Die Autoren bedanken sich bei Dr. James (Zhijian) danke Chen (UT Southwestern, Molecular Biology) für die Bereitstellung von wesentlichen Reagenzien, einschließlich der Mavs - / - Mäuse und Dr. Ren Sun (University of California-Los Angeles, Pharmakologie und Molekulare Medizin ) zur Bereitstellung des bakteriellen künstlichen Chromosom γHV68 für diese Studie.

Ein. Maus Infektion mit γHV68 <ol><li> Sechs bis acht Wochen alte, Geschlecht abgestimmt Wurfgeschwister Mäusen (8 bis 12 Mäuse / Gruppe) sind für die virale Infektion verwendet. Lassen Mäusen zu akklimatisieren über vier volle Tage (96 Stunden) nach der Auslieferung. </li><li> Protocol Schritte mit Virus sollte in einem Schrank der Sicherheitsstufe 2 (BSL2) unter Verwendung von Standard BSL2 Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden. </li><li> Planen Virussuspension (40 bis 1 x 10 5 Plaque-bildenden Einheiten [PFU]) des γHV68 in 30 ul sterilem PBS pro Maus kurz vor dem Experiment. Halten Virussuspension auf Eis. </li><li> Bereiten Ketamin / Xylazin-Lösung (1,5 mg Ketamin und 0,15 mg xylazine/20 g Körpergewicht, 100 ul / Maus) für Maus Sedierung. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse, indem Sie einen Zeh Prise wurden sediert. </li><li> Sedate Mäuse mit 1,5 mg Ketamin und 0,15 mg Xylazin pro 20 mg Körpergewicht (100 ul / Maus) durch intraperitoneale Injektion. </li><li> Deliver Virussuspension (30 ul / Maus) intranasal in einer tropfenweiseMode, um ein Nasenloch der sedierten Mäusen. </li><li> Lay Mäusen auf einer Seite für 5 - 10 min, um die Atemwege Lieferung des Virus in die Lunge zu erleichtern. </li><li> Ort Mäusen zurück in den Käfig und Monitor Mäusen, bis sie vollständig von Sedierung erholt haben. </li><li> An verschiedenen Tagen nach der Infektion, opfern Mäuse durch CO 2 Ersticken und Ernte der Lunge nachdem sie sich vergewissert Tod / Verlust der tiefen Bewusstsein. Ort Lunge in sterile 1,5 ml mit Schraubverschluss Röhrchen mit 500 ul von 1,0 mm Zirkonia / Silica Kügelchen. Halten Röhrchen auf Eis. Proben bei -80 ° C, wenn nicht fortfahren mit dem nächsten Schritt am selben Tag. Die Milz oder Lebergewebe könnte zu diesem Zeitpunkt für die Analyse viraler Latenz abhängig Zeitrahmen von Experiment gesammelt werden. </li><li> 1 ml kaltem serumfreiem DMEM in das Rohr und Homogenisierung der Lungen durch wulstförmige Schlagen 30 Sekunden. Chill Röhrchen auf Eis für mindestens 1 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. </li><li> Zentrifuge Lunge Lysaten bei 16.000 xg bei 4 ° C für 1 min und verwenden supernatant auf virale Titer durch einen Plaque-Assay mit einem NIH3T3 oder BHK21 Monoschicht (siehe Abschnitt 5 für weitere Details) zu bestimmen. </li></ol> 2. Bestimmen γHV68 mehrstufigen Wachstumskinetik in embryonale Maus-Fibroblasten <ol><li> Wachsen wild-type embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) und diese mangelhaft in einem Host Gen sub-konfluenten (ca. 80%) Dichte vor dem Plattieren Zellen. </li><li> Split MEFs in 24-Well-Platte bei 10.000 Zellen / Vertiefung für einen niedrigen multipilicity-of-Infektion (MOI) am Tag vor der Infektion. Experimente werden normalerweise in Triplikaten und bei einer MOI von 0,001 durchgeführt - 0,05 wird üblicherweise verwendet. </li><li> Planen γHV68 enthaltende Suspension gewünschte Menge an Virus (0,5 ml pro Vertiefung). </li><li> Entfernen mittleren und decken MEFs mit 0,5 ml γHV68 Suspension pro gut. </li><li> Inkubieren Sie die Platte in Gewebekultur-Inkubator, rock alle 30 min, und ermöglichen Inkubation für 2 h fort. </li><li> Entfernen Virussuspension und decken Zellen mit 0,5 ml frische complete DMEM Medium mit 8% fötalem Rinderserum. </li><li> An verschiedenen Tagen nach der Infektion, ernten das Medium und Zellen in sterile 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Unmittelbar einzufrieren Röhrchen bei -80 ° C. </li><li> Release γHV68 von MEFs durch Einfrieren bei -80 ° C, Auftauen in 37 ° C Wasserbad und Vortexen. Drei Zyklen von Einfrieren und Auftauen wird üblicherweise auf die Proben