מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים, סיוע, למחקר מדעי על מאתגר מחקר גישוש (JK), ומחקר מדעי (A) (ג&#39;יי קיי ו SM) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, טכנולוגיה, יפן . FPR RIKEN המילגה (RCE) מספקת תמיכה נוספת. המחברים מביעים את תודתם בני הזוג. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama ו מאמי אוקמוטו לקבלת סיוע טכני עם NMR וניתוחים סטטיסטיים.

1. הכנה מסנן להסיר extractables <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 25 מ&quot;מ בקוטר 0.22 מיקרומטר נקבוביות בגודל Durapore מסננים PVDF הידרופילי (Millipore). מקום מסננים כוס נקי 500 מ&quot;ל פיירקס באמצעות פינצטה. לפני שלוש פעמים לשטוף עם מים מזוקקים. מערבולת גם לך לשטוף את המסננים כדי למנוע יידבקו זה לזה. הוספת 300 מ&quot;ל מילי-Q (Millipore) או מים שווה ערך באיכות גבוהה. החיטוי כדי להקל על הסרה מלאה של extractables מן המסננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את מילי-Q ושוב טריפל לשטוף את המסננים, הפעם עם מילי-Q. שימוש במסננים פינצטה מקום בודדים על משטח יבש ונקי (כגון אלומיניום) ויבש גם בטמפרטורה סבירה (למשל 37 ° C) או אוויר יבש. המסננים נמצאים כעת מוכן לשימוש. </li></ol> 2. סינון של חומר דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הוכחת בפרוטוקול זה, נירוסטה Millipore 3 במקום סעפת פילטר עם 25 מ&quot;מ עמודות microanalysis מסנן עם זכוכית תומךומשאבה מכנית משמשים. באמצעות טכניקה האספטי, הנח מסנן אחד 25 מ&quot;מ על בסיס טור מסנן, החל את העמודה לצבוט יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 15 מ&quot;ל של דגימה לעמודה, פתח את שסתום עצירה על סעפת פילטר, והפעל את המשאבה. סנן תחת לחץ מתון כדי למזער שבירה תא (&lt;5 kPa). משאבות אחרות, כגון יד או משאבת peristaltic יכול להיות מותאם פרוטוקול זה. לקבלת דוגמיות צפיפות נמוכה יותר, תוספות רצופים של מים עשוי להיות נחוץ, אל תיתן מסנן ללכת יבש במשך תקופה ארוכה של זמן בין תוספת של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות ימיים, לאחר שהחלת סינון לדוגמה, תוכל לבצע שטיפה במים מתוקים לא חובה להפחית יונים פאראמגנטיים שיורית במדגם שלך על המסנן. זה עשוי לעזור עם כוונון מדויק יותר של המגנט ספקטרומטר. פשוט בעדינות להוסיף נפח קטן של מים ולסנן דרך המדגם נאספו שלך בסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סינון נגמר, כבה את המשאבה, ולהשאיר אופ שסתוםn כך שאין עדיין תחת לחץ שלילי המסנן. הסר את תפס ועמודה הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם יד אחת, להשתמש בפינצטה נקיים לאחוז המסנן. מקפלים את המסנן על עצמו, אבל לא קמט. עם היד השנייה להשתמש השפה של הצינור 2-מ&quot;ל סטרילי microcentrifuge להחזיק את המסנן. לשחרר את פינצטה ואז להשתמש בהם כדי לתפוס מחדש את שני הקצוות של המסנן. Regrip על 45 ° זווית לקיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המסנן לתוך צינור 2-ml ושחרור כך נפתח בצד מדגם מול פנימה. ניתן למקם עד שני מסננים לתוך צינור מ&quot;ל סטרילי 2 microcentrifuge כך. אם באמצעות שני מסננים, להבטיח חפיפה מועטה ככל האפשר. מיד להקפיא (לפחות -30 ° C). </li></ol> 3. הפקת מימית מסיסים מטבוליטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize דגימות שלך לילה או לפחות 10 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר lyophilization, להוסיף מגרסה נירוסטה לצינור זה (Tokken). הוסף 750 μl אשלגן סטנדרטיתפוספט חיץ התמ&quot;ג ב תחמוצת דאוטריום (2 H&gt; 90%) עם 2.2-דימתיל-2-silapentane-5-sulfonate (DSS) סטנדרטי (KPI, 38.3 mM KH 2 PO 4, 61.7 mM K 2 HPO 4, DSS 0.1 מ&quot;מ, pH 7.0, 90% D 2 O) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate דגימות במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס sonicator מים (Bioruptor, Diagenode) להסיר את החומר לתא מן המסנן. הסר את המסננים עם פינצטה נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים באמצעות מגרסה הטחנה (1600 סל&quot;ד) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 65 מעלות צלזיוס עם רעד (1400 סל&quot;ד) על הספסל העליון שאכר (Eppendorf) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החזיר מתכת עם פינצטה נקיים, צנטריפוגות