אנו מודים בני הזוג. ג&#39;ון הנקוק, ריי גריל, אנדרו מוריס אולגה Chumakova על תמיכתם. מערכת 3 FlexStation הוא חלק מתקן הדמיה UTHSC Cytodynamic. אנו מודים גם בני הזוג. Ardem Patapoutian ומיכאל Bandell מן המחקר סקריפס מכון Genomics של מכון המחקר של נוברטיס קרן (GNF) למתן את הקו הסלולרי HEK293-hTRPA1 יציב. המחקר נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH (GM081658 כדי MXZ) וטקסס המרכז הרפואי העיכול מחלות מרכז (אל ה&quot;ה) ואת המשימה חבר / TIRR קרן (אל ה&quot;ה).

1. תא ההכנות 96-היטב צלחות עבור HEK293 תאים trasfected transiently עם TRPA1 האדם cDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEK293 התאים גדלים על 1-2 ימים בינונית Essential מינימלי של Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גלוקוז (Thermo Scientific, SH3002201), בתוספת חום מומת 10% בסרום שור העובר (Invitrogen, 16000-044), 50 יחידות / ml פניצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-163). ביום transfection, את צפיפות התאים צריך להגיע 70-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96-Coat גם צלחות ידי pipetting 50 μl poly-L-ornithine (סיגמה P3655, 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מים מזוקקים סטריליים) זה טוב דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. יש לשטוף היטב כל פעם עם פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) ללא Mg 2 + ו - Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). צלחת עשויה להשאיר את מכסה המנוע לתא תרבות למשך כמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם עבור כל צלחת 96-היטב, לדלל בצינור Eppendorf 1.5-ml 0.2 מיקרוגרם cDNA של 25 μl OPTI-ממ (Invitrogen, 31985-070). בהיקף של עד פרופורציונלי לפי מספר בארות להיות transfected ידי cDNA אותו. כמו כן לדלל ב Lipofectamine נפרד 1.5-מ&quot;ל צינור Eppendorf 0.4 μl 2000 (Invitrogen, 11668-019) ב 25 μl OPTI-ממ לכל טוב להיות transfected. סולם זה מעלה על פי המספר הכולל של הבארות להיות transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה המערבולת 2000 cDNA ו Lipofectamine בדילול ולתת להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך כ - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נפח שווה של Lipofectamine בדילול 2000 על צינור המכיל המערבולת בדילול cDNA, ולתת התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עד 2 שעות. במהלך הזמן הזה, להעביר את cDNA / Lipofectamine 2000 תערובת ב μl 49 / היטב צלחת פולי-L-ornithine המצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize HEK293 תאים (שלב 1.1), לספור צפיפות התאים באמצעות hemocytometer או דלפק הרוזנת תא אוטומטי (Invitrogen, C10227), ולהעביר כמות רצויה של תאים (בדרך כלל כ ~ 125,000-150,000 תאים / טוב) ל -15 מ&quot;ל סטרילי חרוטי התחתונה צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה ב RPM x 1000 עבור 5 דקות. תאים Resuspend ב ~ 1,250,00-1,500,000 תאים / מ&quot;ל ​​במדיום תרבות DMEM, בתוספת סרום חום מומת 10% שור עוברית, אך ללא אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 98 ההשעיה תא μl היטב כל המכיל את cDNA-Lipofectamine 2000 תערובת באמצעות pipetter רב או Dispenser microplate MicroFill (Bio-Tek). בואו הצלחת לשבת למכסה המנוע דקות לפחות 30 לפני הצבתו לתרבות humidified תא חממה. לדגור על 37 ° C CO, 5% 2 עבור 20-44 שעות. </li></ol> עבור HEK293 התאים ביציבות להביע TRPA1 <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר שלב 1.2-96-גם צלחות מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ועין מתנהלת בקו HEK293-hTRPA1 תא סופק בנדיבות על ידי ד&quot;ר א Patapoutian (מכון המחקר סקריפס) ומתוחזק