מחקר זה מומן על ידי משרד המדע (BER), משרד האנרגיה של ארה&quot;ב, שיתופית הסכם לא. De-FC02-02ER63453, רצף הגנום מיקרוביאלית הקרן הלאומית למדע של התוכנית (מספרים הפרס 0626826 ו 0731916). אנו מודים ג&#39;ון זכוכית עבור המומחיות הטכנית שלו עצות ק &#39;אריק Wommack עזרתו עם אוסף מדגם הסביבה.

1. ההכנה של פתרונות לפני ביצוע כרומטוגרפיה hydroxyapatite, מאגרים פוספט חייב להיות מוכן hydroxyapatite חייב להיות hydrated כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון פוספט 1M, pH 6.8: בבקבוק 1 ליטר לפזר 119.98g של פוספט נתרן monobasic ב 1 ליטר של סטרילית, DEPC שטופלו H 2 O. הכן נתרן זרחתי 1M פתרון dibasic בבקבוק 1 ליטר ידי המסת 141.96g של פוספט נתרן dibasic ב 1 ליטר של סטרילית, DEPC שטופלו H 2 O. מערבבים את מונו ו-di פתרונות ביחס של 1:01. מניחים בקבוק על צלחת לבחוש ולערבב בעזרת מוט מגנטי ומערבבים. התאם ל-pH 6.8 ידי הוספת סודיום הידרוקסיד (כדי להגדיל את ה-pH) או חומצה זרחתית (ירידה pH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר פוספט 0.12M: בבקבוק 500ml, לשלב 30 מ&quot;ל הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ&quot;ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H2O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H2O ל 250 מ&quot;ל. החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר פוספט 0.18M: בבקבוק 500ml, 45ml לשלב הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ&quot;ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ&quot;ל. החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר פוספט 0.20M: בבקבוק 500ml, לשלב 50 מ&quot;ל הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ&quot;ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ&quot;ל. החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.40 מאגר M פוספט: בבקבוק 500ml, 100ml לשלב הפתרון פוספט 1M, pH 6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ&quot;ל של EDTA 0.5m. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ&quot;ל. החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;1.00M פוספט הצפת&quot; (ריכוז בפועל של פוספט בפתרון זה היא 0.91 מ &#39;): בבקבוק 500ml, לשלב 30 מ&quot;ל הפתרון פוספט 1M, pH6.8, 2.5ml של 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ו - 5 מ&quot;ל של 0.5m EDTA. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H2O לנפח של 225ml. התאם ל-pH 6.8. הוסף סטרילי, DEPC שטופלו H 2 O ל 250 מ&quot;ל. החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידרציה hydroxyapatite: משקל החוצה 1g של hydroxyapatite ולהוסיף שפופרת 50 מ&quot;ל. הוסף 6ml של חיץ פוספט 0.12M כדי hydroxyapatite לבין להפוך לערבב. לפני השימוש להביא טמפרטורה עד 60 ° צלזיוס ומערבבים היטב. חנות לפרקי זמן 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לאזן את כל מאגרי פוספט hydroxyapatite hydrated על 60 ° C. </li></ol> 2. הכנת Econo-טור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור שסתום. יש לשטוף מספר פעמים בטור עם deionized H 2 O לפי העמודה היפוך שוב ושוב decanting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שסתום מהעמודה-Econo ו החיטוי העמודה לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ולסגור שסתום. הוסף 1ml של Sigmacote על סטריליות Econo טור ומעיל כל משטחי זכוכית. פתח את שסתום ו למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף עמודה אמבט מים במחזור ולהגדיר הטמפרטורה ל 60 ° C. כדי einsure את הכמות המינימלית של אובדן החום על פני העמודה גלישת עמודה סוכן בידוד כגון נייר אלומיניום או צינור קצף בידוד מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את Econo טור פעמיים עם סטרילי, נטול RNase H 2 O ואז פעמיים עם הצפת סטרילי RNase חינם, פוספט 0.12M. </li></ol> 3. Hydroxypaptite Chromotography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וודא שסתום סגור, לאט להוסיף 2ml של hydroxyapatite, מוכנה מראש resuspended לתחתית עמודה Econo בעזרת פיפטה סטרילית סרולוגיות 2ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר hydroxyapatite להתיישב תחת כוח הכבידה במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים חיץ מן העמודה שסתום קרוב. שילוב חומצות גרעין עם חיץ פוספט 0.12M בנפח סופי של μl 500 ו דגירה ב 60 ° C במשך 10 דקות בתוך גוש חום או אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיל במהירות חומצות גרעין מוכן במאגר פוספט 0.12M כדי hydroxyapatite בעזרת פיפטה סרולוגיות 2ml לוודא שלא להפריע את הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חומצות גרעין להיקשר hydroxyapatite במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינורית 15 מ&quot;ל תחת העמודה, פתח את שסתום ולאסוף את המדגם הראשוני המכיל ssDNA. סגור שסתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6ml של חיץ פוספט 0.12M hydroxyapatite כדי לוודא שלא להפריע את הטור, פתח את שסתום, ולאסוף גדילי דנ&quot;א יחיד בצינור 15ml מהשלב הקודם. סגור שסתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25:25:1 v / v / v) פתרון הצינור, לערבב במרץ צנטריפוגות XG ב 3500 במשך 15 דקות. העברת ssDNA המכיל supernatant לצינור 15 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 3.76 ו 3.87 באמצעות 6ml של חיץ פוספט 0.20M דוארקתרוס ו-RNA לטהר מהעמודה לוודא להשתמש