המחברים הם חבים לראשים, מוכתרים והקהילות של Macha לunwaveing ​​לשתף הפעולה במהלך אוספים לדוגמא שדה יתושים. ד&quot;ר דאג נוריס ורבקה קנט הציע מומחיות רבה ערך על פרוטוקול ההמלחה החוצה. עבודה זו מומנה על ידי מערכת ג&#39;ונס הופקינס מלרית מכון מחקר פיילוט המענק. סטנדרטי הטפיל DNA מעבדת יתושים ונתרמו באדיבות על ידי MR4 סוג, אמריקאי ואוספת תרבות.

1. Dissection הכנת דגימות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתוש מקום על חיתוך קטן של parafilm והר על ביתור מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות בטיפת מי deionized לרכך רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך נבלת היתוש בדיוק במפרק בין בית החזה והבטן, ובכך סחבתי את הראש ובית החזה מסעיף הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל קטע יתושים גזורים לתוך צינור נקי autoclaved 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge prelabeled עם פרטי יתושי ת.ז וכראוי מסומן לציון סעיף גוף (לדוגמה: &quot;מ &#39;&quot; לקטע באמצע בטן; &quot;HT&quot; לראש ובית החזה בסעיף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך parafilm ולנגב במת מיקרוסקופ בזהירות עם 70% אלכוהול טבול Kimwipe לפני עיבוד היתוש הבא. </li></ol> 2. הפקת דנ&quot;א מדוגמאות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl פיפטה של ​​מים לתוך צינור deionized מדגם עצת פיפטה שימוש לטחון סעיף היתוש השקוע באו&quot;םהשעית iform. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של פתרון סאפונין 1% לhomogenate מדגם ותמהיל ידי vortexing הרגעי העדין autoclaved 1X PBS /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 20000 עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בμl 1X PBS 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שוב ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי vortexing העדין (5 שניות), resuspend גלולה במי deionized סטרילי μl 75 ו 25 μl של 20% השעית w / v Chelex-100 שרף במי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור פירס במכסה של צינור מדגם באמצעות מזרק 23 ז סטרילי flamed במבער בונזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית רתיחת מדגם באמבט מים במתקן צף (או בבלוק חימום) למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 20000, עבור פתרון ה-DNA העברה התפתח 1 דקות ולתוך בקבוקון האחסון prelabeled לשימוש כתבנית ביישומי PCR. </li></ol> 3. Plasmodium falciparum genotyping ואנופלסspp. זיהוי מולקולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl של תמצית ה-DNA Chelex ב25 תגובות PCR μl כדי לבדוק את איכות דנ&quot;א 11, לזהות מיני אנופלס 10 ולגנוטיפ פ falciparum 12 דלקות בלוטת אמצע בטן ורוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את תשואת amplicon, במיוחד לפ איתור falciparum, כולל 1.5x אלבומין בסרום שור (BSA) בבדיקת PCR. הרכב התגובה הבא מומלץ: (2.5 תבנית μl, 0.25 פריימרים מיקרומטר, מגנזיום כלוריד מיקרומטר 1.5, 200 dNTPs מיקרומטר, 1X PCR חיץ, 1.5x BSA וDNA פולימראז 1.0U Taq, ב 25 כרכי μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק לאיכות ה-DNA בתמצית, להגביר אזור דהידרוגנז פרוקי רגלי המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotide (NADH) מקטע 4 (ND4) גן (פריימרים ND4FW [5&#39;-GTD יאט tta TGA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] וND4RV [5&#39; CTT-CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]; מצפה מוצר 400bp) 11,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדל אנופלס גמביהדואר SL. מיני אחים (An. gambiae ss ו. arabiensis בלבד), להגביר אזור איגוף SNPs באזור spacer intergenic (IGS), (פריימרים האו&quot;ם [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;], GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;], AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]; מצפה 390bp המוצר gambiae ss, 315bp arabiensis) 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ההקלדה פ פולימורפיזמים סמי התנגדות antifolate falciparum, לבצע PCR המקונן כדי להגביר אזור איגוף קודונים חומצת אמינו 108, 51, 59, 16 ו 164 בטפיל dihydrofolate רדוקטאז (DHFR) גן: עגולי פריימרים עיקריים: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] וM5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] עגולים פריימרים שניים: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] עם F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] או F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] עם M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). גם להגביר אזור המכיל חומצת אמינו קודונים 436, 437, 540, 581 אnd 613 בפ synthetase גן falciparum dihydropteroate (DHPS): הסבב הראשוני פריימרים R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] עם R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; פריימרים עגולים משניים J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] עם K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;] או K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] עם K /, או L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] עם L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 amplicon μl הכפוף לdigestions אלל הספציפי הגבלה באנזים 30 תגובות μl בעקבות הוראות היצרן, כדי לזהות פולימורפיזמים סמים antifolate התנגדות הקשורים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 μl הנושא של ה-PCR amplicon (או 15 μl הגבלת התקציר) לכל נתיב של 2% ג&#39;ל ethidium רומיד המוכתם agarose לאלקטרופורזה (100 - 120V) ולדמיין להקות תחת קוף UV. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea:+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N'Zerekore.">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54 (2007).</li><li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulphadoxine/pyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon:+a+randomized+trial+to+guide+national+policy.">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31 (2008).</li><li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria.">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li><li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province,+Solomon+Islands:+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting.">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254 (2010).</li><li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission.">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410 (2009).</li><li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV,+TB,+and+malaria+programs:+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems,+clinical+research,+and+service+delivery.">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li><li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania:+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases.">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li><li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+research+agenda+for+malaria+eradication:+vector+control.">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401 (2011).</li><li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood.">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).</li><li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction.">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li><li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B.">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li><li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion.">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li><li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico.">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li><li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein.">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li><li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+(Diptera+Culicidae).">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li><li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes.">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li><li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells.">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li><li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR.">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה הפשוטה Chelex מוצגת כאן מאפשרת מיצוי של האיכות אנופלס spp ופ דנ&quot;א falciparum מדגימות המתאימים ליישומים מגוונים PCR יתושים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת לזיהוי מולקולרי של יתושי מלרית וקטור ומעקב של פ העמיד לתרופות אללים falciparum ביתושים לתוכניות בקרת מלריה לאומיות. יתרונותיה של הטכניקה הפשוטה Chelex כוללים פשטות, ריאגנטים פחות ולכן עלות, בטיחות וזמן עיבוד קצר יותר (37 דקות) מפרוטוקולים סטנדרטיים כגון (47 דקות 2 שעות וצעד לילה, טבלת 1) המלחה את השיטה 10. היתרונות הנ&quot;ל והדרישות מינימאליות מגיבות (3 ריאגנטים) בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הנוכחי (10 ריאגנטים, טבלת 1) 11,15, להפיק את פרוטוקול Chelex הפשוט ידידותי במיוחד למעבדות במדינה אנדמית בי מגיבה מתמדתשרשרת אספקה ​​היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה. מגבלה של השיטה היא שכמו הפרוטוקול הסטנדרטי, זה היה גם נושא למעכבי PCR הידועים להתרחש בintegument יתושי 16. עם זאת, זו היא קלה בקלות על ידי הוספה של BSA במבחנים. BSA גם הועסק בהצלחה כהגברה משפרת נגד מעכבים ביישומי PCR אחרים 17,18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Chelex-100, 50-100 רשת יבשה </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple chelex protocol for dna extraction from anopheles spp.

