עבודה זו נתמכה על ידי נין להעניק R01MH097949 ואת Autism Speaks פיילוט גרנט 7359 כדי BWL ואת Instrumentation משותף דימות אופטי נוריס כותנה Cancer Center גרנט P30CA023108.

<ol>
	<li>Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive.">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells.">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus.">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).</li><li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes.">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li><li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine.">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li><li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons.">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis?.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?.</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ישנם כמה שלבים קריטיים שחשובים אריזת ויראלי מוצלחת. Cell בריאות היא קריטית לפני ובמהלך transfection, כמו תאים בריאים יפחיתו את כמות הנגיף מיוצרת מאוד. אם transfection ואריזה מצליחים, אז 100% של התאים צריכים לבטא את fluorophore והתאים צריך להקים syncytium פונקציונלי. בשלב 3.2.4, הקשה על הצינור הוא הכרחי transfection-כייל גבוה ביעילות, ואת ה- pH של תמיסת מלח HEPES שנאגרו חייב להיות מדויק. Maxi-preps המייצרים פלסמידים הדרושים אריזה ויראלי חייב להיות טהור מאוד. עד כה, זה מועיל כדי אתנול לזרז את elution DNA הסופי מחדש להשעות במאגר טריס-EDTA. זה גם מאוד חשוב להפחית את כמות בסרום עד 2% או פחות בתקשורת כי קפאין מתווסף ביום 6 (שלב 3.4) לפני אוסף ויראלי. אם בסרום לא מצטמצם, אז הנגיף המטוהר הסופי יכיל כמות רצויה של prot בסרוםעין. שימוש פוליאתילן גליקול 6000 כאשר מזרזים חלקיקים הנגיפיים כולל הכרח ultracentrifugation. כמו כן, חשוב לציין כי וירוסים המכיל Cas9 CRISPR בדרך כלל יש כייל סביב פי 10 פחות וירוסים אך ורק המכיל fluorophore. עבור הניתוח stereotaxic, השימוש בחומרי הרדמה נשאפים מאפשר שליטה מהירה ומדויקת או התודעה של החיה לעומת הרדמה בזריקות ומאפשר הרדמה על פני טווח גילאים גדול. חשוב מאוד לשמור על מכשירי ניתוח נקי וסטרילי, יחד עם מיקוד לשחזור דורש המיקום המדויק של הראש. ודא שאין התנדנדות או גלגול של הראש במכשיר stereotaxic וכי הגולגולת מרגישה במקומו. זה יכול להיות שימושי כדי לאפשר הגולגולת להתייבש כדי למצוא את התפרים כדי לקבוע את הקואורדינטות stereotaxic. כמו כן, שיעור ונפח לכל stereotaxic לתאם צריך להיקבע באופן אמפירי. טכניקה זו המגביל כי ההתפשטות של lenti- או רטרו-וירוס מוגבלת, במיוחד בהשוואת וירוסי adeno קשור (AAVs) .לכן, וירוסים אלה הם בעלי ערך כאשר מדביקים אזור במוח בדיד, אך לא עבור זיהום כולל קשור AAVs המשמש ניתוח התנהגות בבעלי חיים. שימוש קפאין בפרוטוקול זה מגדיל מאוד את כייל של וירוסים אלה, אך הם עדיין לא גבוהים כמו titers מושגת באריזת AAV. כמו כן, שילוב יציב הוא רק יתרון ביטוי fluorophore, כמו CRISPR / Cas9 טפסי עריכות גנומי יציבים גם כאשר transfected זמני ויתכן כי על-הולך ביטוי Cas9 ו sgRNA עשוי בסופו של דבר לייצר את השפעות היעד. הביטוי חולף מערכת CRISPR / Cas9 עם AAVs מספיקה כדי לייצר שינויים גנומית מופצים ברחבי חלוקות תא, לעומת זאת, ביטוי fluorophore לא יישמר. יצירת lenתדהמה ו רטרווירוסים ניצול מערכת CRISPR / Cas9 יהיה להקנות את היכולת למקד כל גן הרומן במגוון רחב של אורגניזמים. היעילות של עריכת גן נראית תלוי ברצף של RNA מדריך מיקוד מחשוף Cas9. זה כבר נקבע באופן אמפירי כי בין 10% ו -80% של שיבוטים מכילים indels לאחר רצף נגועים בתאי Neuro2A. זהו כיום ידועים אם תדרי indel מחושבים בתאי Neuro2A הם שיקוף של אלה בנוירונים. מדריך תוכנות עיצוב RNA כגון Benchling חברה כוללות ציון &quot;על היעד&quot; שעשויה להיות מסוגל לחזות את היעילות של רצף מטרה נתון. באיזו מידה &quot;על היעד&quot; כגון ציונים הם צרכימים ואמינים להיקבע באופן אמפירי בנוירונים ותא-סוגים אחרים כמערכת CRISPR-Cas9 הופך יושם באופן נרחב יותר. Lentivirus מבוסס ייצור חיים מהונדס כבר variably מוצלח עם דיווחים כי transgenes נמסר lentivirus להפוך סיlenced 11. עריכת גן CRISPR בתיווך של ה- DNA עשויה להיות מועברת דרך הקו ניבט ליצור מודלים של בעלי חיים שלמים. לפיכך, עריכת גנומי יציבה עשויה להיות ברת השגה למרות והשתקת fluorophores ויראלית נמסר transgenes Cas9. זה עשוי לספק פלטפורמה יעילה עבור שינויים גנומית ממוקדים. משלוח ויראלי של מערכת CRISPR / Cas9, ואילו מעתה אין צורך האורגניזם המהונדס, הוא משלים טכניקות אלה. לדוגמה, הזרקת חלקיקים נגיפיים כגון לתוך חיים מהונדס תרכובת inducibly מבטא opto- או הכימותרפיה הגנטי תלוי Cre ו Cre transgenes אמור להקל מחקרים מורכבים לתוך מערכת היחסים בין מניפולציות גנטיות הפעילות העצבית. דוגמה שנייה היא לספק אלה חלקיקים נגיפיים Cas9 / sgRNA לתוך בנוקאאוט מותנה בניסיון למסך אינטראקציות גן-גן. לבסוף, אחר מסלול מרגש של מחקר זה הוא ההקרנה של פנוטיפים ותרכובות טיפוליות תאים שמקורם בחולה, אשר יכולהלשמש כדי לאמת ולגלות רשתות גנטיות כי הם שיבשו במחלות שונות.