aufgebracht. </li><li> Bestimmen Virustiter durch einen Plaque-Assay mit einem NIH3T3 oder BHK21 Monoschicht (siehe Kapitel 5 für Details). </li><li> Lesen virale Titer und Grundstück γHV68 mehrstufigen Wachstumskurve auf MEFs. </li></ol> 3. Molekulare Dissektion γHV68 lytische Replikation in embryonale Maus-Fibroblasten <ol><li> Führen Virusinfektion wie in den Schritten von 2,1 bis 2,6 des § 2 beschrieben. </li><li> An verschiedenen Tagen nach der Infektion, den Überstand verwerfen. Spülen Zellen mit kaltem PBS und trypsinieren Zellen. Pellet Zellen durch Zentrifugieren bei 1000 xg bei Raumtemperatur für 1 min. Überstand verwerfen undShop Zellen bei -80 ° C. </li><li> Auszug Gesamt-DNA (Host und virale Genom) und Gesamt-RNA nach zuvor publizierten Methoden 5,6. </li><li> Eine Echtzeit-PCR unter Verwendung von Gesamt-DNA und Primer, die spezifisch für Transkripte lytischen wie RTA (ORF 50), ORF 57 und ORF60. Bestimmung der relativen Menge an intrazellulären γHV68 Genom in Bezug auf ein Host-Haushaltsgen (zB β-Actin). </li><li> Um genomische DNA-Kontaminationen zu entfernen, ist die Behandlung mit RNase-freier DNase kritisch für cDNA-Präparation mit Gesamt-RNA und Oligo (dT) 11-19 Primer. Siehe 5 für weitere Einzelheiten über die RNA-Extraktion einschließlich der Behandlung mit RNase-freier DNase und RT-PCR verweisen. Eine Echtzeit-PCR unter Verwendung von cDNA und Primer, wie oben, um die relative Menge der viralen Transkripte in Bezug auf die der Host-Haushaltsgen zu bestimmen. </li></ol> 4. Erzeugung von rekombinanten γHV68 mit bacterial artificial chromosome Das Method hier beschriebenen wird verwendet, um Mutationen in einem γHV68 Gen, das in Wirt-Virus-Interaktion beteiligt ist einzuführen. <ol><li> Planen ein DNA-Fragment (etwa 1,5 kb) des Wildtyp-Sequenz oder eine Sequenz trägt gewünschten Mutationen in der zentralen Region durch PCR. </li><li> Planen bakterielles künstliches Chromosom (BAC), die ein Transposon-Insertion 7 enthält auf der ganzen Mutationsstelle, der spezifisch das Gen inaktiviert Gen von Interesse durch MIDI-Aufreinigung (OriGene). Shop BAC DNA bei 4 ° C (vermeiden Einfrieren / Auftauen von BAC DNA). </li><li> Transfizieren BAC-DNA und PCR-Produkt enthaltenden gewünschten Mutationen des Gens von Interesse in die Zellen (zB NIH3T3 oder BHK21), die hoch permissiv γHV68 lytischen Replikation sind, mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen). </li><li> Halten Aufspaltung Zellen bis cytopathischen Effekt (CPE) zeigt sich in der Monoschicht. Collect virushaltigen Überstand und, falls notwendig, zu amplifizieren Virus in NIH3T3 oder BHK21 Zellen. </li><li> Infect NIH3T3-Zellen mitrekombinantes Virus durch Zentrifugation bei 1800 UpM, 30 ° C für 30 min. </li><li> Ernte γHV68-infizierten NIH3T3-Zellen und bereiten zirkularisierten viralen Genoms mit Hirt-Protokoll 8,9. </li><li> Transformieren Electro-MAX DH10B kompetente Zellen (Invitrogen) durch Elektroporation und Bildschirm für Kolonien, die Resistenz gegen Chloramphenicol (Cm), aber empfindlich gegenüber Kanamycin (Kan) (Cm-resistenten Gen ist in BAC Rückgrat, während Kan-resistentes Gen ist Transposon sind Insertion). </li><li> Wachsen Cm R Kan S Kolonien in Medium mit chlorophenicol und bereiten BAC DNA mit Mini-oder Midi-scale Reinigung (OriGene). </li><li> Überprüfen der gewünschten Mutation in der Ziel-Gen durch PCR unter Verwendung von Primern die spezifisch für flankierenden Regionen der Mutationsstelle und Sequenzierung. </li><li> Bestätigen keine Chromosom Umlagerung in BAC durch Verdau mit ausgewählten Restriktionsenzymen und Puls-Feld-Gelelektrophorese. </li><li> Transfizieren rekombinanten BAC in NIH 3T3 oder BHK21 Zellen mit Lipofectamin2000 (Invitrogen) zur Herstellung von rekombinantem γHV68. </li><li> Halten Passagierung Zellen bis CPE zeigt sich in der Monoschicht. Collect virushaltigen Überstands und verstärken rekombinantes γHV68 in NIH3T3 oder BHK21 Zellen. </li><li> Bestimmen Titer des rekombinanten Virus und charakterisieren das virale Wachstum Eigenschaften ex vivo und in vivo wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. </li></ol> 5. Bestimmen Virustiter durch einen Plaque-Assay <ol><li> Wachsen NIH3T3 Zellen sub-konfluenten (ca. 80%) Dichte vor dem Plattieren Zellen. </li><li> NIH3T3 aufgeteilt in 24-Well-Platte mit 20.000 Zellen / Vertiefung am Tag vor der Infektion. </li><li> Planen 10-fach seriell verdünnten Virus-Überstände mit DMEM-Medium mit 8% Neugeborenen-Kalbsserum (NCS). </li><li> Entfernen mittleren und decken NIH3T3-Zellen mit 0,5 ml γHV68 Suspension. </li><li> Inkubieren Sie die Platte in Gewebekultur-Inkubator, rocken alle 30 min, und ermöglichen Inkubationszeit, um fortzufahrenfür 2 Stunden. </li><li> Entfernen Virussuspension und Deckel Zellen mit 0,5 ml DMEM-Medium mit 2% NCS und 0,75% Methylcellulose (Sigma). </li><li> Inkubieren Sie die Platte in Gewebekultur-Inkubator. Graf Plaques am Tag 6 nach der Infektion. Die Färbung der Monoschicht, mit Kristallviolett zB fördern kann Plaque Zählen. </li><li> Berechnen den Virustiter in den unverdünnten Gewebelysaten oder Zelllysaten unter Verwendung der folgenden Formel: Titer (PFU / ml) = D x N x 1000 ul / ml ÷ V ul. N die mittlere Anzahl von Plaque an einer geeigneten Verdünnung; D, Verdünnung fach (zB 5, 10, 100 .....) V (pl), Volumen von seriell verdünnten Überstand gegeben pro Napf. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: - / - Maus 10, γHV68 lytische Replikation Phänotypen in embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) und recombin Drei repräsentative Zahlen sind hier, einschließlich γHV68 lytische Replikation in der Lunge von Wildtyp-und Mavs angezeigtant γHV68 mit Mutationen in den Phosphorylierungsstellen, moduliert durch die MAVS-abhängige IKK sind. Diese drei übereinstimmende Experimenten ein System dar, um die Rollen des angeborenen Immunsystems Komponenten in γHV68 lytische Replikation in vivo und ex vivo zu definieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" /> Abbildung 1 γHV68 Lasten in den Lungen von Mavs + / + und Mavs -. / - Mäusen. A) Zwei wesentliche angeborenen Signalwege hinter MAVS. Die MAVS Adaptormolekül Relais Signalisierung von cytosolischen RIG-I-ähnliche Rezeptoren an NFkB und Interferon regulatorischer Faktoren (IRF), die ihrerseits bis zu regulieren die Genexpression von entzündungsfördernden Zytokinen und Interferonen aktivieren. B) Mavs + / + und Mavs - / - Mäuse wurden mit 40 PFU γHV68 intranasal und Viruslast in der Lunge zum angegebenen Zeitpunkten infiziert wurden abzuschrecken<html> abgebaut durch einen Plaque-Assay mit NIH3T3 Monoschicht. Jedes Symbol stellt eine Maus. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" /> Abbildung 2. ΓHV68 lytische Replikationskinetik in embryonale Maus-Fibroblasten (MEF). Die lytische Replikation γHV68 auf Mavs + / + und Mavs - / - MEFs wurde durch mehrstufige Wachstumskurven (A) und quantitative real-time PCR (B) beurteilt. Bei beiden Versuchen wurden gleiche Anzahl von MEF und Menge γHV68 für Virusinfektion bei einer Multiplizität-of-Infektion (MOI) von 0,01 verwendet. (A) Zellen und Überstände wurden bei angegebenen Zeitpunkten geerntet und unterliegen einem Plaque-Assay auf virale Titer zu bestimmen. (B) Gesamt-RNA aus γHV68-infizierten MEFs extrahiert und analysiert mittels quantitativer real-time PCR mit spezifischen Primern für ausgewählte lytische Transkripte (RTA, ORF 57, und ORF60). ig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Die lytische Replikationskinetik von rekombinanten γHV68 mit Mutationen innerhalb der RTA Transaktivierungsdomäne, die Phosphorylierung durch IKKγ abzuschaffen. (A) Mehrstufengetriebe Wachstumskurven von rekombinanten Wildtyp-Virus (γHV68.wt) und mutierte Virus (γHV68.mut) in Mavs + / + und Mavs - / - MEF-Zellen (MOI = 0,01). MEFs wurden mit γHV68 bei einer MOI von 0,01 infiziert. Zellen und Überstände wurden bei angegebenen Zeitpunkten geerntet und virale Titer wurden durch einen Plaque-Assay mit NIH 3T3 Monoschicht bestimmt. (B) γHV68 RTA mRNA-Ebene in γHV68-infizierten NIH3T3-Zellen (MOI = 0,01). Bei 30 h nach Infektion wurde Gesamt-RNA aus γHV68-infizierten NIH 3T3-Zellen extrahiert und analysiert mittels quantitativer real-time PCR.