מדגם של 13,000 גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את supernatant ישירות צינור NMR עבור NMR ספקטרוסקופיה. </li></ol> 4. NMR ספקטרוסקופיה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען המדגם שלך ספקטרומטר התמ&quot;ג (כאן, DRX-500 Bruker ספקטרומטר מצוידTXI בדיקה משולשת עם שיפוע ציר נשלט על ידי המחשב פועל XWIN-NMR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל 1 1D H ספקטרום NMR בשיטות שפורסמו בעבר המתאימים 2,15 מממשק XWIN-NMR. במחקר הנוכחי 1 H NMR ספקטרה נרשמו על ההפעלה DRX-500 MHz ספקטרומטר ב 500.03 ב אותות 298 ק מים שנשארו דוכאו על ידי רצף הדופק ווטרגייט, עם הזמן חזרה על 1.2 s. 128 הארעיים נאספו להשיג 32,000 נקודות נתונים בכל הספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את נתוני תמ&quot;ג מדריכים למחשב התקנת תוכנה NMRPipe 16. לעבד את הנתונים גלם DSS כמפורט 0 התייחסות עמודים לדקה באופן ידני בשלב ספקטרה. לספרת את הנתונים רפאים לתוך מערכת של ערכים בדידים על ידי שילוב או &quot;binning&quot; אותם עם תוכנה כגון rNMR, Automics, או באמצעות חבילת FT2B זמין לציבור באתר האינטרנט של ECOMICS ( <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> ) 3,17. במאות ההוא למשל, ספקטרה שולבו בין ppm 0.5 ו 10.5 על 0.032 אזורים בלתי נפרד עמודים לדקה באמצעות ECOMICS ו לנורמליזציה לאחת DSS או עוצמת האות מוחלט. נתוני הפלט כעת ניתן להשתמש לניתוח סטטיסטי במורד כגון ניתוח מרכיבים עיקריים (PCA), תוך שימוש בחבילות תוכנה חופשית כמו R 18. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה 1 ספקטרום NMR H המתקבל באמצעות השיטות הנ&quot;ל מוצגים באיור 1. דוגמאות אלה, משתי נקודות זמן הניסוי מיקרוקוסמוס מראים הבדלים ברורים בשל פעילות מטבולית אצות. קשת יום 4 מציג שפע רב של פסגות, במיוחד בטווח 3-4 עמודים לדקה לעומת המדגם 1 יום. פסגות אלה ניתן לייחס סוכרים המיוצר על ידי פורח הצורניות בתוך המיקרוקוסמוס. בניסוי דומה להשוות את הצמיחה של טבע הקהילות הפלנקטון במי ים מלאכותיים או טבעיים, שיטות סטטיסטיות שלuch כמו העלילה העיקרי ניתוח מרכיבים ציון (PCA) נגזר ספקטרום NMR זרקת לפח ניתן להשתמש כדי להראות הבדלים מטבוליים ברורים בין שני הטיפולים (איור 2), ואילו מגרשים טעינת ניתן לזהות פסגות בתוך הספקטרום כי צורת ההפצה של הנתונים . תוצאות אלה ניתן להשוות את נתוני רמות omics אחרות, כגון טביעות אצבעות משיטות גנומית (איור 3). פסגות אלה תמ&quot;ג ניתן שאילתה בנפרד (למשל על BMRB; <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a> ) 19, או כל ספקטרום ניתן לנתח סטטיסטית (למשל עם SpinAssign ב <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken. jp /? פעולה = nmr_search</a> ) 2. בדוגמה זו, ההבדלים בין הטיפולים היו בשל שפע של פסגות באזור סוכרים (3.39 ppm ל 4.04 ppm) של ספקטרום מן הטבע מטבוליטים פלנקטון הקהילה, ואת פסגות כמה אופייני לקהילות מי ים מלאכותיים היו בהיסוס IDEntified כמו חומצת חלב ו formate באמצעות SpinAssign. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. נציג 1 H ספקטרום NMR המתקבל דגימות מעובד באמצעות הליך זה. דגימות נלקחו לפני מיקרוקוסמוס (יום 1) ובמהלך בלום (יום 4) diatom אינטנסיבי. הניסויים בוצעו על תמ&quot;ג Bruker DRX-500 עם אותות מנורמל לגובה שיא פנימי סטנדרטי (DSS: 0 ppm). <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניתוח מרכיבים ראשיים (PCA) ציון על העלילה של ספקטרום NMR זרקת לפח מ metabolomes של טבעי המופק planktonic קהילות חיידקים הגדלים מיקרוקוסמוס עם טבעי (ללא יהלומים) פתוחים או מי ים מלאכותיים (עיגולים שחורים). הבדלים מטבוליים ברורים ניתן לצפות scatterplot. העלילה טוען מניתוח כזה יכול לשמש כדי לזהות שיאים שונים של חשיבותהמערכת; פסגות אלו ניתן לנתח נוספת לפי הצורך. <img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. דוגמה ניתוח רב omics שילוב NMR עם הנתונים הגנומי. הרכב הקהילה מבוסס על אלקטרופורזה denaturing צבע ג&#39;ל של 18s (משמאל) 16S (מימין) גנים rRNA מן דגימות אותו כפי שנותחו איור 2 מראה גם חיידקים שונים בקהילה (בין דפוסי יהלומים) פתוחים טבעיים ומלאכותיים (עיגולים שחורים) מיקרוקוסמוס מי ים. התכתבות כזו בין metabolome ו הגנום של מערכות טבעיות ממחיש את התועלת של גישה זו.

