עבודה זו נתמכה על ידי פרס Wellcome קריירה בורוז במדעי ביו (AKM), קרן וייטהול מענק מחקר (AKM), מלגת קרן סלואן (AKM), NIH EY019277 (AKM), וכן במימון ניי, חזון הדרכה גרנט, EY013319 ( EAK).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הנוירונים במוח שלם באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה, הכנה שבו הנוירונים מסומנים עם סמנים ניאון משמש. בניסויים שהוצגו כאן אנו משתמשים בקו ה-GFP-M עכבר מהונדס אשר תוויות שכבה 5 תאים פירמידליים 1. 5 שכבת תאים פירמידליים פרויקט תהליכים דנדריטיים לשכבות שטחיות, המאפשר ויזואליזציה של דנדריטים הקוצים הדנדריטים עד לעומק של 300 מיקרומטר מתחת לרמה של פיא. גישה חלופית היא להשתמש בתאים התווית סמנים ויראלי (ראה Lowery et al. שהוגשה יופיטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את סביבת העבודה באמצעות אתנול 70% כלים החיטוי לניתוח aseptic. כיסוי משטח הפעלה עם רוטב נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים עם קוקטייל פנטניל (פנטניל 0.05 מ&quot;ג / ק&quot;ג; midazolam 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג; metatomadin 0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ואחריו מנה רבע Avertin (0.0075 מ&quot;ג / מ&quot;ל) באמצעות נהלים שאושרו IACUC. Pretreat עכברים עם משכך כאבים, עצירות (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) מנוהל תת עורית (SQ). צג את רמת מטוס הרדמה מהתגובה בדיקות לצבוט זנב / הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על בעלי חיים 37.5 ° C באמצעות שמיכה חימום עם מדחום רקטלי המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה עיניים אל העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. הוד העיניים עם גיליון נייר קטנה כדי להגן על העיניים ממקור אור במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, להסיר שיער מהחלק האחורי של הראש (מאחורי האוזניים) לעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הראש של החיה עם יישום רציף של אתנול 70%, ואחריו לשפשף בבטאדין פתרון בבטאדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך L-לחתוך מאחורי האוזניים לאורך הצד או הימני או השמאלי של קו האמצע (תלוי באיזה חצי כדור תהיה הדמיה) לעיניים. מקפלים את העור מעל מהמקום הניתוח. אין להסיר עור כמו העור יהיה sutured בעקבות הפגישה הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר משוך בעדינות את העור כלפי מעלה והרחק מאזור העניין שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד ממנו את periosteum מאזור חשוף של הגולגולת עם מלקחיים נקי או להב microsurgical. בעזרת צמר גפן, מרחו כמות קטנה של כלוריד Ferric 10% הגולגולת לגמרי יבש הממברנה periosteum ולוודא כי הוא הוסר לחלוטין. חשוב הגולגולת יבש לחלוטין, כדי להבטיח שמירה נאותה של דבק (ראה 11). באמצעות מלקחיים או סכין microsurgical, בעדינות לגרד ממנו קרום periosteum יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה של דבק cyanoacrylate סביב החלון הדמיה של צלחת ראש נירוסטה (ראה איור 1) ו להטביע את הצלחת לגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה של מקל עץ כותנה מקלון, כדי להחיל דבק התפרים בתוך החלון הדמיה; לוודא למלא את כל הפערים בין הצלחת הדמיה העקמומיות של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפת דבק מאיץ לתוך החלון. במהירות למחות מאיץ דבק עודף עם מטלית כותנה או קים לנגב. הדבק צריך להיות מוצק לחלוטין לפני הקידוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין דק את הגולגולת בחלון הדמיה באמצעות מקדח שיניים מודבקת עם 0.7 מ&quot;מ נירוסטה בר. קידוח חלופית עם יישום מזדמנים של תמיסת מלח סטרילית 0.9%, כדי למנוע יצירת חום רב מדי על הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון Thin 4x4 מ&quot;מ בגולגולת באמצעות משיכות קטנות על פני השטח את הגולגולת עם המקדחה שיניים. בדוק את הרזון של הגולגולת עם מלקחיים סוף בוטה. פני הגולגולת תהיה הכניסה מעט עם לחץ עדין. עובי הגולגולת אופטימלי עבור הדמיה הוא בין 10 ל 30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הגולגולת הוא דק החלון לנקות את כל הפסולת, המקום מלוחים על הגולגולת. צילום חלון הדמיה עם מצלמה דיגיטלית רכוב על היקף הניתוחים. צילום ושימוש בכלי הדם במוח יסייעו באיתור המיקום למקום צלחת הדמיה עבור הפעלות הדמיה הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחבורה את בעל החיים מעטה 2-הפוטון. החיה צריכה להישאר על השמיכה חימום (עם בדיקה רקטלית) במהלך הפגישה הדמיה כולו. הערה: בעוד תחת סדציה, הגוף הליבה של החיה טמפרטורה ינוע מאוד בהעדר יחידת החימום וכתוצאה מכך פגיעה בקליפת המוח או אולי מוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ שני הפוטונים עם המאי טאי לייזר, משאבה 10W מצב מוצק כוח מקסימלית אולימפוס שונה יחידת Fluoview confocal משמש. המערכת מותאמת במיוחד עבור הדמיה רקמות עמוק גלאי חיצוני מותקנים קרוב אובייקטיבי ככל האפשר, כדי לאפשר גילוי מרבי של הקרינה מהמוח. LUMPlan Olympus FL / IR עדשה 20X/0.95NA אובייקטיבי משמש. מלח 0.9% משמש במהלך הדמיה עבור הטבילה אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ, עם זום דיגיטלי נמוכה (x1) לזהות אזור המכיל נוירונים שכותרתו במאור פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במצלמה דיגיטלית מודבקת פיסת עין המיקרוסקופ, לצלם באזור הדמיה. לחלופין, לשרטט את התבנית vasculature דם. זה הכרחי מחדשלהפוך את המיקום הדמיה אותו בנקודת הזמן שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ערימה הגדלה נמוכה (X20 אובייקטיבי, 512x512 פיקסל; 5 צעד מיקרומטר) באמצעות במידה לעין כל של המוח (בדרך כלל פורש ~ 200 