מדינות אנדמיות יותר ויותר לאמץ כלים מולקולריים להקלדה יעילה, זיהוי ומעקב נגד טפילי מלריה ויתושי וקטור, כחלק בלתי נפרד מתוכניות בקרת 1,2,3,4,5. להקמת בר קיימא של גישות המדויקות אלה בפעולות מחקר כדי לחזק את שליטת מלריה ומאמצי חיסול, שיטות פשוטות ובמחיר סבירים, עם ריאגנט החסכן ודרישות ציוד חיוני 6,7,8. כאן אנו מציגים טכניקה Chelex מבוססת פשוטה לחילוץ טפיל מלריה ודנ&quot;א מדגימות יתושי וקטור שדה שנאספו. אנו מורפולוגית זיהו 72 אנופלס gambiae sl. מ156 יתושים שנתפסו על ידי Pyrethrum התרסיס תופס בחדרי שינה נפרדת של משקי בית תוך 2 קרבה 2,000 ק&quot;מ של מכון המלריה בMacha. לאחר נתיחה כדי להפריד את הראש ובית החזה מהבטן לכל 72 אנופלס gambiae sl. יתושים, שני הסעיפים הונחו בנפרד ב1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל ושקוע ב20 μl מי deionized. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, כל מקטע יתוש homogenized בנפרד להשעיה אחידה במי deionized. של homogenate שהתפתח מכל קטע יתוש, 10 μl נשמר תוך 10 μl האחר הועברה לצינור מ&quot;ל נפרד autoclaved 1.5. את aliquots הנפרד נחשפו למיצוי DNA או על ידי Chelex הפשוט או סטנדרטי המלחה החוצה חילוץ פרוטוקול 9,10. פרוטוקול ההמלחה החוצה הוא מה שנקרא ושימוש נרחב משום שהיא מעסיקה ריכוז מלח גבוה במקום בממסים אורגניים מסוכנים (כגון פנול וכלורופורם) לצעד משקעי החלבון במהלך חילוץ דנ&quot;א 9. תמציות שמשו כתבניות להגברת PCR באמצעות פריימרים מיקוד dehydroge פרוקי הרגליים המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotidenase (NADH) 4 גן המקטע (ND4) כדי לבדוק את איכות דנ&quot;א 11, PCR לזיהוי מיני אחי gambiae אנופלס 10 ו PCR מקונן להקלדה של זיהום Plasmodium falciparum 12. PCR השוואה באמצעות איכות ה-DNA (ND4) הראתה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישה היחסית לפרוטוקול מבוסס המלחה החוצה Chelex. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. לא היו הבדלים משמעותיים בשיעור של דגימות נותנות אות amplicon עם Chelex או המלחה מתוך פרוטוקול קבוע בכל השלושה יישומי PCR. גישת Chelex נדרשה שלושה ריאגנטים פשוטים ו37 דקות כדי להשלים, תוך המלחה מתוך הפרוטוקול הכרוך 10 ריאגנטים שונים ו2 זמן העיבוד &quot;47 דקות hr ו, כולל צעד בן לילה. התוצאות שלנו מראות הבשיטת Chelex דומה לחילוץ הקיים המלחה החוצה וניתן להחליף כגישה פשוטה וברת קיימא בהגדרות משאבים מוגבלים שבי שרשרת אספקת מגיב קבועה היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה.

