פרוטוקול זה מאפשר לפיברובלסט לבנות ולארגן את הסביבה שלהם בתנאים מכניים מוגדרים. תוצאות אלה רקמות אניזוטרופיות עם נוקשות והרכבי מטריצה הדומים לסביבה הטבעית של התא. שיטה זו מאפשרת להשוות עד 48 תנאים במקביל.
הוא גמיש ביחס לסוג התא ותנאי התרבות המשמשים. באמצעות רק כמה רכיבים מוגדרים היטב, הוא ניתן לשחזור בין מעבדות. על ידי החלת גורמים פרו-פיברוטיים או תרופות אנטיפיברוטיות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את התהליכים הבסיסיים ואת הטיפולים של מחלות פיברוטיות מכל סוג שהוא.
מי שתדגים את ההליך תהיה אליסה דגריב, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו, ואני. ראשית, להפשיר את פיברובלסטים לב השתמרו הקפיאו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כשתי דקות עד שהבישונאי נשאר עם כמות קטנה של קרח בלבד. לאחר מכן, להעביר את השעיית התא dropwise באמצעות פיפטה סרולוגית שני מיליליטר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי מתאים המכיל 10 מיליליטר של מדיום צמיחה פיברובלסט.
לאחזור תאים אופטימלי, יש לשטוף את הקפו-ביון במיליליטר אחד של FGM ולהעביר אותו לצינור הצנטריפוגה. בעדינות respend התאים ולהעביר לתוך בקבוק תרבית התא. לחדש FGM כל יומיים במשך חמישה ימים או עד התאים הגיעו 80% conencency.
לאחר שאיפת המדיום מהתאים בתרבית, לשטוף תאים עם שישה מיליליטר של PBS ולשאף, ולאחר מכן להוסיף שישה מיליליטר של ריאגנט ניתוק התא לתאים ודגרה עד ניתוק התא גלוי. לנטרל פעילות אנזימטית על ידי הוספת שישה עד 12 מיליליטר של FGM לתאים שהושמטו בריאגנט שיוך התאים. פיפט בעדינות למעלה ולמטה ארבע עד שמונה פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר כדי להבטיח מתלה תא יחיד ולהעביר את התאים לתוך צינור איסוף 50 מיליליטר טרי.
אמת את התפוקה בעזרת מונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן והשלך את התאים. לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant, להעיף את הצינור כדי לנטרל את הכדור ו resuspend התאים FGM. לאחר מכן, מסננים את ההשעיה של התא באמצעות מסננת תאי רשת של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן באמצעות מונה תאים אוטומטי, מעריכים את מספר התא ואת הכדאיות על ידי אי-הכללה של זרם חשמלי כדי להבטיח מספרי תאים אמינים לפני שתמשיך עם רקמות חיבור מהונדסות או הכנת ECT.
כדי להתכונן ל- ECT, התאם את ההשעיה של התא ל-8.9 מיליון תאים למיליליטר ב-20 עד 25 מעלות צלזיוס על ידי הוספת FGM ושמירה על התאים על קרח. מעבירים את כל הצינורות האחרים המכילים את הרכיבים הבודדים של תערובת הידרוג'ל ECT על קרח ומצננים מראש צינור צנטריפוגה ריק של 50 מיליליטר כדי להכין את התערובת. התחל להכין את תערובת הידרוג'ל ECT על ידי הוספת רכיבים המתוארים בטקסט לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר צונן מראש הימנעות היווצרות בועת אוויר.
ראשית, פיפטה סוג קולגן מסיס בחומצה אני הידרוג'ל לתוך פיפטה סרולוגית עם קצה משעמם רחב. התאם את תכולת המלח של תמיסה קולגן על ידי הוספת DMEM תוך ערבוב עדין של הצינור לערבוב נכון. כדי לנטרל את ה- pH, הוסף 0.2 נתרן הידרוקסיד טוחן תוך ערבול הצינור ולאשר את הנטרול על ידי התבוננות בצבע האדום של המחוון האדום פנול.
לאחר מכן הוסף את השעיית התא טיפה תוך מערבולת בעדינות את הצינור. מערבבים את המתלים על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה רק פעם אחת באמצעות פיפטה סרולוגית עם קצה משעמם רחב כדי למנוע היווצרות בועה ולמזער את הלחץ הגיזה. מערבבים בעדינות את הצינור 10 פעמים לערבוב יסודי.
שמור את צינור הצנטריפוגה המכיל תערובת הידרוג'ל ECT על קרח לאורך כל תהליך הליהוק. הרטיבו טיפ פיפטה של מיליליטר אחד בתערובת הידרוג'ל ECT, ולאחר מכן הפיזרו 180 מיקרוליטרים של תערובת הידרוג'ל באופן שווה לכל תבנית של צלחת הליהוק 48-well הימנעות כוחות גיזה מופרזת שעלולים להשפיע על שלמות הרכבת מטריצת הקולגן ולהבטיח כי הצלחת כולה מסתיימת תוך 15 עד 20 דקות. ודא כי לולאה מלאה צורות בתוך התבנית כמו התפלגות רצינית של תערובת ECT ימנע היווצרות טבעת ECT מלאה.
הימנעו מלהיכנס לבאר הפנימית וליצור בועות במהלך ההצינורות כדי להבטיח יציקת הידרוג'ל ECT אחידה להיווצרות רקמות הומוגניות ופונקציונליות. מניחים בזהירות את צלחת הליהוק 48-well בתוך החממה תרבית התא כדי ליישב מחדש את תערובת הידרוג'ל ECT במשך 15 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, זה נראה כמו ג'ל ואטום.
הוסף 600 מיקרוליטרים של 37 מעלות צלזיוס חם FGM לבאר לאורך הקיר בעדינות כדי למנוע ניתוק ECT מלמטה. החלף את המדיום כל יום עם 500 microliters של FGM עד ניתוח. בנקודות הזמן הרצויות, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי להקליט תמונות מיקרוסקופיות של התצוגות העליונות והצדיות של ה- ECT.
השתמש בתוכנית לעיבוד תמונה כדי לבצע ניתוח סריקת שורות. הגדר קנה מידה והשתמש בכלי הקו הישר כדי לעקוב ולמדוד את קטרי ה- ECT במינימום שש עמדות לכל זרוע בכל מישור הדמיה. צלם את לוחית הליהוק בת 48 הטובות מתחת למכשיר הקלטה עם מצלמת סריקה אזורית משולבת הממוקמת במרחק קבוע המצויד בחיישן תמונה בשחור-לבן ברזולוציה גבוהה ובמקור אור כמעט UV.
בצע זיהוי אוטומטי של הטיפים של הקטבים המכילים צבע פלואורסצנטי למיקסום הניגודיות. מדוד את המרחק בין הקטבים מרשומות יומיות באמצעות ניתוח אוטומטי על-ידי הפעלת התמונות המוקלטות בתוכנה כדי לזהות פיקסלים בהירים בעלי ניגודיות גבוהה על רקע כהה או תוכנית לעיבוד תמונה. הסר את ECT מעמודי שמירה ולהוסיף וו העברה לולאת ECT.
לאחר מכן להעביר את ECT על שני ווים מהודקים לזרוע הנייחת וזרוע המתמר של ריומטר מכני דינמי מאריך מצויד באמבט איברים מחוסם 37 מעלות צלזיוס מלא PBS. החל מתח חד-מיני בקצב ליניארי קבוע על-ידי הגדרת הריומטר בכ-1% מהמרחק ההתחלתי בין הווים לשניה. ניתן להשתמש בקצב מתיחה קבוע של 0.03 מילימטר לשנייה עם ממדי ECT טיפוסיים.
לקרוע את כוח המתמר וליזום את המתיחה. שמור להקליט עד לנקודה של ECT קרע לאחר נרמול הכוח הנמדד על ידי אזור חתך ולתוות את עקומת הלחץ-זן קביעת פרמטרים ביומכניים שונים. רגע לפני שהרקמה מתחילה בשבירה זעירה, הגבול העליון של האזור האלסטי מתאים לנקודת התשואה והמתח שלה הוא מדד של גמישות רקמות.
אזור הפלסטיק נמצא בין נקודת התשואה לנקודת הכשל. נקודת הכישלון תואמת לירידה פתאומית בלחץ עקב קרע של הרקמה, הגדרת הזן האולטימטיבי שהוא מדד של הרחבת רקמות. נקודת המדידה השלישית תואמת את הכוח המרבי המוגדר על ידי הלחץ הגבוה ביותר שהרקמה יכולה לשאת מבלי לשבור במהלך המתיחה.
החוסן והקשוחה הניתנים על ידי האזור שמתחת לעקומה תואמים את האנרגיה הנקלטת על ידי הרקמה עד לנקודת התשואה ונקודת הכישלון בהתאמה. עבור כל עקומה שהושגה, השיפוע של החלק הליניארי של האזור האלסטי מתאים מודולוס של יאנג, הידוע גם בשם מודולוס אלסטי. זהו מאפיין מכני המודד את נוקשות הרקמה.
באמצעות פרוטוקול זה, דחיסת ECT והתכווצות בתנאי בקרה ובנוכחות FCS התפתחו כמה שעות לאחר הליהוק ובמיוחד גדל עד היום החמישי. כאשר ECT טופל עם מעכב פילמור אקטין Latrunculin A, דחיסת ECT צומצמה כפי שצוין על ידי אזור חתך גבוה משמעותית בהשוואה לשליטה. התכווצות הרקמות הוערכה במהלך חמשת ימי התרבות.
בהיעדר לדרונקין A, ההתכווצות גדלה בהדרגה עד היום החמישי והגיעה לכ -40%. עם זאת, נוכחות Latrunculin A השפיעה על התכווצות הרקמה וכתוצאה מכך רק כ 20% התכווצות מקסימלית. עיכוב פילמור אקטין הוביל להפחתה משמעותית של כ -50% בנוקיות הרקמה על השליטה.
תוצאות אלה מראות כי שלמות הציטוסד actin חיונית לדחיסת ECT, התכווצות, התקשות. חשוב לבחור פתרון קולגן אמין ואיכותי ולהבטיח כי מתלה תא אחד עם כדאיות גבוהה משמש לשיפוץ רקמות חיבור מהונדסות.