<ol>
	<li>Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+metabolomics:+a+critical+review+and+future+perspectives.">Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives.</a> Metabolomics. 5, 3-21 (2008).</li><li>Chikayama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+indices+for+simultaneous+large-scale+metabolite+detections+for+a+single+NMR+spectrum.">Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum.</a> Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).</li><li>Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rNMR:+open+source+software+for+identifying+and+quantifying+metabolites+in+NMR+spectra.">rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra.</a> Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+gut+microbes+modulate+human+metabolic+phenotypes.">Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).</li><li>Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+exploration+of+metabolic+and+genomic+diversity+in+rice.">Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice.</a> BMC Genomics. 10, 568 (2009).</li><li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacteria+can+protect+from+enteropathogenic+infection+through+production+of+acetate.">Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate.</a> Nature. 469, 543-547 (2011).</li><li>Kikuchi, J., Hirayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+stable+isotope+labeling+of+higher+plants+for+a+hetero-nuclear+multi-dimensional+NMR-based+metabolomics.">Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics.</a> Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).</li><li>Martin, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+top-down+systems+biology+view+of+microbiome-mammalian+metabolic+interactions+in+a+mouse+model.">A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model.</a> Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).</li><li>Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+lipid+profiling+of+mycobacteria+using+2D+HSQC+NMR+maps.">A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps.</a> J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).</li><li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+characterization+of+bacterial+metabolic+dynamics+with+a+novel+profiling+technique,+real-time+metabolotyping.">Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping.</a> PloS ONE. 4, e4893 (2009).</li><li>Date, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+monitoring+approach+for+metabolic+dynamics+in+microbial+ecosystems+using+stable-isotope-labeling+technologies.">New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies.</a> J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).</li><li>Nakanishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+omics+approach+identifies+nutrition-mediated+microbial+interactions.">Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions.</a> J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).</li><li>Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogeochemical+controls+and+feedbacks+on+ocean+primary+production.">Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production.</a> Science. 281, 200-207 (1998).</li><li>Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+aquatic+organisms:+the+new+'omics'+on+the+block.">Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block.</a> Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).</li><li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+semipolar+solvent+system+as+a+step+toward+heteronuclear+multidimensional+NMR-based+metabolomics+for+13C-labeled+bacteria,+plants,+and+animals.">Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals.</a> Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).</li><li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMRPipe:+A+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+UNIX+pipes.">NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes.</a> J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automics:+an+integrated+platform+for+NMR-based+metabonomics+spectral+processing+and+data+analysis.">Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis.</a> BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).</li><li>Eldon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioMagResBank.">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).</li><li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+polar+and+semipolar+plant+metabolites+throughout+extraction+processes+using+a+combined+solution-state+and+high-resolution+magic+angle+spinning+NMR+approach.">Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach.</a> Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שיטת סינון המטבוליט החילוץ הפגינו כאן מאפשר ביומסה planktonic חיידקים כדי לאסוף כמות מספקת metabolomics תמ&quot;ג. תוך מיצוי רק מימית מסיסים מטבוליטים באמצעות KPI ו 1D 1 H NMR באה לידי ביטוי, מיצוי בממסים אחרים וגישות ספקטרוסקופיות ניתן להשתמש. דוגמה שימושית הוא השימוש מתנול deutera...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 0.22 הידרופילי מיקרומטר Durapore PVDF מסננים, 25 מ&quot;מ </td><td> Millipore </td><td> GVWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> בעל מסנן Microanalysis, 25 מ&quot;מ, fritted תמיכה זכוכית </td><td> Millipore </td><td> XX1002500 </td><td></td></tr><tr><td> 3 במקום סעפת, 47 מ&quot;מ, נירוסטה </td><td> Millipore </td><td> XX2504735 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Wako </td><td> 164-04295 </td><td></td></tr><tr><td> תחמוצת דאוטריום, 2 H&gt; 90% </td><td> Campridge איזוטופ Laboratoties </td><td> DLM-4 </td><td></td<html> &gt; </tr><tr><td> DSS </td><td> Fluka </td><td> 92754 </td><td></td></tr><tr><td> Automill </td><td> Tokken </td><td> TK-AM4 </td><td> Crushers נירוסטה כלל </td></tr><tr><td> Thermomixer נוחות </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 000.011 </td><td></td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 </td><td></td></tr><tr><td> אבק המאייד </td><td> EYELA </td><td> CVE-3100 </td><td></td></tr><tr><td> התמ&quot;ג </td><td> Bruker </td><td> DRX-500 עם בדיקה מ&quot;מ TXI 5 </td><td></td></tr><tr><td> כלי binning רפאים </td><td> פותח במקור </td><td> FT2DB </td><td> <a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a> </td></tr><tr><td> ביאור כלי מסד נתונים המטבוליט ו </td><td> פותח במקור </td><td> SpinAssign </td><td>= Nmr_search &quot;&gt; http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search </td></tr></tbody></table>