בצינור 15 מ&quot;ל חדש לאיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 3.76 ו 3.87 באמצעות 6ml של חיץ פוספט 0.40M כדי elute ולטהר dsDNA מהעמודה לוודא להשתמש שפופרת 15 מ&quot;ל חדש לאיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 3.76 ו 3.87 באמצעות 6ml של חיץ פוספט 1.00M להפשיט את הטור של dsDNA כל שיורית לוודא להשתמש שפופרת 15 מ&quot;ל חדש לאיסוף. </li></ol> 4. Desalting דוגמאות חומצות גרעין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 4-5 מ&quot;ל של מדגם Amicon Ultra-4 מכשיר מסנן צנטריפוגלי לבוש עם משקל מולקולרי 30,000 לנתק קרום Ultracel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז מדגם &lt;500μl ידי ספינינג ב 6000 XG, 30 ° C, 5 דקות (או עד נפח מרוכז מושגת) בתוך הרוטור בזווית קבועה. בטל לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את שאר המדגם (ים) את המכשיר Ultra-4 Amicon מסנן צנטריפוגלי ולהביא את נפח של עד 5 מ&quot;ל-4 עם הצפת Rnase חינם TE 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז מדגם &lt;500μl ידי ספינינג ב 6000 XG, 30 ° C, 5 דקות (או עד נפח מרוכז מושגת) בתוך הרוטור בזווית קבועה. בטל לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4-5 מ&quot;ל של הצפת Rnase חינם TE 1X אל המכשיר Ultra-4 Amicon מסנן צנטריפוגלי. תתרכז מדגם &lt;500μl ידי centrifuging XG ב 6000, 30 ° C, 5 דקות (או עד נפח מרוכז מושגת) בתוך הרוטור בזווית קבועה. בטל לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.5 תוספת 5 פעמים לחלוטין desalt מדגם חומצות גרעין (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת הנותרים (ים) צינור סטרילי Eppendorf 1.7ml. הוסף 1/10th נפח 3M נתרן אצטט, pH 7.0, שני כרכים של 100% אתנול, ו 1μl של Glycoblue. מערבבים היטב על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 28,000 XG, 4 ° C, 60 דקות. למזוג לוודא לא להפריע גלולה. הוסף 300μl של אתנול 70%. ספין על 28,000 טמפרטורה, XG החדר למשך 10 דקות. למזוג, יבש resuspend כל שבריר בנפח מתאים של חיץ TE Rnase חינם. </li></ol> 5. נציג תוצאות: איור 1 מסכם את השיטות שהוצגו באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite כדי ssDNA fractionate, dsDNA וחומצות גרעין RNA מתוך מכלול ויראלי מעורבת. שיטה זו מנצלת את האינטראקציה בין עמוד השדרה תשלום פוספטים טעונים שלילית של חומצות גרעין ו Ca מטען חיובי 2 + יונים נוכח hydroxyapatite ומאפשר חלוקה יעילה של תת חומצות גרעין (ssDNA, dsDNA ו-RNA) עם ריכוזים חיץ הגדלת פוספט 12. חלוקה של hydroxyapatite ב &quot;קהילה&quot; מבחנה של ssDNA ידוע (M13mp18), dsDNA (למבדה) ו-RNA (MS2 ו phi6) הגנום הנגיפי מתוארת באיור 2. חומצות גרעין אוחדו בריכוזים שווים, להחיל את הטור hydroxyapatite והיו eluted באמצעות ריכוז גדל והולך של חיץ פוספט. כל תת סוג חומצות גרעין elutes עצמאית של אחרים עם פחות מ -9% לשאת מעל מ - חלק אחד למשנהו. היישום של טכניקה זו על חומצות גרעין מבודדות מהקהילה ויראלי שנאספו במפרץ צ&#39;ספיק מוצג באיור 3. התשואה הכוללת חומצות גרעין מבודד מפני וירוסים מטוהרים היה מוחל על הטור hydroxyapatite. חומר המורכב ssDNA הגנום, RNA dsDNA היה eluted עצמאי עם 0.12M, 0.20M ריכוזי 0.40M/1.00M של חיץ פוספט בהתאמה. פעמיים גדילי הדנ&quot;א הוא eluted בריכוזים פוספט של 0.40M 1.00M ו - ובמקרה זה, זה שולט הקהילה ויראלי לעומת גנוטיפים ssDNA ו-RNA. תצפית זו עקבית עם הרכב הקהילה מצפה ויראלי של ימית סביבות estuarine שבה רוב של חומצות גרעין ההשבה הם dsDNA 13. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. תרשים זרימה תרשים של השיטה כרומטוגרפיה hydroxyapatite עבור חלוקה של חומצות גרעין. תערובת של ssDNA, dsDNA ו-RNA מוכן במאגר פוספט 0.12M מחומם ל 60 ° C ו להחיל עמודה hydroxyapatite שמרו על 60 מעלות צלזיוס קבוע באמצעות אמבט מים במחזור. חומצות גרעין (ssDNA, RNA dsDNA) הם eluted מ hydroxyapatite עם ריכוז גדל והולך של חיץ פוספט המכיל. נתון זה שוחזר באישור האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה היה מובלט במקור אנדרוז-Pfannkoch et al. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הפרדת ידוע חומצות גרעין ויראלית באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite. ריכוזים שווים של M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA ו למבדה dsDNA (2-5 נתיבים, בהתאמה) אוחדו (מסלול 6) ויישומי לעמודה hydroxyapatite. Singlדואר גדילי דנ&quot;א (M13mp18), רנ&quot;א (MS2/phi6) ו dsDNA (למבדה) היו eluted עצמאי מהעמודה hydroxyapatite באמצעות 0.12M (מסלול 8), 0.18M (סמטה 9) ו 0.40M/1.00M (מסלול 10) . סולם 1kb (מסלולים 1, 7) שימש כדי לאשר בגדלים הגנום. נתון זה שוחזר באישור האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה היה מובלט במקור אנדרוז-Pfannkoch et al. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ההפרדה של חומצות גרעין ויראליות מבודד מהקהילה בתוך מפרץ צ&#39;ספיק. חומצות גרעין בודדו ויישומי לעמודה hydroxyapatite. ssDNA (נתיב 0.12M), רנ&quot;א (נתיב 0.20M) ו dsDNA (נתיבי 0.40M/1.0M) היו eluted באופן עצמאי באמצעות חיץ פוספט בריכוז של 0.12M, 0.20M ו 0.40M/1.00M, בהתאמה. ה-DNA היי המוניים סולם (נתיב L1) ו סולם 1kb (נתיב L2) שימשו חזותית לאשר משקל מולקולרי מסה המשוערים של חומצות גרעין. נתון זה שוחזר באישור האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה היה מובלט במקור אנדרוז-Pfannkoch et al. 2010 12.