דוגמאות לתוצאות ממבחני PCR לאיכות תמצית ה-DNA יתוש (איור 1), זיהוי אנופלס arabiensis מולקולרי (איור 2) ופ falciparum זיהוי (איור 3) מראה ששיטת Chelex הפשוטה מניבה תוצאות דומות לרמת המלחה מתוך פרוטוקול 10, למרות צעדים הרבה פחות (טבלה 1). עם איכות DNA דומה בתמציות בהתאמה, אין זה מפתיע כי שיעורים חיוביים לדוגמה ביחס ל. מיני אחי gambiae כמו גם שיעורי זיהום טפיל לא היו סטטיסטי המבוסס על בדיקת צ&#39;י המרובעת של McNemar (איור 3) שונים. רגישות (%) חושבת כTP / (TP + FN) * 100, שם מציין TP החיוביים אמיתית וFN מציין שליליים כוזבת. סגולי (%) נקבע כTN / (TN + FP) * 100, שם מציין TN תשלילים אמיתיים וFP מציין תוצאות חיוביות שגויות. איכות ה-DNA (<html> ND4) PCR הראה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישת Chelex השוואה להמלחה הוקם מתוך פרוטוקול כתקן זהב. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. התוספת של BSA לתערובות תגובה הביאה לעלייה כללית של התוצאות חיוביות PCR (איור 3) בשל הקלה של ה-PCR מעכבי 14, לשניהם Chelex והסדיר פשט המלחה את הפרוטוקול. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטי, פרט לאיכות ה-DNA (ND4 PCR) על תמציות Chelex (p = 0.039). עיכול אנזים הגבלת אלל ספציפי בפ falciparum DHFR (או גן היעד אחר) amplicon מאפשר genotyping של זיהומי מלרית בלוטת אמצע בטן ורוק לאללים סמי התנגדות (איור 4; נתוני בלוטת רוק אינו מוצגים). <table bo</html style=";text-align:right;direction:rtl">rder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> תהליך פשוט Chelex </td><td colspan="2"> תקן המלחה את הנוהל </td></tr><tr><td> צעדים </td><td> ריאגנטים </td><td> צעדים </td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לצינור דגימה microfuge מ&quot;ל 1.5 והומוגני ב100 μl של פתרון Saponin% 1 (2 דקות) 1X PBS /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של 1X PBS ומערבב בעדינות על ידי vortexing רגע (3 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של 20% Chelex w / v במי deionized ומי deionized סטרילי μl 75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור פירס במכסה של צינור דגימה באמצעות מחט חמה, סטרילי 23 ז מזרק ותכולת שפופרת להרתיח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור microfuge בשעת 20000 XG לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לפתרון ה-DNA חנות בקבוקון prelabeled סטרילית וב -20 ° C עד לשימוש (2.5 μl בתגובת PCR 25 μl). </li></ol></td><td> PBS Saponin Chelex-100 חרוזים </td><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לצינור דגימה microfuge מ&quot;ל 1.5 והומוגני ב* חיץ נדר μl 100 עם DEPC% 1 (2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך השעות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תצטט 15 μl קר ז 8 אשלגן. מערבב בעדינות ולדגור על קרח למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מדגם בצינורות microfuge ב20000 XG למשך 10 דקות והעברה supernatant לצינור מ&quot;ל חדש 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של אתנול 100% ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מדגם בRT למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות ב20000 XG במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולהשליך supernatant, והשאיר את הכדור לייבוש מלא בצינור (30 מ &#39;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 20 μl של 0.1x SSC + RNAse (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מי 80 μl DEPC ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonate (DEPC) * נדר מאגר: 0.1 מ &#39;NaCl 0.2 סוכרוז M 0.1 מ &#39;טריס-HCL 0.05 M EDTA, pH 9.1 0.5% SDS במי DEPC תצטט ז 8 אשלגן אתנול נתרן ציטראט חיץ מלוח 0.1x (SSC) RNAse (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2"> זמן כולל: 37 דקות </td><td colspan="2"> זמן כולל: 2 47 דקות לשעה, בתוספת הלילה </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הצעד אחר צעד השוואה של ריאגנטים ודרישות זמן לפרוטוקול Chelex פשוט ולעמודארד המלחה את השיטה להפקת דנ&quot;א מדגימות יתושים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" /> איור 1. השוואת ND4 המיטוכונדריה PCR של DNA מאיכות הפשוטה Chelex &quot;C&quot; וסטנדרטי המלחה את התמציות &quot;M&quot; על דגימות שדה arabiensis אנופלס. NC שליטה, שלילית; M1 ו C1, C2 וM2, M3 ו-C3, ו M4 ו-C4 היא לזווג את ההמלחה ותמציות Chelex מאותה. דגימות יתושי arabiensis. L, סולם 100 נ&quot;ב ה-DNA. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" /> איור 2 המולקולרי זיהוי PCR לarabiensis אנופלס C1 ו M1, M2 וC2, C3 ו-M3, C4 ו M4 יסמנו amplicon המתאים מהמלחה החוצה &quot;ז&quot; ופשט תמציות Chelex &quot;C&quot; לאותן דגימות דנ&quot;א יתושים;.. AR, אנופלס arabiensisביקורת חיובית; הליטר, 100 נ&quot;ב סולם הדנ&quot;א. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" /> איור 3. איתור של תוצאות חיוביות על Chelex והמלחה החוצה תמציות DNA לדגימות שדה יתושים, עם מבחני PCR לזיהוי מולקולרי של אנופלס arabiensis (ע&quot;ר) 10, גן פרוקי רגלי NADH דהידרוגנז 4 (ND4) בדיקת איכות ה-DNA 11, ו-P עמידות לתרופה antifolate . falciparum DHFR 12 genotyping (F-M4). תוצאות מוצגות עבור מבחנים לרוץ עם או בלי BSA בתמהיל התגובה. מבחן צ&#39;י המרובע של McNemar שמש כדי לקבוע אם ההבדלים בין אחוזי PCRs החיובי מהדנ&quot;א שחולצו מן Chelex הפשוט והסטנדרטיים המלחה מתוך פרוטוקולים היו מובהקים סטטיסטי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" /> <strong&gt; איור 4. יישום פשוט Chelex הפרוטוקול בgenotyping פ זיהומי falciparum ביתושים (נתוני אמצע הבטן מוצגים) עבור אללים עמידות לתרופה. אני עיכול BstN על amplicon איגוף קודון 108 לפ גן falciparum DHFR 12 תערוכות מוטנטים S108T cycloguanil עמידים בדגימות יתושים (M1-M5; נתוני אמצע הבטן מוצגים). U, לא מעוכל 522 נ&quot;ב amplicon; FCR3, המעבדה הסטנדרטית פ שיבוט falciparum חיובי שליטה נושא S108T; K1, פ falciparum מעבדה סטנדרטית שליטה שלילית שיבוט נושאה S108N cycloguanil רגיש; הליטר, 100 נ&quot;ב סולם הדנ&quot;א.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp. at JoVE.com

פרוטוקול צ'לקס פשוט להפקת DNA מ-Anopheles spp. | אימונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי של<em&gt; אנופלס</em&gt; אח מינים באמצעות PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

a-simple-chelex-protocol-for-dna-extraction-from-anopheles-spp

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

54.8K Views.  Malaria Institute at Macha. דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי של אנופלס אח מינים באמצעות PCR.

Video: A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של

הפקת חלבון סה"כ ו2-D שיטות ג'ל אלקטרופורזה עבור

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות