ברצוננו להודות לצוות מדענים SBI על תמיכתם בפיתוח ובדיקה של פרוטוקולים אלה.

1. Transfection של תאים 293TN עם פלסמידים אריזה והביטוי לבנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 7.0-8.0 x 10 6 תאים 293TN בכל צלחת 2 15 תרבות ס&quot;מ 20 מ&quot;ל של מדיום תרבות המכיל בינוני DMEM השלימו עם 4 מ&quot;מ L-גלוטמין, 4.5 גר &#39;/ ליטר גלוקוז בדם העובר שור (10%) ללא אנטיביוטיקה. לגדול במשך 18-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם CO 5% 2, כך צפיפות התאים מגיע ל 60-80% confluency בזמן transfection. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך צלחות זרעים שונים של תאים להשיג titer גבוהה מספיק עבור התמרה של תאים היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על כל צלחת של תאים, להוסיף 1.6 מ&quot;ל סרום ללא DMEM כדי צינור autoclaved 2 Eppendorff מ&quot;ל. הוסף 45 μl pPACKH1 מיקרוגרם או pPACKF1 ו -4.5 של lentivector שלך כדי לבנות DMEM ומערבבים ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 55 μl של PureFection לתוך צינור אחד. מערבולת למשך 10 שניות. דגירה את התערובת-פלסמיד-PureFection DMEM ב F בטמפרטורת החדראו 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת-פלסמיד-PureFection DMEM לצלחת רקמת התרבות נפתח חכם מערבולת בעדינות כדי לפזר באופן שווה לאורך כל הצלחת. להחזיר את התבשיל כדי חממה לגדול ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין צורך לשנות את התקשורת לאחר transfection. אם מבנה lentivector שלך מבטא את הגן המקודד חלבון פלואורסצנטי כמו ה-GFP, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ 12-24 שעות לאחר transfection. אתה אמור להיות מסוגל לראות&gt; תאים 90% GFP חיובי, המעיד על כך transfection הצליחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תרבית תאים supernatant לאחר 48 ו - 72 שעות אל תוך צינור 50 צנטריפוגות סטרילית מ&quot;ל. זה supernatant תרבית תאים כעת מכיל חלקיקים pseudoviral זיהומיות. (פעל על פי ההנחיות המומלצות לעבודה עם דרגת הגנה BSL-2.) צנטריפוגה XG ב 1500 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה פסולת הסלולר. העברת supernatant ויראלי צינור חדש, על מנת להבטיח שלא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים 293TN שנוצלו על האריזה ויראלי צריך להיות מסולק במיכל Biohazard ואינם לשמש סבב נוסף של אריזות ויראלי. </li></ol> 2. ריכוז Supernatant ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח קר (4 מעלות צלזיוס) PEG-IT רטיבות וירוס פתרון כל 4 כרכים של supernatant חלקיק המכיל lentiviral. משקעים של חלקיקים lentiviral של כמויות גדולות ניתן להשיג עם קורנינג 250 מ&quot;ל צנטריפוגות צינורות פוליפרופילן. מערבבים את הפתרון על ידי פעמים צינורות היפוך מספר, אבל אל מערבולת את התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקררים את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 12 שעות (עד 4 ימים מקובל). לא ללחוץ או לסובב את הצינורות במהלך שלב הקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה תערובת supernatant / PEG-IT ב 1500 XG במשך 30 דקות 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, חלקיקים lentiviral יופיע בצבע בז&#39; או לבן גלולה בחלק התחתון של הצינור. יוצקים את supernataNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל עקבות של נוזלים על ידי שאיפה, נזהרת שלא להפריע את חלקיקי lentiviral שזירזו ב גלולה. עקבות של שיורי-PEG יהיה לדלל את הנגיף (ובכך להקטין את titer), אך לא ישפיע על שלמות התאים היעד מאז PEG-IT הוא אינרטי ולא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ולשלב את חלקיקי lentiviral ב 1/100 של נפח המקורי באמצעות קר (4 מעלות צלזיוס), פוספט סטרילית שנאגרו מלוחים או DMEM המכיל 25 HEPES חוצץ מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot לתוך צלוחיות קריוגני סטריליים החנויות ב -70 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol> 3. Titering פרידמן וקיבל הד עולמי ויראלי של תאים היעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים titering חלקיקים lentiviral לפני transducing היעד תאים של ריבית וחישוב ריבוי הולם של זיהום (משרד הפנים) על התאים היעד עבור עקביות בין הניסויים. עבור titering ויראלי, מומלץ להשתמש HT1080 תאים כקו קל להדביק חיובית שליטה. Plלהקל לציין כי פרוטוקול titering כרוך transducing HT1080 תאים עם aliquot קטן של חלקיקים lentiviral לך ארוזים. לאחר titer ידוע, היעד תאים