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המתודולוגיה כרומטוגרפיה hydroxyapatite המוצג כאן הוא כלי יעיל ביותר וחזק עבור חלוקה של חומצות גרעין מ מכלולים ויראלי מעורבת, כאשר המטרה היא ללמוד את הרכב הכולל חומצות גרעין הקהילה. באופן כללי, ssDNA, RNA dsDNA יהיה elute מן הטור פו פוספט בריכוז חיץ גדול יותר כ ~ 0and 0.40M בהתאמה. עם ז?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> חומר שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Econo-טור </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm חבילת מזהה / 2 </td></tr><tr><td> Hydroxyapatite </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> ה-DNA כיתה ביו ג&#39;ל ג&#39;ל HTP, 100g/td&gt; </tr><tr><td> נתרן פוספט, Monobasic </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> מונוהידראט, קריסטל 500 גרם </td></tr><tr><td> נתרן פוספט, Dibasic </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> נטול מים, 500 גרם אבקת </td></tr><tr><td> DEPC שטופלו מים </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1 ליטר </td></tr><tr><td> 10% SDS פתרון </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> Ultrapure, 1 ליטר </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8.0, 1 ליטר </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml סרולוגיות pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> פוליסטירן, סטרילי </td></tr><tr><td> BD פלקון Tubes צנטריפוגה </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15 מ&quot;ל, סטרילי </td></tr><tr><td> פנול: כלורופורם: אלכוהול Isoamyl (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> Ultrapure, 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 צנטריפוגלי התקן </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30 קרום </td></tr><tr><td> 20X TE חוצץ, Rnase חינם </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