כדי ללמוד את הבסיס של פיזיולוגיה נורמלית והפתולוגיה מחלה, יש צורך לתמרן ביטוי גנים בדיוק אורגניזמים מודל. עבור אורגניזמים מודל יונקים, זה הוא מרוכז בעיקר על היצירה והפיתוח של עכברים מהונדסים שבו מרכיב גנטי של ריבית מוקף אתרים מוכרים על ידי recombinase. זה יכול לגרום מניפולציה אתר ספציפי של גנים ולצדו אלה. אמנם זה כבר אסטרטגיה מוצלחת, זה זמן ומשאבים רבים; למשל, יצירת חיים מהונדסים משולשים שיבטאו גן floxed, recombinase Cre, ואת גן כתב Cre דורשת הזדווגויות ואימות מרובות. לעומת זאת, הזרקת stereotaxic של שכפול חלקיקים נגיפיים פגומים קידוד חלבון פלואורסצנטי ואת recombinase לתוך חית גן floxed אינו מחייבים גנוטיפ מורכב או אסטרטגיות רבייה 1. יתר על כן, אם חלבון פלואורסצנטי ו Cre להביע וירוס הוא שיתוף מוזרק עם enco וירוס שנידינג חלבון פלואורסצנטי שונה, אז זה מספק שליטה בתוך הרקמות עבור המניפולציה הגנטית הממוקדת. בעוד אסטרטגיה זו עדיין דורש את השימוש בבעלי חיים עקום, אסטרטגיות מבוססות RNA בתיווך ויראלי לעקוף את הצורך חיות טרנסגניות. לדוגמא, הזרקת stereotaxic של וירוסים שכפולים מחסרת המקודדים חלבון פלואורסצנטי ו RNA מכבנה קצרה (shRNA) יכולה להשתמש מכונית RNAi אנדוגני של התא כדי לגרום לירידה חזקה לפרוטוקול של גן של עניין. עם זאת, אסטרטגיות shRNA לייצר דפיקה ומורדות גן עדין ופעמים רבות תוצאת פנוטיפים הסלולר צנוע 2. בעוד למטה דפיקה עשוי להיות רלוונטי יותר פיסיולוגי לטיפול באין גן הטרוזיגוטיים, חוסן הירד שלה לעומת פסק דפיקה אינו אידיאלי עבור גילוי פנוטיפי של גנים חדשים. טכניקה שלישית שנוצרה לאחרונה, CRISPR (באשכולות קבוע Interspaced חזור קצר Palindromic) / Cas9 (CRISPR הקשוריםחלבון 9) מערכת, מסתמך על הביטוי הן של RNA אקסוגניים קטן אנזים חיתוך DNA. המערכת CRISPR / Cas9 הותאמה ממערכת החיסון פרוקריוטים אשר פיתחו שיטה לזיהוי זרים, פולשים DNA מפני וירוסים ותוכנות מיקוד זה שעומד לעבור פירוק באמצעות האנזים Cas9 3,4. טכניקת עריכת הגנום עצמה זה יכול לשמש ליצירת מחיקות ממוקדות, הוספות, ומוטציות; ואת הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לבצע מחיקות בתוך גן של עניין על מנת המפסיד יוצא ביטויו vivo. אנזים Cas9 חייב לבוא לידי ביטוי עם RNA מדריך הומולוגי אל האזור של עניין ורציף עם RNA פיגום. נוק של גן באמצעות טכניקה זו דורש מיקוד Cas9 לאזור מסוים בגנום באמצעות RNAs מדריך הסינטטי (sgRNA), ואת גרימת הפסקות גדילים כפולות (DSBs) באתר של עניין. DSBs אלה הם תוקנו לאחר מכן על ידי מכונות לתיקון תאים אנדוגני באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) אשר leמודעת indels שעשוי לייצר מוטציות missense או שטויות ולכן יכול ליצור פסד של ביטוי חלבון פונקציונלי 5. מכיוון שהמערכת הזו מייצרת שינויים גנומיים, זה רק דורש את הביטוי החולף של Cas9 ו sgRNA. עם זאת, רצוי אינדיקטור ניאון יציב כדי לזהות תאים וצאצאיהם המנוהלים באופן זה. יש Lenti- ו רטרווירוסים היתרון של שילוב הדנ&quot;א של עניין ביציבות לתוך התאים המארחים המקיימות ביטוי לטווח ארוך מועברים לתאי הבת במהלך מיטוזה. פרוטוקול זה מתאר את העיצוב והייצור של שני סוגים של שכפול פגום, רטרווירוסים כייל גבוה: חלקיקי lentiviral נגזרות וירוס הכשל החיסוני האנושי (lentivirus) ואלה המבוססים על וירוס murine מאלוני לוקמיה (רטרו-וירוס). בעוד שני הנגיפים הללו מסוגלים לתמוך יציבה מביעה של transgenes הגדול, חלקיקי retroviral יכולים לשלב רק לתוך הגנום duחלוקת תא טבעת עם השפלה של מעטפת הגרעין, ולכן יכולה לשמש ככלי לתייג ולידת עדכני תאי 6. בעוד lentiviruses יש מוניטין של להיות נמוכה יחסית כייל 7, מתודולוגיה זו, ובכלל זה שימוש קפאין 8 במהלך איסוף ויראלי, מייצרת כותרות שגרתי של 10 9 ו -10 10 חלקיקים / מ&quot;ל. יתרון נוסף של lenti- ו רטרווירוסים הוא הסובלנות מוסיף מאוד גדול. האוסף של הפרוטוקולים הבאים מתאר את הליך תכנון lenti או רטרו-וירוס קידוד כתב ניאון, sgRNAs, ו Cas9 כדי לנצל את המערכת CRISPR / Cas9 לשנות DNA וכן להביע חלבון פלואורסצנטי. עכבר נוירוכירורגיה stereotaxic היא שיטת ערך להזרקת וירוסי in vivo ללמוד מורפולוגיה, פונקציה, וקישוריות של נוירונים נגועים. זיהום ויראלי בנוירונים יכול לשמש כדי לתפעל רמות ביטוי על פני תקופה ממושכת של טיםדואר, כגון במהלך התפתחות, וביטוי ניתן לשלוט במדויק על ידי השימוש במערכות שונות סמים מושרים וביטוי ספציפי מונע Cre. פרוטוקול מסוים זה מסביר כיצד להזריק וירוס בעת sgRNA ו Cas9 כדי המפסיד יוצא גן של עניין במוח של עכבר בוגר. עכברים להתאושש מהר מאוד מהליך זה וביטוי של transgene ויראלי ניתן לראות בתוך ההזרקה 48 שעות. עם זאת, הביטוי fluorophore מופיע להגדיל במשך שבועות וכתוצאה מכך רמות מקסימלי בסמוך 3 שבועות לאחר ההדבקה. עכברים לעבור הזרקת stereotaxic ויראלי יכול לשמש התנהגות, אלקטרופיזיולוגיה, או מחקרים מורפולוגיים. בסך הכל, המטרה של נהלים אלה היא להדגים כיצד מפסיד יוצא גן במוח העכבר הבוגר באמצעות ניתוח stereotaxic ו וירוס להביע sgRNA ספציפי Cas9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="519">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Cell Culture Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:64px;width:139px;">293FT cell line</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">R700-07</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;">For Lentivirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">293GP cell line</td>
			<td style="width:93px;">Clontech</td>
			<td style="width:60px;">631458</td>
			<td style="width:228px;">For Retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Iscove&#39;s Modification of DMEM (IMDM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;">10-016-CV</td>