במדיום זהה wild-type HEK293 תאים (שלב 1.1) אך בתוספת 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​blasticidin (Invitrogen, A1113902) ו - 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​hygromycin B (Invitrogen, 10,687,010). כאשר צפיפות התאים מגיע לכ -90%, trypsinize תאים, לספור צפיפות התאים, וכן את כמות הצנטריפוגות הרצוי של תאים ב 1000 x RPM עבור 5 דקות. תאים Resuspend בצפיפות של כ 1,000,000 תאים / מ&quot;ל ​​במדיום תרבות זהה בתוספת דוקסיציקלין (פישר, BP26535, 0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על השעיית תא פולי-L-ornithine צלחות מצופה ב 100 μl / גם באמצעות pipetter רב או MicroFill (Bio-Tek). בואו הצלחת לשבת למכסה המנוע דקות לפחות 30 לפני הצבתו לתרבות humidified תא חממה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 16-24 שעות. </li></ol> 2. פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנאגרו של האנק תמיסת מלח (HBSS) משמש כפתרון תאיים. הוא מכיל (מ&quot;מ): 137 NaCl, KCl 5.4, 0.25 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 MgCl 2, 10 גלוקוז, 10 HEPES, עם pH 7.4 המותאמת באמצעות 1N NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluo-4 חיץ assay מכיל 2 מ&quot;מ פרובנציד ב HBSS. הפוך את 250 המניות mM פרובנציד (Sigma, P8761) ב 0.5 N NaOH. מדולל ל HBSS ביחס של 1:125. להסתגל ל-pH 7.4 באמצעות 1 N HCl. </li></ol> 3. Cell-טעינה עם Fluo 04:00 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1 מ&quot;ג Fluo, 04:00 (Invitrogen, F14202) ב DMSO 912 anhydrous μl לעשות פתרון מניות של 1 מ&quot;מ. Fluo, 04:00 פתרון המניות יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C למשך חודש אחד לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 mM μl 1 Fluo-04:00 עם Pluronic 10 μl-F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) פתרון DMSO) ולאחר מכן להעביר את התוכן כולו חוצץ 5 מ&quot;ל-4 Fluo assay (שלב 2.2) בתוספת 0.1% אלבומין בסרום שור (Sigma, A9418). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שגודלו 96-היטב צלחות (שלב 1.7 או 1.10) עם HBSS ב 80 μl / גם 2 פעמים באמצעות מכונת microplate (כגון ELx405TM מ Bio-Tek). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את Fluo-4 AM טעינה פתרון (שלב 3.2) בשעה 50 μl / גם באמצעות pipetter רב או MicroFill (Bio-Tek) ו דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים 3 פעמים עם חיץ Fluo-4 assay (שלב 2.2). באמצעות מכונת microplate ELx405TM. לאחר לשטוף האחרון, להשאיר 80 ​​μl של למאגר Fluo-4 assay היטב כל אחד. </li></ol> 4. הכנת צלחת מתחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת העמסה 1 hr התא, להכין סדרה של דילולים 3x של אגוניסטים (או היריבים) של 3x הריכוזים הסופי הרצוי למאגר Fluo-4 assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 250-300 μl של פתרונות מתחם בדילול לצלחת תרכובת 96-היטב. סדר לקבל את דילולים סדרתי של המתחם לבין שולטת חיוביות ושליליות המקביל באותה עמודה הצלחת מתחם בכל פעם זה אפשרי כי FlexStation 3 קורא טור אחד בודד בכל פעם. </li></ol> 5. פלייט קריאה FlexStation 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המערכת (FlexStation 3, המחשב, ואת SoftMax Pro 5.2 תוכנה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הניסוי עם שם קובץ חדש. בשלב הגדרת, בחרו מצב FLEX והזן את הערכים הבאים: </li></ol> פרוטוקול מס &#39;1, השפעת אגוניסט <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="טבלה 1" /> פרוטוקול מס &#39;2, אפקט נוגד <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="טבלה 2" /><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום תיבת קצה חדש, צלחת