של ריבית ניתן transduced עם חלקיקים lentiviral המיוצרים. פרוטוקול ממליצים titering ניתן למצוא בכתובת: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50,000 פלייט היעד תאים של ריבית לכל גם בצלחת 24 גם בתקשורת תרבית תאים. השתמש בתקשורת כי תאים בתרבית בדרך כלל פנימה לגדול בתאים לילה בתנאים שצוינו תרבותם. תאים צריכים להיות בין 50 עד 70% confluent ביום התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של התמרה, לשאוב את התקשורת מן התאים. שלב בינוני תרבות עם TransDux לריכוז x 1 הסופי (לדוגמה, 2.5 TransDux μl עד 500 μl של המדיום תרבות). לאחר מכן להעביר את TransDux-CE<html> תרבות LL בינוני התערובת היטב כל אחד מהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בנפח מתאים של וירוס אשר תואמים את האופטימלי עבור משרד הפנים את התאים לתוך היעד גם כל אחד. אם משרד הפנים האופטימלי אינו ידוע, מומלץ לנסות את מגוון MOIs שונים (כגון משרד הפנים של 1, 2 ו - 5 עבור קל להדביק התרבות תאים ורקמות, ועל משרד הפנים של 1, 10 ו 20 יותר קשות , להדביק תאים ראשוניים). אם ריכוז של חלקיקים lentiviral לא ידוע (כפי שנקבע באמצעות פרוטוקול titering וירוס), כמויות שונות של הנגיף יכול להישפט, כגון μl 1, 2 ו - 5 של הנגיף. הווירוס יכול להישאר בקשר עם התאים היעד של עד 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים נוספים עם transduced תאים של ריבית היעד רשאי להגיש 72 שעות לאחר התמרה, פעם מבנה ויראלי שילבה לתוך הגנום של התא המארח. שנה בינונית מעבר היעד תאים של ריבית על פי הצרכים הספציפיים שלהם. </li></ol> 4. נציג תוצאות = &quot;jove_step&quot; המעמד&gt; transfection של תאים 293TN צפיפות המוצא של התאים 293TN הוא קריטי עבור אריזה ויראלי מוצלח. תאים 293TN חייב להיות בין 60% -80 confluent יום transfection (איור 2). אם התאים 293TN פחות מ confluent 60%, לאפשר להם לגדול במשך עוד כמה שעות לפני שתנסה transfection. אם התאים הם 293TN&gt; confluent 80%, הם צריכים להיות replated לפני transfection. אם באמצעות ה-GFP להביע lentivector, לפחות 90% מהתאים 293TN צריך לזרוח ירוקים 24 שעות לאחר transfection, המציין transfection מוצלחת (איור 3). אם פחות מ 90% מכלל התאים GFP חיובי, לא להמשיך לשלב הבא, כי זה מצביע על כך transfection לא היה מוצלח, ואת titers ויראלי יהיה נמוך. במקום זאת, תאים חדשים צלחת 293TN ולהתחיל מחדש, כדי לוודא שהתאים 293TN הם בצפיפות תאים תקינה לפני transfecting. תאים 293TN יכול לשלוף את תרבות צלחות רקמות 48-72 שעות לאחר transfection. זה לא להשפיע לרעה על ייצור של חלקיקים lentiviral. Titering עם HT1080 תאים Titers ויראלי יכול להיות מחושב באמצעות ערכת Titering UltraRapid גלובלי של SBI על פי הוראות היצרן. מערכת זו עושה שימוש QPCR למדוד ויראלי שילוב של רצף wpre מ וקטור lentiviral אל HT1080 תאים ומשווה את זה עקום רגיל, המבוסס על רצף הגנום התייחסות כדי למדוד במדויק את יחידות זיהומיות לכל מ&quot;ל (איור 4). התמרה של תאים היעד אם אתה משתמש חלקיקים lentiviral המבטאים סמן GFP פעיל constitutively, תאים GFP חיוביים צריך להתחיל להופיע בתוך 12-24 שעות של התמרה, אם התגובה התמרה עובד. ביטוי של GFP יש להמשיך אחרי מבנה lentiviral ביציבות משתלב לאהוא לארח בגנום התא. אם transducing עם MOIs שונים, הקרינה GFP יש כ להתאים את משרד הפנים, שם MOIs נמוכות להראות הקרינה GFP פחות MOIs גבוהות יותר להראות עלייה GFP הקרינה (איור 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול ייצור ויראלי. פלסמידים את האריזה lentivector ו pPACK מעורבות ושיתוף transfected לתאי 293TN. לאחר 48 -72 שעות, supernatant ויראלי נאסף, ואת חלקיקים נגיפיים הם זירז עם PEG-IT. לאחר titering חלקיקים lentiviral, הם יכולים לשמש transduce היעד תאים של ריבית. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור שלב לעומת זאת התמונה של תאים 293TN. תא densitY צריך להיות בין 60-80% confluent יום transfection. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תמונת הניאון של תאים GFP חיובי 293TN 24 שעות לאחר transfection עם Purefection, pPACKH1, ו-GFP קידוד lentivector לבנות. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. תוצאות wpre QPCR ואת עקומת סטנדרט להשיג באמצעות ערכת Titering UltraRapid גלובלי של SBI לחשב משרד הפנים ו titer המקביל חלקיקים נגיפיים ארוזים. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. תמונות של פלורסנט HT1080 תאים transduced עם כמויות הולכות וגדלות של lentivirus. התמונות הן מ 72 שעות לאחר התמרה.