			<td style="width:228px;">Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and&#160; 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="125" rowspan="2" style="height:126px;width:139px;">MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">25-025-CI</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">L-Glutamine solution, 100X (L-Gln)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">25-005-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S)</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:139px;">Polystyrene 10cm plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CC7682-3394</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td style="width:93px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:60px;"> 
			&#160;25-053-CI</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">List of Transfection Reagents</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">5ml polystyrene tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">352054</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:139px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">C69-500</td>
			<td style="width:228px;">Make a 2.5 M solution in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">S271-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">HEPES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:60px;">BP2939-100</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:139px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">S369-500</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:139px;">(Na2HPO4)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="78" rowspan="2" style="height:78px;width:139px;">2X HEPES Buffered Saline (HBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;">500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">filter and store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Caffeine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">C0750-5G</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.22 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">0.45 &#181;M syringe filter unit</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore&#160;</td>
			<td style="width:60px;">SLHP033RS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">60CC L/L Syringe</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">MV60CCLL</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">50 ml Conical Tube</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:60px;">352098</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">polyethylene glycol&#160;&#160; 6000 (PEG 6000)</td>
			<td style="width:93px;">Millipore</td>
			<td style="width:60px;">528877</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:139px;">(10X) Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">National Diagnostics</td>
			<td rowspan="2" style="width:60px;">CL-253</td>
			<td rowspan="2" style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:60px;">1605-0000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Matrigel</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">CB-40230A</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">353046</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">AC41678-5000</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Donor Horse Serum</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:60px;">35-030-CV</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:60px;">X100-500ML</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">10ml serological pipette</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:60px;">357551</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">anti-GFP, rabbit, 488 conjugate</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:60px;">A21311</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:60px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:228px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">&#160;Stereotaxic Surgery Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:139px;">Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">1CCVLS</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:139px;">&#160;Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:60px;"></td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">&#160;JOR580S</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXPARALUBE-O</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">PVP PrepSolution&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">HPIV108208H</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">normal saline&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">DYND500MLSH</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">CTA6</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">Triple antibiotic ointment&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">RXTRIP-OI15</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:139px;">MONOJECT&#174; Needles Soft Pack 25g x 5/8&#34;</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">25058</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:139px;">6-0 silk sutures</td>
			<td style="width:93px;">Med-Vet International</td>
			<td style="width:60px;">MV-711</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