וירוסים, במיוחד bacteriophages (phages), הם גורמים ביולוגיים רבים ביותר על כדור הארץ 1,2. וירוסים לווסת את התא המארח השפע והמגוון, לתרום אופניים של חומרים מזינים, לשנות את פנוטיפ התא המארח, וכן להשפיע על האבולוציה של התא המארח הן וקהילות ויראלי באמצעות העברה רוחבית של גנים 3. מחקרים רבים הדגישו את המגוון הגנטי העצום של וירוסים הפוטנציאל הפונקציונלי שלהם במגוון רחב של סביבות טבעיות. טכניקות Metagenomic שימשו ללמוד את המגוון הטקסונומי ואת הפוטנציאל התפקודי של מכלולים מורכבים ויראלי שחבריה כוללים גדילי דנ&quot;א יחיד (ssDNA), פעמיים תקועים DNA (dsDNA) ו-RNA גנוטיפים 4-9. נוכחי בנייה ספריה פרוטוקולים המשמשים במחקר ה-DNA או RNA המכיל סביבתיים המכילים וירוסים דורשים טיפול ראשוני nuclease כדי להסיר תבניות nontargeted 10. עם זאת, הבנה מקיפה של משלימים את הגן הקולקטיבי של הקהילה וירוס והגיוון וירוס דורשת ידע של כל החברים ללא קשר להרכב הגנום. חלוקה של מטוהרים תת חומצות גרעין מספקת מנגנון יעיל שבאמצעותו ללמוד מכלולים ויראלי מבלי להקריב קבוצת משנה של החתימה הגנטית של הקהילה. Hydroxyapatite, צורה גבישית של סידן פוספט, כבר מועסקים הפרדה של חומצות גרעין, כמו גם חלבונים חיידקים, מאז 1960 11. על ידי ניצול האינטראקציה בין תשלום Ca חיובי טעון 2 + יונים של hydroxyapatite ואת עמוד השדרה פוספטים טעונים שלילית של תת חומצות גרעין, אפשר מעדיפים elute כל תת חומצות גרעין עצמאי של האחרים. העסקנו לאחרונה באסטרטגיה זו כדי fractionate באופן עצמאי את הגנום של ssDNA, dsDNA ו-RNA המכילים וירוסים בהכנה של רצפי DNA 12. כאן, אנו מציגים שיטה חלוקה ועל התאוששות של חומצות ssDNA, dsDNA ו-RNA גרעין ויראלית של מכלולים ויראלי באמצעות מעורבות chromotography hydroxyapatite.

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

אנו מתארים שיטה יעילה כדי להפריד בין גדילי דנ&quot;א יחיד, כפול גדילי הדנ&quot;א ואת מולקולות רנ&quot;א נגיפי מקהילות הסביבה. חומצות גרעין הם מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite עם ריכוז גדל והולך של פוספט המכיל הפגושים. שיטה זו מאפשרת בידוד של כל סוגי חומצות גרעין של נגיפי דגימות סביבתיות.

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.4K Views.  The J. Craig Venter Institute. אנו מתארים שיטה יעילה כדי להפריד בין גדילי דנ"א יחיד, כפול גדילי הדנ"א ואת מולקולות רנ"א נגיפי מקהילות הסביבה. חומצות גרעין הם מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite עם ריכוז גדל והולך של פוספט המכיל הפגושים. שיטה זו מאפשרת בידוד של כל סוגי חומצות גרעין של נ?...

Video: Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.