<ol>
	<li>Cann, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Viruses. A Practical Approach. , (2000).</li><li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lentivirus Gene Engineering Protocols. , (2003).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li><li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li><li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool.">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li></ol>

הפקה וגישה חופשית למאמר זה וידאו בחסות מערכת Biosciences.

אריזה זה ויראלי התמרה של פרוטוקול היעד תאים כבר מותאם לשימוש עם חומרים כימיים ויראלי של SBI אריזה. החלפת חומרים כימיים אחרים עשויים להשפיע על התוצאה של הפרוטוקול. פרוטוקול זה רק בצורה מיטבית לייצור lentiviral ולא מתאים לייצור סוגים אחרים של וירוסים או pseudoviruses. אריזה ויראלי מוצלח תלוי צעדים מרכזיים. התאים 293TN לבטא את האנטיגן SV40 T גדול, שהוא הכרחי הפרשת חלקיקים לתוך lentiviral supernatant תרבית תאים. הצפיפות שבה התאים הם 293TN בזמן transfection חשוב במיוחד על מנת מגיב PureFection מספיק כדי להעביר את lentivector ו פלסמידים אריזה לתוך התאים. הוספת תערובת PureFection לצלחת רקמת התרבות בצורה טיפה מבחינת ואחריו ביסודיות מתערבל צלחת חשוב פיזור של פלסמידים אריזהו lentivector לבנות לאורך כל התאים. אי הולם לחלק את הווקטורים עלול לגרום חלקיקים lentiviral מספיק שיופקו. התגובה אריזה ויראלי יכול להיות scaled עד לייצור של וירוס כייל גבוה, המבוסס על שטח הפנים של צלחות תרבית הרקמה. אפשר לבחור כמה צלחת רקמות מנות התרבות של תאים 293TN לכל מבנה זה צריך להיות ארוז. ריכוז של supernatants ויראלי יעיל במיוחד ביצירת גבוהה כייל הנגיף. Supernatant ויראלי מצלחות רבות של תאים ניתן לשלב והתרכז לשימוש בניסויים vivo, או תאים שקשה transduce. Titering חלקיקים lentiviral המיוצרים חשוב לחישוב מדויק משרד הפנים להשתמש עבור התמרה של תאים היעד. לדעת משרד הפנים ששימש התמרה נתון מאפשר פתרון בעיות במקרה של התמרה לא הצליחה. לדוגמה, באמצעות משרד הפנים, כי הואנמוך מדי עלול לגרום לתאי מטרה מעט מאוד המבטאים את המבנה של ריבית. באמצעות משרד הפנים, כי הוא גבוה מדי, לעומת זאת, עלול לגרום לתאי מטרה המראים סימנים של לחץ. המטרה היא להשתמש למיקסום משרד הפנים הבעת עניין של מבנה, תוך שמירה על בריאותם של התאים. למרות שאנו ממליצים על פרוטוקול QPCR מבוסס titering המודד עותקים משולבת של מבנה lentiviral ב HT1080 תאים, גישות titering אחרים יכולים לשמש, כגון ELISA p24 או הערכה של אחוז ה-GFP חיובי תאים. התמרה מוצלח של תאים היעד תלוי גם בגורמים מרכזיים. TransDux הוא מגיב זיהום ייחודית המאפשרת יעילות התמרה גבוהים, אבל זה לא רעיל לתאים. TransDux יכול לשמש במקום polybrene, אשר לעיתים קרובות רעילים לתאי המטרה. הכללת TransDux ב התמרה של תאים היעד עוזר לנטרל מטענים על חלקיקים נגיפיים ומאפשר