המתחם את הצלחת לקרוא את המגשים המתאים FlexStation 3 ולחץ על &quot;לקרוא&quot; כפתור. FlexStation 3 יקראו עמודה אחת בכל פעם, להוסיף תרכובות בנקודות זמן מתוכנת מראש, בלי להפריע את הקריאה. זה לוקח בערך 3 דקות (5 דקות עבור פרוטוקול # 2) לסיים את הקריאה עמודה אחת והמכשיר ימשיך לקרוא את הטור הבא עם תוספות תרכובת ביצע מתוכנת על ידי המשתמש בשלב 5.2 עד שכל העמודות לקרוא. </li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני הניסוי עשוי להיות מעובד ישירות באמצעות SoftMax Pro 5.2 תוכנה או להעתיק ולהדביק לתוך כל תוכנית של גיליון אלקטרוני, כגון Microsoft Excel. ריכוז תגובה עקומה של חומצה TRPA1 אגוניסט flufenamic (FFA) נבנה באמצעות שגרת הבאים לפחות, ריבועים הולם. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> , שבו Y הוא ציין בתגובה, Y max היא התגובה מקסימלי מנורמל, C הוא ריכוז התרופה המתאים, EC 50 הוא הריכוז הזה עורר תגובה חצי מרבית, H ו n הוא מקדם היל לעין. ריכוז עיכוב עיקול על מתחם TRPA1 המשוערת אנטגוניסט מתקבל באמצעות ריכוז קבוע של פ&quot;א (100 מיקרומטר), בהדרגה להגדיל את הריכוז של א &#39;מתחם ערך 50 IC של המתחם מחושב על ידי לפחות, ריבועים הולם הבאה המשוואה. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> , שבו Y הוא תגובה נצפתה ו-Y מקסימום הוא מנורמל בתגובה שיא, [הנמלה] הוא מתחם המקביל ריכוז של, IC 50 הוא הריכוז אנטגוניסט שמייצר חצי מקסימלי עיכוב בתגובה-FFA עורר, ו n H הוא היל לכאורה מקדם. </li></ol> 7. נציג תוצאות: TRPA1 הוא Ca 2 +-חדיר ערוץ קטיון, הפעלת שמוביל זרם סידן כי ניתן לאתר על ידי Ca 2 + רגישים לצבוע, Fluo-4 (1-2). קו תא HEK293-hTRPA1 יציב שימש ללמוד את ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 אגוניסטים ואת היריבים. תאים עמוסות Fluo, 04:00, ממוקם 80 μl של למאגר assay, ולקרוא באמצעות FlexStation 3. לאחר ההקלטה פלואורסצנציה בסיסית עבור 30 שניות, 40 μl של דילול סדרתי של אגוניסט TRPA1, פ&quot;א, כל אחד 3x הריכוז הסופי הרצוי, נוספו התאים דרך pipetter מרובת ערוצים כלולים במסגרת של מודול fluidics של FlexStation 3. השינויים הקרינה היו במעקב במשך נוסף 180 s. השינויים Fluo-4 הקרינה היחסית של כל אחד גם באו לידי ביטוי כמו ΔF = (F - F 0), שבו 0 F ו-F הם ערכי הקרינה בזמן הריבית תחילת הקריאה, בהתאמה. עקבות נציג קורסים הזמן לשינויים הקרינה בתגובה בסדרה של ריכוזים פ&quot;א מוצגות באיור. 1. הערה עבור ארבעה ריכוזים האחרון פ&quot;א, למרות רמות תגובה מקסימלי דומים, קינטיקה ההפעלה בבירור מהר יותר גבוה יותר מאשר בכל הריכוזים נמוכים FFA. לכן, כדי להבדיל את ההבדלים האלה, ריכוז - יחסים התגובה נבנה על ידי מדידת שיעורי הראשונית (שיפוע) של להגדיל את הקרינה על תוספת של ריכוזים שונים של פ&quot;א (איור 2). אפקט מקסימלי halfריכוז ive (EC 50) של פ&quot;א נקבע להיות 55.4 מיקרומטר (n = 3). כדי לבדוק את היריב המשוערת TRPA1, תרכובת, ביצענו ניסוי דומה באמצעות פרוטוקול מס &#39;2 (שלב 2). במקרה זה, סדרה של דילולים של אנטגוניסט נוספו ב 30 שניות (40 μl של 3x ריכוזי הסופית הרצויה) ואת פ&quot;א נוספה מאוחר יותר של 180 (60 μl של 300 מיקרומטר ריכוז סופי של 100 מיקרומטר). מתחם במינון מופחת dependently את התגובה של התאים TRPA1 פ&quot;א עם ריכוז חצי מעכבות מקסימלי (IC 50) של 4.3 מיקרומטר (n = 3) (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. הריכוז תלויי הפעלת TRPA1 האדם על ידי פ&quot;א. עקבות הן להגדיל FFA-עוררו של הקרינה לאורך זמן (תגובות רק 60 הראשון של מוצגים בצורה טובה יותר להמחיש את קינטיקה מהירה של פ&quot;א, עורר תגובות). לידיעתך, בריכוזים גבוהים עורר פ&quot;א להגדיל פלואורסצנציה עם הרבה יותר מהר מאשר הקינטית בריכוזים נמוכים, למרות רמות הקרינה השיא היו דומות. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2 ריכוז -. קשרי בתגובה לשינוי FFA-Induced מתחם פלואורסצנציה ו-Induced עיכוב התגובה פ&quot;א ב TRPA1 האדם לידי ביטוי ביציבות ב HEK293 תאים. Δ, ריכוז - יחסים התגובה של פ&quot;א נקבע על ידי מדידת שיעורי הראשונית (מדרון) להגביר את הקרינה של נורמליזציה עם תוספת של ריכוזים שונים של פ&quot;א. הו, ריכוז התגובה היחסים של עיכוב בתגובה-FFA עורר סידן על ידי אנטגוניסט TRPA1 המשוערת, תרכובת A.

<ol>
	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons.">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li><li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females.">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li><li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2++-+and+membrane+potential-sensitive+dyes:+advantages+and+potential+problems.">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li><li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תאיים Ca 2 + משחק תפקידים חשובים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון שחרור הנוירוטרנסמיטר (3), פוטנציאל פעולה הלב (4), התכווצות תא שריר (5), האות תא התמרה (6-7), ואת מותם של תאים excitotoxic ( 8). מדידת תאיים Ca 2 + רמות מסייעת להבהיר שינויים פונקציונליים של Ca 2 +-חדיר</...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ובכן, Pipet FlexStation טיפים </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ובכן פלטות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-טוב נקה התחתונה צלחות שטוחות </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-ממ </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo, 04:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ornithine </td><td> סיגמא </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> פרובנציד </td><td> סיגמא </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

FlexStation Devices &quot;מולקולרית 3 הוא קורא benchtop מצב מרובה microplate מסוגל מדידת הקרינה אוטומטיות רב גם הצלחות. הוא אידיאלי עבור בינוני עד תפוקה גבוהה מסכי במסגרות אקדמיות. יש לו נוזל משולב העברת מודול מצויד pipetter מרובת ערוצים והמכשיר קורא עמודה אחת בכל פעם, כדי לעקוב אחר שינויים הקרינה של מגוון רחב של ריאגנטים ניאון. לדוגמה, FlexStation 3 נעשה שימוש כדי ללמוד את הפונקציה של Ca 2 +-חדיר תעלות יונים ו-G-חלבון קולטנים מצמידים על ידי מדידת שינויים תאיים חינם Ca 2 + רמות. חלוף פוטנציאל קולטן (TRP) הערוצים הם משפחה גדולה של ערוצים קטיון nonselective כי תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים pathophysiological רבים. רוב ערוצי TRP הם סידן חדיר ולגרום זרימת סידן על ההפעלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את היישום של FlexStation 3 ללמוד את פרופיל פרמקולוגי של ערוץ TRPA1, חיישן מולקולרית עבור גירויים רעילים רבים. HEK293 תאים transiently או ביציבות מביע האדם TRPA1 ערוצים, גדל צלחות 96-היטב, עמוסים Ca 2 + רגיש צבע פלואורסצנטי, Fluo-4, בזמן אמת שינויים הקרינה בתאים אלה נמדדים לפני ובמהלך יישום אגוניסט TRPA1 באמצעות מצב FLEX של FlexStation 3. ההשפעה של אנטגוניסט TRPA1 המשוערת נבדקה גם. הנתונים מועברים ישירות מתוך התוכנה SoftMax Pro לבנות ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 activators ומעכבי.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.0K Views.  The University of Texas Health Science Center at Houston. וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

Video: Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

דור של, Nanocomposites יחס Scalable מתכתי גבוהה היבט בביולוגי נוזלי בינוני

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...