בעקבות &quot;פרוטוקול עיצוב Strand מדריך (sgRNA) עבור CRISPR / Cas9 רטרו-וירוס&quot;, oligos מיקוד רצף מסוים מוכנסים לתוך וקטור שיבוט PXL במורד הזרם של האמרגן hU6 או במורד של פיגום RNA מדריך שימוש באתרי שיבוט BbsI (איור 1, שלב 1). SgRNA זה הוא נכרת אז מן PXL ו מוכנס לתוך עמוד השדרה pRubi באמצעות אתרי BstBI ו פאצ&#39;י (איור 1, שלב 2). לבסוף, אחר sgRNA משובטים לתוך PXL ניתן למקם במורד הזרם של המדריך הראשון pRubi-Guide1 (איור 1, שלב 3), מיקוד לאזור אחר של הגן והגדלת הסיכוי בנוקאאוט דרך NHEJ. אימות של המבנים הנכונים צריכה להיקבע על ידי ניתוח רצף. ברגע מבנה זה הוא עשה, זה יכול להיות ארוז לתוך וירוס בעקבות &quot;פרוטוקול רטרו / Lentiviral Production- CaPO4 שיטה&quot;. אריזה מוצלחת אושר על ידי זיהום של וירוס לתוך HEK293 תאים כדי titer נirus. אם אין ביטוי fluorophore אז הנראה אירעה שגיאה במהלך האריזה של הנגיף. איור 2 הוא תוצאת נציג של 2 רטרווירוסים, GFP אחד להביע ואת mCherry לבטא אחרים, שיתוף מוזרק לתוך gyrus המשוננת של עכבר בילוד (7 ימים) צלם 21 ימים לאחר הזרקה. תיוג של נוירונים עם mCherry או GFP מאפשר הערכה מורפולוגית של מניפולציות גנטיות שונות באותה רקמה, שבו וירוס אחד יכול להביע CRISPR / Cas9 בתיווך KO ואת וירוס בקרה אחרים, להביע fluorophore בלבד. הזרקת Stereotaxic מאפשרת סלקטיביות אנטומיים מדויקות כפי שהודגם על ידי הזיהום הדיסקרטי של קואורדינטות המיועדות, gyrus המשוננת. כשמנתחים חלקים במוח לזיהום, חשוב לשמור הרקמה שמסביב עד שהוא נחוש כי האזור האנטומי הנכון היה נגוע. אם אין כל סימן של זיהום, אז זה אפשרי כי ההזרקה התרחשה אזור שכנהד ניתן לזהות בסעיפים שמסביב. זה גם יכול להיות מועיל כדי לאתר את מסלול מחט למצוא באזור ההזרקה המדויק. וירוסי Pseudotyped VSVG לעתים רחוקות פרושים של השולים של gyrus המשוננת כאשר הוא מוזרק in vivo, נוטה להתפשט לאורך תאי מדביק ציר המקוריים / זנב לאורך gyrus המשוננת כולו, כמו מנותח על ידי שחזור 3D (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> איור 1:. האסטרטגיה שיבוט עבור פלסמיד pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR retroviral אסטרטגיה זו היא זהה עבור פלסמידים lentiviral מבוססי FU. oligos sgRNA הם annealed ונוסף PXL באמצעות אתרי שיבוט BsbI. לאחר רצף על מנת להבטיח כי sgRNA מוכנס לתוך בהצלחה PXL, לעכל את הפלסמיד עם BstBI ו פאצ&#39;י. את הכנס כי הוא נשר (קופסא שחורה) הוא משובטים מכן לתוך ב ויראלי בחזרהאחד (שחור מנוקד קווים) pRubi-Guide1 CRISPR. SgRNA שני גם יכול להיות מוכנס לתוך PXL ולעכל החוצה באמצעות האנזים פאצ&#39;י. זה הוא משובטים מכן לתוך וקטור CRISPR pRubi-Guide1 (קווים מקווקווים אדום) באמצעות אתר פאצ&#39;י. הפלסמיד כתוצאה מכן מכיל שני גדילי מדריך כמו גם אלמנטים ויראלי הצורך, יזמים, ו fluorophores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> איור 2:. הזרקת retroviral של gyrus משוננת עכבר Retroviruses להביע mCherry (אדום) או GFP (ירוק) הוזרקו gyrus משוננת של עכבר P7. 21 ימים לאחר מכן העכברים היו perfused ואת המוח מחולק ומוכתם עבור GFP ו mCherry. (א) תמונת ניאון רחב בתחום 5X מציגה את יחסי הציבורecision של זריקת gyrus המשוננת ואת הספציפיות של נוירונים גרגיר gyrus משוננים תיוג. המורפולוגיה של ההיפוקמפוס ניתן לראות באמצעות מכתים DAPI (הכחול). סרגל קנה מידה מודד 200 מיקרומטר. (ב) תמונה ניאון 10X רחב בתחום מוכיח כי lentiviruses כייל גבוה אלה להדביק מספר גדול של תאים מורפולוגיה אשר ניתן לגשת דרך ביטוי fluorophore. סרגל קנה מידה מודד 100 מיקרומטר. וירוסים (C) להביע GFP או mCherry היו שיתוף מוזרקים לתוך gyrus המשוננת. באמצעות מערכת של רטרווירוסים, אפשר להשתמש וירוס אחד לעשות מניפולציה גנטית כזו מאופיינת GFP ועוד מניפולציה בסימן mCherry, ולאחר מכן להעריך את השינויים יחידים או כתוסף בשל כל וירוס. סרגל קנה מידה מודד 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> איור 3:. האנטומי התפשטות הזרקת lentiviral coinjection Stereotaxic<html> של וירוס ה- GFP-shPten ו וירוס מלא mCherry לתוך המוח של אדם מבוגר PTEN loxP / + העכבר הביא התפשטות ויראלית לאורך הציר המקורי / זנב כולו של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס. הדבר בא לידי ביטוי שחזור 3D של מידת ההזרקה שבו נסגרה קווי מתאר של ההתפשטות ויראלית אותרו למעלה מ -21 קטעי סדרתי (Z = 50 מיקרומטר / קטע) באמצעות תוכנת שחזור. העתקים קונטור היו מיושרים אז כדי ליצור את תמונות 3D עבור כימות היקף. סה&quot;כ התפשטות ויראלית מוצגת בירוק (נפח = 54,730,800 מיקרומטר 3) וממרח משונן-מקומי מוצג סגול (נפח = 27,275,200 מיקרומטר 3). הווירוס מתפשט לאורך מסלול המחט ואת כפיס המוח בצומת של מסלול מחט בנוסף ממלא את ציר הזנב / המקורי של gyrus המשוננת. סרגל קנה מידה מודד 200 מיקרומטר. les / ftp_upload / 53,783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; משלימה וידאו 1. עיצוב של sgRNAs לשבט לתוך עמוד השדרה retroviral ו lentiviral. ב RNA מדריך סינתטי זה למשל עיצוב (sgRNA), רצף הגנום של CHD8 העכבר להוריד מאתר צמח השדה. קודון ההתחלה ומבנה אקסון הם דמיינו אז וקטור NTI. זה מאפשר לנו להעתיק את האזור הגנומי סביב אקסון הקידוד הראשון וזן רצף זה לתוך Benchling. Benchling מאפשר לנו לדמיין כל sgRNAs הפוטנציאל באזור. יתר על כן, לאחר המציינת את האזור הגנומי יש לנו קלט, Benchling יראה לנו ציונים על-היעד מחוץ היעד עבור כל RNA מדריך. המשתמש יכול ולאחר מכן בחר את הרנ&quot;א מדריך עם עשרות מאזני וחוץ-היעד הגבוה ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection at JoVE.com