את הנגיף לתאs. מאז TransDux אינו רעיל לתאים, ניתן לאפשר את חלקיקי lentiviral להישאר בקשר עם התאים לתקופה של עד 72 שעות (הזמן שבו המבנים ויראלי השתלבו בגנום התא המאכסן), ובכך מגדילים את ההסתברות חלקיקים נגיפיים להיכנס לתא. כמה קשות transduce תאים, transductions ניתן לחזור יום אחר יום כדי להגביר את היעילות התמרה. לדוגמה, transduce התאים ביום 1, לאפשר התאים לנוח ביום 2 ולאחר מכן transduce התאים שוב ביום 3. חשוב להמתין 72 שעות לאחר התמרה אחרונה לפני תחילת הבחירה, ניסויים נוספים או אפיון של התאים היעד. אריזה ויראלי יעיל הוא גם תלוי בגודל של מבנה lentiviral, בין 5 &quot;אזורי 3&#39;LTR. חלק זה של המבנה lentiviral צריך להיות כ 9 קילו או פחות, המתאימה לגודל של הגנום HIV הילידים. העולה על 9 KB מאי דהtiter קמט של חלקיקים pseudoviral המיוצרים. הטכנולוגיה החדשה, כמו וקטורים piggyBac transposon, לאפשר אינטגרציה, אמין ויציב של transgenes עד 100 kb דרך transfection אחד. גישה זו עשויה לשמש בונה כי יעלה את מגבלת הגודל עבור וקטורים lentiviral, במקרים בהם ניתן transfect תאים היעד, ומעניק יתרון נוסף של לא לדרוש צעד אריזה ויראלי 9,10. החלקיקים pseudoviral הופק באמצעות פרוטוקול זה הן זיהומיות בכך שהם יכולים להדביק תאים מסוגים יונקים ביותר. המוצרים בשימוש בפרוטוקול זה, עם זאת הם דור שלישי biosafe בכך שהם מייצרים replicative הלא עצמית inactivating pseudoviruses. לכן, ברגע transduced לתאי היעד או בעלי חיים, התאים היעד או בעלי חיים שאינם זיהומית או מדבקת. החלפה של פלסמידים lentivector אחרים שאינם דור שלישי biosafe אפשרי אם כי לא מומלץ מ biosafetyפרספקטיבה. פרוטוקול הייצור הנגיפי התמרה הבאות של תאים היעד צריכה להתבצע תחת רמת בטיחות ביולוגית 2, על פי הנחיות NIH 11, וחוקרים תמיד צריך ללבוש חלוק מעבדה וכפפות בעת טיפול חלקיקים נגיפיים. בשימוש בתאי המפיק 293TN, צינורות של חלקיקים נגיפיים, וכן טפטפות חד פעמיים להשליך במיכל Biohazard המתאים. בטפי להחדרת נוזלים הניתנים לשימוש חוזר וכלי זכוכית צריך חיטוי עם אקונומיקה ו מעוקר כדי להקטין את החשיפה של אדם.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DMEM בינוני גלוקוז גבוהות </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 293TN תאים </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> ל-HIV מבוססי lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> עבור FIV מבוססי lentivectors </td></tr><tr><td> כל וקטור lentiviral </td><td> SBI </td><td> שונים </td><td> cDNA, shRNA, microRNA, שעתוק עיתונאים </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-IT </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> עולמי Titering UltraRapid ערכת </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> לא תיאר בפרוטוקול זה, אבל צריך titer חלקיקים נגיפיים </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