concentration of metabolites from low-density planktonic communities for environmental metabolomics using nuclear magnetic resonance spectroscopy

Metabolomics הסביבה היא תחום המתפתח כי הוא מקדם הבנה חדשה כיצד אורגניזמים להגיב ולתקשר עם הסביבה ועל זה ברמה הביוכימית 1. ספקטרוסקופיה מגנטית גרעינית (NMR) תהודה היא אחת מספר טכנולוגיות, כולל כרומטוגרפיה המוני גז ספקטרומטריית (GC-MS), עם הבטחה רבה מחקרים כאלה. היתרונות של התמ&quot;ג הם כי הוא מתאים ניתוחים לא ממוקדים, מספק מידע מבניים ספקטרה ניתן שאילתה באופנים כמותיים וסטטיסטיים מול מסדי נתונים זמינים לאחרונה של ספקטרום המטבוליט הפרט 2,3. בנוסף, נתוני תמ&quot;ג ספקטרליות ניתן לשלב עם נתונים אחרים (רמות omics transcriptomics למשל הגנומיקה) כדי לספק הבנה מקיפה יותר של התגובות הפיזיולוגיות של מינים זה לזה ולסביבה 4,5,6. עם זאת, התמ&quot;ג הוא רגיש פחות טכניקות metabolomic אחרים, ולכן קשה APרובדי חיידקים למערכות הטבעיות שבה אוכלוסיות המדגם ניתן בריכוזים נמוכים, צפיפות המטבוליט נמוכה בהשוואה מטבוליטים של מוגדרים היטב ובנפש חפצה מקורות שניתן להפיק כגון רקמות, biofluids שלמים או תאים תרבויות. כתוצאה מכך, המחקרים המעטים ישיר metabolomic הסביבתיות של חיידקים שבוצעו עד כה היה מוגבל צפיפות גבוהה מערכות אקולוגיות התרבות מבוססות או להגדיר בקלות כמו מארח הסימביונט מערכות, שנבנו שיתוף תרבויות או מניפולציות של הסביבה שבה המעיים תיוג איזוטופ יציב יכול להיות בנוסף משמש כדי לשפר את אותות תמ&quot;ג 7,8,9,10,11,12. שיטות להקל על ריכוז ואיסוף של מטבוליטים סביבתיים בריכוזים מתאימים NMR חסרים. מאז תשומת לב לאחרונה ניתנה על metabolomics הסביבתיות של אורגניזמים בתוך הסביבה המימית, שם הרבה זרימת האנרגיה והחומר מתווך על ידי הקהילה planktonic 13,14, פיתחנו שיטה הריכוזtion והפקת כולו הקהילה מטבוליטים של מערכות חיידקים planktonic על ידי סינון. זמינים מסחרית הידרופילי פולי-1 ,1-difluoroethene (PVDF) מסננים מטופלים במיוחד כדי להסיר לחלוטין extractables, אשר יכול אחרת המופיעים מזהמים ניתוחים שלאחר מכן. מסננים אלה שטופלו משמשות לאחר מכן כדי לסנן דגימות סביבתיות או ניסיוני של עניין. מסננים המכילים את החומר מדגם רטוב הם lyophilized ו מימית מסיסים מטבוליטים מופקים ישירות ספקטרוסקופית NMR קונבנציונאלי באמצעות אשלגן זרחתי מיצוי מתוקנן חיץ 2. הנתונים המופקים בשיטות אלו ניתן לנתח סטטיסטית לזהות תבניות בעלות משמעות, או משולב עם רמות omics אחרים הבנה מקיפה של הקהילה ותפקוד המערכת האקולוגית.