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

designing-packaging-delivery-high-titer-crispr-retro-lentiviruses-via

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.5K Views.  Geisel School of Medicine at Dartmouth College.  מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר. 

Video: Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

מכרסמים כירורגיה Stereotaxic ועל צער בעלי חיים שיפורים תוצאה של ההתנהגות Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step of the method is to develop a nervous system simulation of specific reflexive behaviors of an appropriate model organism; here we use the American Lobster. Exteroceptive reflexes mediated by decussating (crossing) neural connections can explain an animal's taxis towards or away from a stimulus as described by Braitenberg and are particularly well suited for investigation using the NXT platform.1 The nervous system simulation is programmed using LabVIEW software on the LEGO Mindstorms platform. Once the nervous system is tuned properly, behavioral experiments are run on the robot and on the animal under identical environmental conditions. By controlling the sensory milieu experienced by the specimens, differences in behavioral outputs can be observed. These differences may point to specific deficiencies in the nervous system model and serve to inform the iteration of the model for the particular behavior under study. This method allows for the experimental manipulation of electronic nervous systems and serves as a way to explore neuroscience hypotheses specifically regarding the neurophysiological basis of simple innate reflexive behaviors. The LEGO Mindstorms NXT kit provides an affordable and efficient platform on which to test preliminary biomimetic robot control schemes. The approach is also well suited for the high school classroom to serve as the foundation for a hands-on inquiry-based biorobotics curriculum.

An approach to neural network modeling on the LEGO Mindstorms robotics platform is presented. The method provides a simulation tool for invertebrate neuroscience research in both the research lab and the classroom. This technique enables the investigation of biomimetic robot control principles.

תכנון ויישום מערכת עצבים בסימולציות לגו רובוטים

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

טכניקה אינפוזיה Microsurgery עכבר למשלוח ואלכוהול ממוקד לתוך מערכת העצבים המרכזית<i&gt; דרך</i&gt; עורק התרדמה הפנימי

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית Transcleral

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an approach provides a safe delivery method by-passing the blood brain barrier (BBB), thus allowing treatment with therapeutics with poor BBB-permeability or those for which systemic exposure is not desired, e.g., due to toxicity. CED requires optimization of the catheter design, injection protocol, and properties of the infusate. With this protocol we describe how to perform CED of a solution containing up to 20 &#181;g of an antibody into the caudate putamen of mice. It describes preparation of step catheters, testing them in vitro and performing the CED in mice using a ramping injection program. The protocol can be readily adjusted for other infusion volumes and can be used for injecting various tracers or pharmacologically active or inactive substances, including chemotherapeutics, cytokines, viral particles, and liposomes.

Convection-enhanced delivery (CED) is a method enabling effective delivery of therapeutics into the brain by direct perfusion of large tissue volumes. The procedure requires the use of catheters and an optimized injection procedure. This protocol describes a methodology for CED of an antibody into a mouse brain.

מסירת נוגדנים למוח מורנה באמצעות הסעה-משלוח משופר

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...