כמו וקטורים פלסמיד סטנדרטיים, ניתן transfect lentivectors בצורת פלסמיד לתאים בעלי יעילות נמוכה עד בינוני לקבל ביטוי חולף של effectors. Lentiviral אריזה ביטוי בונה לחלקיקים pseudoviral, לעומת זאת, מאפשר התמרה של עד 100%, גם אם קשות transfect תאים, כגון גזע, העיקרי, ותאי הבדיל. יתר על כן, משלוח lentiviral אינו מייצר את התגובות סלולריות ספציפיות הקשורות בדרך כלל transfections כימיים, כגון מוות של תאים כתוצאה רעילות של מגיב transfection 1, 2. כאשר transduced לתאי יעד, מבנה lentiviral משתלב הדנ&quot;א הגנומי ומספק ביטוי יציב של סיכת ראש RNA קטן (shRNA), microRNA cDNA, או עיתונאי גן 3, 4. תאים היעד ביציבות המבטאים את המולקולה מפעיל ניתן לבודד באמצעות סמן לבחירה הכלול וקטור ביטוי לבנות כגון puromycin או GFP. לאחר PSחלקיקים eudoviral להדביק תאים היעד, הם לא יכולים לשכפל בתוך תאים היעד בגלל הגנים המבניים ויראלי נעדרים ואת חוזרת מסוף ארוכות (LTRs) נועדו להיות עצמי inactivating על התמרה 5, 6. ישנם שלושה מרכיבים עיקריים הדרושים אריזה lentiviral יעיל 1, 5, 6, 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור ביטוי lentiviral המכיל כמה מרכיבים גנטיים הדרושים האריזה, שילוב יציב של הביטוי ויראלי לבנות לתוך הדנ&quot;א הגנומי, וביטוי של מפעיל או עיתונאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פלסמידים אריזה lentiviral המספקים את החלבונים החיוניים שעתוק ואריזה של עותק RNA של הביטוי לבנות לתוך רקומביננטי חלקיקים pseudoviral. פרוטוקול זה משתמש פלסמידים pPACK (SBI) המקודדים על איסור פרסום, pol, ו rev מן הגנום HIV או FIV וחלבון שלפוחי דלקת בפה גרם וירוס (VSV-G) של חלבון מעיל ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293TN לייצר<html> R-תאים (נגזר HEK293 תאים) המבטאים את האנטיגן SV40 T גדול, אשר נדרש לצורך ייצור גבוהה titer lentiviral ואת הגן התנגדות neomycin, שימושי שתבחר מחדש את התאים לצורך תחזוקה. </li></ol> סקירה כללית של פרוטוקול ייצור ויראלי ניתן לראות באיור 1. הייצור הנגיפי מתחיל שיתוף transfecting תאים המפיק 293TN עם וקטור ביטוי lentiviral ואת פלסמידים אריזה. חלקיקים נגיפיים מופרשים אל התקשורת. לאחר 48-72 שעות של תרבות התקשורת סלולריים נאסף. פסולת נייד יוסר התקשורת תרבית תאים, ואת חלקיקים נגיפיים הם זירז ידי צנטריפוגה עם PEG-IT ריכוז. חלקיקים lentiviral המיוצרים הם titered אז ניתן transduce תאים היעד. פרטי titering ויראלי אינם נכללים בפרוטוקול זה, אך ניתן למצוא בכתובת: ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. פרוטוקול זה בצורה מיטבית באמצעות מוצרים ספציפיים המצוינים. חומרים כימיים אחרים עשויים להיות תחליף, אבל את אותן תוצאות לא ניתן להבטיח.

Watch this Scientific Journal Video about Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles at JoVE.com

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K Views.  System Biosciences. דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

Video: Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

הפקה של חלקיקים Pseudotyped ללמוד מעוררת פתוגני באווירה אבטחה ברמה 2

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

הערכת נטרול סרום נגד SARS-CoV-2 עם וירוסים פסאודוטיפיים

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

מחבר זרקור: חקר אינטראקציות וירוס מארח עם וירוסים מדומים 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...