מיקרומטר) מראה את מידת הסתעפות דנדריטים. הערה: את התמונה בהגדלה נמוכה ישמש כדי לאתר את האזור הדמיה בנקודות זמן עוקבות כמו גם כלי הדם דנדריטים לשמור על המבנה שלהם בבעלי חיים צעירים למבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הדמיה (Fluoview, נ &#39;5.0, FV300), להגדיל הגדלה דיגיטלית 8 פי. התאם את X, Y קואורדינטות (מחבת הקואורדינטות) אם יש צורך לאסוף ערימה בהגדלה גדולה אשר יראה מורפולוגיה הדנדריטים מפורט כולל את מיקומי ואת המבנה של הקוצים הדנדריטים. הערות מפורטות לגבי כל אוסף ערימה, כלומר מחבת קואורדינטות, טווח של איסוף, גודל Z-צעד את מספר הצעדים בערימה שלך. הערות אלה ישמשו כאשר חוזרים דנדריט זה או האקסון בנקודת הזמן שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הדמיה, הסר את צלחת הראש בעדינות על ידי הפרדת צלחת מפני השטח הגולגולת. בעזרת מלקחיים, להסיר את כל שאריות הדבק שנותרו על הגולגולת לנגב משטח הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילית 0.9%. לתפור את העור מעל הגולגולת יחד באמצעות # 6 חוט התפירה. אזור נגב עם 70% אתנול. כדי להקל על הכאב במהלך ההתאוששות שלאחר הניתוח, לנהל 0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג כאבים עצירות, SQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום חיות בכלוב נקי מתחת לפנס חום עד מתעורר הוא נייד. חזור החיה לכלוב המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי החי Reimage בשלב מאוחר יותר (זמן שלנו הדמיה נקודות יכול להיות בכל מקום בין 2 ימים חודשים רבים בנפרד), להסיר את התפרים או לפתוח מחדש את העור על הראש באמצעות שיטות aseptic לעיל. השתמש תמונה דיגיטלית של המוח vasculature (שצולמו במועד הניתוח הראשון) כדי לאתר את המיקום הדמיה המקורי. Reaffix נירוסטה headplate (שלבים 10-12). השתמש להב microsurgical בעדינות דקה משם כל עצם שאולי מחדש גדל בין נקודות הדמיה הזמן. אם יש צורך, דק עם מקדח שיניים. הדמיה חלון שקוף של פסולת וליישם ירידה של 0.9% סליין סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Carry החיה מיקרוסקופ שני הפוטונים ולאתר בתחום ההדמיה המקורית. השתמש בצילום דיגיטלי נלקח במהלך הפגישה הדמיה הראשון סיוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית Fluoview ולפתוח את התמונה המקורית בהגדלה נמוכה. לצרף גיליון שקיפות למסך המחשב לשרטט את כלי הדם הגדולים דפוס באמצעות עט שקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה חיה ויישר מחדש את הדם בכלי הדם לדפוס שירטט על הסרט שקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי Reimage 8x zoomed במבנים, לפתוח את מחסנית שנאספו הרצוי מההפעלה הדמיה הקודם. סקיצה המבנה (axonal כלומר, דנדריטים, גליה) על סרט שקיפות, מודבקת על מסך המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרב 8x מהתמונה חי ולהגדיר את המחבת קואורדינטות הפרמטרים הדמיה היום הראשון. בהתאם דיוק של יישור מיקום הגדלה נמוך, ייתכן שיהיה צורך גם לשנות את הזווית של התמונה במקצת. לאחר המבנה המבוקש נמצא, להתאים את המבנה לדפוס שירטט שלך בהגדלה גבוהה. אסוף את Z-מחסנית עם גודל צעד מספר זהה של Z-מחסנית תמונות לניתוח שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 29 ו - 30 עד שכל התמונות בהגדלה גבוהה מחדש שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההדמיה תושלם, חזור על שלבים 22-24. Re-הדמיה ניתן לחזור במהירות של עד 2 נקודות זמן נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ביבר אגף לרפואה של בעלי חיים המעבדה של אוניברסיטת רוצ&#39;סטר בית הספר לרפואה ורפואת שיניים, ב ההסמכה מלא על ידי האגודה הערכה וההסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה, הבינלאומי (AAALAC) ונמצאים ציות לחוק המדינה, החוק הפדרלי מדיניות NIH. </li></ol> נציג תוצאות ב-GFP-M עכברים להביע, קבוצת משנה של שכבה 5 תאים דנדריטים פירמידה ותהליכים המתאימים יכול בקלות להיות דמיינו באמצעות 2-פוטון סריקת לייזר מיקרוסקופית (2PLSM) 1. כאן אנו הפגינו הכנה דליל-הגולגולת שבו הגולגולת מעל המיקום הרצוי הדמיה מדולל ל ~ 10-30 מיקרומטר. בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו בבירור לדמיין דנדריטים קליפת המוח ועמוד השדרה בקליפת המוח הראייתית שלם לניתוח אקוטית או כרונית (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ראש מותאם אישית צלחת הבסיס. (א) להציג לראש בראש בהתאמה אישית ועל צלחת הבסיס המשמשים להכנת דליל, ניתוח בגולגולת. (ב) להציג צד של הראש מחוייט צלחת הבסיס. (C, D) סכמטי מפורט תמונה של צלחת ראש. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="איור 2" /> <strong&gt; באיור 2. תוצאות נציגת 2PLSM הבאים הכנה גולגולת דקה. (א) דנדריטים צילמו in vivo בקליפת המוח הראייתית של עכבר ה-GFP-M מהונדס באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. התמונה היא הקרנה של תמונה אחת להשיג כל 5 מיקרומטר מן פיא לעומק סופי של 175 מיקרומטר. אזור ארוזות מייצג את האזור מוגדל ב (ב) ו - (ג) צילמו ביום 0 (D0) וארבעה ימים מאוחר יותר (D4). (D, E) הגדלה גבוהה של הסניף הדנדריטים ארוזות B ו-C הוכחת שדרה יציב (ראשי חץ לבן), איבד / קוצים retracting (ראשי חץ אדום) ואת עמוד השדרה החדש (ראשי חץ ירוק). ברים סולם = א 200 מיקרומטר, B, C. 20 מיקרומטר, D, E. 5 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדמיה כרונית באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה הופכת פופולרית יותר ויותר טכניקה ללמוד שינויים מורפולוגיים מופעלות במהלך 2-5 הפלסטיות. כאן אנו מדגימים הכנה דליל, גולגולת לעקוב הקוצים הדנדריטים מזוהה במוח העכבר על ימים שלמים הדמיה שונים. בפרוטוקול זה, הגולגולת נו?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

בשנת vivo הדמיה באמצעות שני פוטונים לייזר מיקרוסקופיית (2PLSM) מאפשר לימוד של תאים חיים תהליכים עצביים במוח שלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה של אותו אזור של המוח במספר נקודות זמן (הדמיה כרונית) עם רזולוציה מיקרוסקופי המאפשר מעקב של הקוצים הדנדריטים שהם מבנים קטנים המייצגים את רוב אתרי מעוררים postsynaptic במערכת העצבים המרכזית. היכולת בבירור לפתור מבנים קורטיקליים קנס על מספר נקודות זמן יש יתרונות רבים, במיוחד במחקר של פלסטיות המוח שבו שינויים מורפולוגיים על הסינפסות שיפוץ מעגל עשוי לעזור להסביר את המנגנונים. בחומר וידאו משלימים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית in vivo הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת. ההכנה סחוט הגולגולת היא גישה פולשנית, אשר ימנע נזק אפשרי ואת הדורה / או קליפת המוח, ובכך להקטין את תחילתה של תגובה דלקתית. כאשר בפרוטוקול זה מבוצע כהלכה, אפשר בבירור לעקוב אחר השינויים המאפיינים עמוד השדרה הדנדריטים במוח שלם על פני תקופה ממושכת.

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  University of Rochester. בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית In vivo הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת.

Video: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

טכניקת חלון קליפת מוח, גולגולת דקה יותר עבור<em&gt; In Vivo</em&gt; טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית הדמיה

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

מדידת קישוריות במסלול הראייה העיקרית ב לבקנות האדם באמצעות הדמיה דיפוזיה מותח tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

הכנת אלקטרודות גירוי עצבי היקפי להשתלה כרונית בחולדות

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...