Watch this Scientific Journal Video about Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.

ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

concentration-metabolites-from-low-density-planktonic-communities-for

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  RIKEN Advanced Science Institute. שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.

Video: Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

הקהילות מיקרוביאלית בטבע מעבדה - ראיון

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage without prior knowledge of what genes the community might be expressing. Thus it provides the most unbiased perspective on community gene expression in situ. Environmental transcriptomics protocols are technically difficult since prokaryotic mRNAs generally lack the poly(A) tails that make isolation of eukaryotic messages relatively straightforward 1 and because of the relatively short half lives of mRNAs 2. In addition, mRNAs are much less abundant than rRNAs in total RNA extracts, thus an rRNA background often overwhelms mRNA signals. However, techniques for overcoming some of these difficulties have recently been developed. A procedure for analyzing environmental transcriptomes by creating clone libraries using random primers to reverse-transcribe and amplify environmental mRNAs was recently described was successful in two different natural environments, but results were biased by selection of the random primers used to initiate cDNA synthesis 3. Advances in linear amplification of mRNA obviate the need for random primers in the amplification step and make it possible to use less starting material decreasing the collection and processing time of samples and thereby minimizing RNA degradation 4. In vitro transcription methods for amplifying mRNA involve polyadenylating the mRNA and incorporating a T7 promoter onto the 3 end of the transcript. Amplified RNA (aRNA) can then be converted to double stranded cDNA using random hexamers and directly sequenced by pyrosequencing 5. A first use of this method at Station ALOHA demonstrated its utility for characterizing microbial community gene expression 6.

We present a method for generating cDNA from environmental mRNA. In general, total RNA is first collected from the environment, rRNA is selectively removed, mRNA is selectively amplified, and cDNA synthesized from the enriched mRNA pool is sequenced. Recovered sequences can be annotated using standard bioinformatics techniques to identify the expressed genes.

ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

כימות ערבוב באמצעות תהודה מגנטית

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

הסרת אקסוגניים חומרים מן החלק החיצוני של ליבות קפואות לחקירה בתוך הקהילות הביולוגיות העתיקה טפח

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

נסיוני באמצעות דרוזופילה כמערכת מודל הגעה לבדיקת רעילות במעבדה

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible synthetic procedures. In this case, starting from FeCl3 and citrate trisodium salt, iron oxide nanoparticles coated with citric acid are obtained in 10 min in the microwave. These nanoparticles present a small core size of 4.2 &#177; 1.1 nm and a hydrodynamic size of 7.5 &#177; 2.1 nm. Moreover, they have a high longitudinal relaxivity (r1) value of 11.9 mM-1&#183;s-1 and a modest transversal relaxivity value (r2) of 22.9 mM-1&#183;s-1, which results in a low r2/r1 ratio of 1.9. These values enable positive contrast generation in magnetic resonance imaging (MRI) instead of negative contrast, commonly used with iron oxide nanoparticles. In addition, if a 68GaCl3 elution from a 68Ge/68Ga generator is added to the starting materials, a nano-radiotracer doped with 68Ga is obtained. The product is obtained with a high radiolabeling yield (&#62; 90%), regardless of the initial activity used. Furthermore, a single purification step renders the nano-radiomaterial ready to be used in vivo.

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Here, we present a protocol to obtain 68Ga core-doped iron oxide nanoparticles via fast microwave-driven synthesis. The methodology renders PET/(T1)MRI nanoparticles with radiolabeling efficiencies higher than 90% and radiochemical purity of 99% in a 20-min synthesis.

סינתזה של 68המשחק מסטול-הליבה תחמוצת ברזל חלקיקים עבור כפול טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים/דימות תהודה מגנטית (T1)

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;