally ועומס נגיפי בריאה בנקודתי זמן שצוינו היה להרתיע<html> ממוקש ידי assay פלאק באמצעות NIH3T3 monolayer. כל סמל מייצג עכבר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" /> איור 2. ΓHV68 קינטיקה השכפול ממוסס בfibroblasts העכבר העוברי (MEFs). השכפול של ממוסס γHV68 על MAVs + / + וMAVs - / - MEFs הוערך על ידי עיקולים רבי שלבי צמיחה () וזמן האמת PCR כמוני (B). עבור שני הניסויים, מספר שווה של MEFs וכמות γHV68 שמשו לזיהום נגיפי בריבוי-of-זיהום (משרד פנים) של 0.01. () תאים וsupernatants נקצרו בנקודתי זמן מצוין ובכפוף assay פלאק לקבוע titers הנגיפי. (ב) סך רנ&quot;א היה שחולץ מן MEFs γHV68 הנגוע ונותח על ידי PCR כמותית בזמן אמת עם פריימרים ספציפיים לתעתיקי ממוסס נבחרים (RTA, ORF57, וORF60). ig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. קינטיקה של שכפול ממוסס רקומביננטי γHV68 מוטציות שנשאו בתוך תחום transactivation RTA שלבטל זירחון ידי IKKγ. () עיקולים רבי שלבי צמיחה של נגיף רקומביננטי פראי מסוג (γHV68.wt) ונגיף עבר מוטציה (γHV68.mut) בMAVs + / + וMAVs - / - תאי MEFs (משרד פנים = 0.01). MEFs היו נגוע בγHV68 במשרד פנים של 0.01. תאים וsupernatants נקצרו בנקודתי זמן מצוין ומכייל נגיף נקבעו על ידי assay פלאק באמצעות monolayer 3T3-NIH. (ב) רמת γHV68 RTA mRNA בתאי NIH3T3 γHV68 נגועים (משרד פנים = 0.01). ב30 שעות לאחר פגיעה, RNA כלל הופקו מתאי 3T3 NIH γHV68 נגועים ונותחו על ידי PCR כמותית בזמן אמת.

<ol>
	<li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124, 783-801 (2006).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response.">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449, 819-826 (2007).</li><li>Speck, S. H., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+viral+genetics+of+chronic+infection:+a+mouse+model+of+gamma-herpesvirus+pathogenesis.">Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).</li><li>Speck, S. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+latency+and+its+regulation:+lessons+from+the+gamma-herpesviruses.">Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses.</a> Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).</li><li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gamma-herpesvirus+68+hijacks+MAVS+and+IKKbeta+to+initiate+lytic+replication.">Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication.</a> PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).</li><li>Strauss, W. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+mammalian+tissues.">Preparation of genomic DNA from mammalian tissues.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).</li><li>Song, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+viral+genes+essential+for+replication+of+murine+gamma-herpesvirus+68+using+signature-tagged+mutagenesis.">Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).</li><li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures.">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).</li><li>Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+&#946;-herpesvirus+genomes+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Cloning of &#946;-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).</li><li>Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specific+and+essential+role+of+MAVS+in+antiviral+innate+immune+responses.">The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses.</a> Immunity. 24, 633-642 (2006).</li><li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MAVS,+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3.">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122, 669-682 (2005).</li><li>Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPS-1,+an+adaptor+triggering+RIG-I-+and+Mda5-mediated+type+I+interferon+induction.">IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction.</a> Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).</li><li>Meylan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardif+is+an+adaptor+protein+in+the+RIG-I+antiviral+pathway+and+is+targeted+by+hepatitis+C+virus.">Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.</a> Nature. 437, 1167-1172 (2005).</li><li>Xu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VISA+is+an+adapter+protein+required+for+virus-triggered+IFN-beta+signaling.">VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling.</a> Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בתגובה לזיהום נגיפי, שבילים החיסוניים המולדים MAVs תלויי איתות מופעלים כדי לקדם את הייצור של ציטוקינים דלקתיים אנטי 10-14. שימוש γHV68 העכברי כוירוס מודל לסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של האדם אונקוגני קפוסי וEpstein-Barr וירוס 3,4, גילה שγHV68 usurps מסלול MAVs-IKKβ לקדם שכפול ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> תאים מוסמכים DH10B אלקטרו MAX </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> סיגמא </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP System Miniprep פלסמיד </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP System Midiprep פלסמיד </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

בתגובה לזיהום נגיפי, מארח מפתחת תגובות הגנתיות שונות, כגון הפעלת מסלולי איתות חיסוניים מולדים שמובילים ל1,2 ייצור ציטוקינים אנטי. על מנת ליישב את המארח, וירוסים הם מחייבים להתחמק תגובות מארחות אנטי ולתפעל מסלולי איתות. להתיר את אינטראקצית מארח הווירוס שישפוך אור על פיתוח אסטרטגיות הטיפוליות החדשניות נגד זיהום ויראלי. Murine γHV68 הוא קשור קשר הדוק לסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של האדם אונקוגני קפוסי וEpsten-Barr וירוס 3,4. γHV68 דלקת בעכברי מעבדה מספקת מודל חיה קטנה צייתן לבחון את כל המהלך של תגובות מארחות וזיהום ויראלי בvivo, אשר אינם זמינים לherpesviruses אדם. בפרוטוקול זה, אנו מציגים פנל של שיטות לאפיון פנוטיפי ונתיחה מולקולרית של רכיבים מארחים איתות בreplic ממוסס γHV68ation בשניהם vivo ו vivo לשעבר. הזמינות של זני עכבר מהונדס גנטי מאפשרת החקירה של התפקידים של מסלולי איתות מארחת במהלך זיהום החריף γHV68 in vivo. בנוסף, fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) שבודד מזני העכברים החסרים אלה יכול לשמש כדי לנתח את התפקידים של המולקולות האלה עוד יותר במהלך vivo לשעבר שכפול ממוסס γHV68. שימוש במבחנים בביולוגיה מולקולרי וVirological, אנו יכולים להצביע על המנגנון המולקולרי של אינטראקציות מארח וירוס ולזהות מארח וגנים נגיפיים חיוני לשכפול ממוסס נגיפי. לבסוף, מערכת מלאכותית כרומוזום חיידקים (BAC) מאפשרת הכנסת מוטציות לגורם ויראלי (הים) שדווקא להפריע אינטראקצית מארח הווירוס. רקומביננטי γHV68 נושא מוטציות אלו יכולים לשמש כדי לסכם את פנוטיפים של שכפול ממוסס γHV68 בMEFs הלקויים במארח מקש איתות רכיבים.פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה מצוינת לחקור את אינטראקצית מארח הפתוגן ברמות שונות של התערבות בvivo ו vivo לשעבר. לאחרונה, גילינו שγHV68 usurps מסלול איתות חיסון מולד לקדם שכפול נגיפי ממוסס 5. באופן ספציפי, דה נובו זיהום γHV68 מפעיל IKKβ קינאז החיסוני וIKKβ הופעל phosphorylates הגורם הראשי הנגיפי שעתוק, השכפול וtransactivator (RTA), כדי לקדם את הפעלת שעתוק נגיפית. בתוך כך, ביעילות γHV68 זוגות הפעלת שעתוקה לארח הפעלת חיסון מולדת, ובכך להקל על שעתוק נגיפי ושכפול מוסס. מחקר זה מספק דוגמה מצוינת שיכול להיות מיושמת על וירוסים אחרים לחקור את אינטראקצית מארח וירוס.

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus at JoVE.com

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K Views.  UT Southwestern Medical Center. אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחי?...

Video: Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.