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In Reaktion auf virale Infektion werden die MAVS-abhängigen Signalwege angeborene Immunsystem aktiviert, um die Herstellung von antiviralen inflammatorischen Zytokinen 10-14 fördern. Mit murine γHV68 als Modell Virus für Menschen onkogenen Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus und Epstein-Barr-Virus 3,4 entdeckten wir, dass γHV68 usurpiert die Mavs-IKK Weg zur lytischen Replikation über Transkriptionsaktivierung 5 zu fördern. Verwendung genetisch veränderter MEFs und Techniken i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> Electro-MAX DH10B kompetente Zellen </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> PowerPrep HP Plasmid Miniprep-System </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> PowerPrep HP Plasmid Midiprep-System </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

In Reaktion auf virale Infektion, entwickelt eine Vielzahl verschiedener Abwehrreaktionen, wie die Aktivierung angeborenen Immunsystems Signalwege, die die antivirale Zytokin-Produktion 1,2 führen. Um den Host besiedeln, sind Viren obligat zu Host Reaktionen antiviralen entziehen und zu manipulieren Signalwege. Die Aufklärung der Wirt-Virus-Interaktion wird Licht auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien gegen virale Infektionen zu vergießen. Murine γHV68 ist eng mit menschlichen onkogenen Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus und Epsten-Barr-Virus 3,4 verwandt. γHV68 Infektion in Mäusen eine tractable kleinen Tiermodell, um den gesamten Verlauf der Host Reaktionen und viralen Infektion in vivo, die nicht verfügbar sind für den menschlichen Herpesviren untersuchen. In diesem Protokoll, präsentieren wir ein Panel von Methoden zur phänotypischen Charakterisierung und molekulare Zerlegung des Host-Signalisierungs-Komponenten in γHV68 lytische replication in vivo und ex vivo. Die Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mausstämmen erlaubt die Abfrage der Rollen von Host Signalwege während γHV68 akute Infektion in vivo. Darüber hinaus können embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) aus diesen defizienten Mäusen isolierten Stämme zur weiteren sezieren Rolle dieser Moleküle während γHV68 lytische Replikation ex vivo werden. Mit virologische und molekularbiologische Tests, können wir ermitteln den molekularen Mechanismus der Wirt-Virus-Interaktionen und identifizieren Host und viralen Gene essentiell für lytischen Replikation. Schließlich erleichtert ein bakterielles künstliches Chromosom (BAC)-System die Einführung von Mutationen in den viralen Faktor (en), die spezifisch unterbrechen die Wirt-Virus-Interaktion. Rekombinante γHV68 Durchführung dieser Mutationen können die Phänotypen der γHV68 lytische Replikation in MEFs Mangel an wichtigen Host Signalkomponenten rekapitulieren werden.Dieses Protokoll bietet eine exzellente Strategie, um Wirt-Pathogen-Interaktion auf mehreren Ebenen der Intervention in vivo und ex vivo zu verhören. Kürzlich haben wir entdeckt, dass γHV68 usurpiert eine angeborene Immunsystem Signalweg zur lytischen Replikation 5 zu fördern. Insbesondere aktiviert γHV68 de novo Infektion das Immunsystem Kinase IKK und aktiviert IKK phosphoryliert den Master viralen Transkriptionsfaktor, Replikation und Transaktivator (RTA), um virale Transkriptionsaktivierung zu fördern. Dabei γHV68 effizient Paare ihre Transkriptionsaktivierung zu angeborenen Immunaktivierung hosten, wodurch Transkription und viralen lytische Replikationsursprung. Diese Studie liefert ein hervorragendes Beispiel, die andere Viren angewendet werden kann, um Wirt-Virus-Interaktion zu verhören.

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Aufrufe.  UT Southwestern Medical Center. Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Serie: Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

Ein

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten