עבודה במיקרוסקופ אלקטרונים ב נג מעבדה הוא בחלקו על ידי מענקי תמיכה NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 ו P50GM082250 (א &#39;פרנקל)), וכן מענק של קליפורניה בסן פרנסיסקו תוכנית המחקר פריצת דרך ביו, הזדמנות פרס ופרס טכנולוגיה חדשה.

1. הכנת EM רשתות לציפוי פחמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס זכוכית גדול עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית לרדת טיפה אחת של הקולודיון (~ 20μl, 2% אצטט amyl, מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים, פנסילבניה, ארה&quot;ב) על פני השטח של המים. וממנו יתפשט כדי ליצור שכבת פלסטיק דקה על המים / משטח האוויר; הערה: ירידה הראשון וממנו ניתן להשתמש כדי לנקות את השטח מכל מים חלקיקי אבק. לאחר הסרת הסרט מירידה הראשונה, פני המים ברור של אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום EM רשתות, 400 או 200 גילדר רשת רשתות Cu שנרכשו טד פלה בע&quot;מ (ארה&quot;ב), אחד אחד על שכבת פלסטיק צף על פני המים, אנחנו בדרך כלל מקום 50 ~ 100 רשתות דפוס ואריזה קרוב, עם נוצצים בצד של הרשת כלפי מטה לתוך שכבת פלסטיק (איור 1A). הערה: 400 רשתות רשת טובים שגרתי רשתות כתם שלילי EM, ואילו 200 רשתות רשת טובים לאיסוף תמונות זוג הטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים עוגהce נייר עם ממדים מעט גדול יותר מאשר באזור שבו רשתות מונחות על שכבת פלסטיק. הנח את הנייר בזהירות על גבי הרשת (איור 1B), ולחכות עד הנייר הופך רטוב לחלוטין (איור 1C). הערה: סוגים שונים של נייר יש קליטה שונה תעריפי המים. חשוב כי העיתון לא לספוג מים מהר מדי. לדוגמה, נייר פילטר רגיל לא טוב למטרה זו, משום שהוא סופג מים מהר מדי ועושה הרבה קמטים. הסרט פחמן עשויה מנייר מקומט אינו שטוח, ולכן לא טוב לאיסוף תמונות זוג להטות עבור אקראי שחזור להטות חרוטי 3D. צריך לבדוק בעיתונים שונים כדי למצוא אחד מתאים. במעבדה שלנו, יש לנו כבר משתמש הניירות ופנקסים קנה בחנות מכולת מקומית. לפעמים נייר העיתון נמצא גם להיות מתאים. אפשרות נוספת היא להשתמש בנייר אורז עבה יחסית המשמש קליגרפיה סינית / יפנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לעשות חתכים על הסרט פלסטיק סביב וקרובהעיתון ספוג. מיד לאחר מכן, להשתמש זוג מלקחיים כדי להרים את הנייר עם רשתות דחוקה בין הסרט נייר פלסטיק. הנח את הנייר בצלחת פטרי עם רשתות פונה כלפי מעלה לייבוש באוויר (איור 1D); הערה: חשוב לתת הנייר אוויר יבש. ייבוש מהיר מדי יוצר קמטים רבים בעיתון. </li></ol> 2. פחמן רשתות ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכונת ציפוי פחמן המשמשים במעבדה שלנו היא 208C Cressington גבוהה טורבו אבק פחמן Coater (טד פלה). המערכת שלנו מצוידת בצג עובי הסרט Cressington, אשר מודד את עובי הסרט פחמן מצופה מבוסס על העיקרון כי תדירות נדנוד של גביש קוורץ משתנה על ידי המסה של סרט שהופקדו על פני השטח שלו. עם זאת, פרוטוקול המתואר כאן אינו מחייב לפקח על עובי, שכן הוא לעתים קרובות לא זמין במעבדה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדד מוט הפחמן באמצעות מחדד (טד פלה) ופחמן מוטות לטעון פחמן ציפוי מ &#39;achine (איור 2A). שני מוטות, אחד עם קצה חד והשני עם סיום שטוח ממוקמים אחד נגד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מריחת גריז על החצי הריק של האזור חלבית של שקופית זכוכית ולמקם אותו לצד רשתות (איור 2 ב). רק כמחצית שטח הקפואה של שקופיות הזכוכית צריך להיות מכוסה גריז ואקום. הערה: שטח עם גריז ואקום לא ישתנה צבע לאחר ציפוי פחמן. הניגוד בין האזורים הסמוכים עם או בלי שומן ואקום מספק הערכה של עובי של פחמן מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הנייר עם רשתות על הבמה של מכונת ציפוי פחמן. מניחים את השקף זכוכית לצד רשתות (איור 2C). הערה: אפשר גם להעביר תחילה את רשתות מצופה בסרט פלסטיק זכוכית שקופית לפני הציפוי, במקרה רשתות רבות ליפול מן העיתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבת ואקום החדר, ולהמתין עד הוואקום מגיע לרמה של 10 -5 Torr. הערה: ציפוי עם ואקום נמוך לעתים קרובות יוצרת ניצוצות רבים, וכתוצאה מכך רבים חלקיקי פחמן גדוליםאת הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת זרם לאט מאוד. קצה חד של המוט פחמן יהיה הראשון להיות אדום ואז לבן עולה הנוכחי. אין לצפות את קצה בהירות גבוהה ישירות בעין בלתי מזוינת. עצור הגדלת הנוכחי כאשר הציפוי מתחיל. השקופית זכוכית ישתנה צבע לבן אפור בהיר ואחר כך אפור כהה. החושך של השקופיות וקושרת את עובי הסרט פחמן מצופה להיות. בטל הנוכחי לעצור כאשר עובי הציפוי הרצויה הושגה (איור 2 ד). הערה: 1) לאחר חזר ציפוי תהליכים חמצני, פחמן מצופה מבפנים צנצנת פעמון זכוכית יכול להכהות את צבעו. זה הופך את הסרט פחמן מצופה להופיע עבה יותר ממה שהיא באמת. 2) אחת מוט פחמן חידד ניתן להשתמש לציפוי מספר. חדות של קצה מצטמצם בהדרגה לאחר כל ציפוי. הזרם המרבי מושפע חדות של מוט הפחמן. מוט מחודד טרי עם קוטר קטן יותר דורש יחסית נמוךהנוכחי להתאדות פחמן. מאוחר יותר ציפוי עשויה לדרוש מעט הנוכחי גבוה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vent תא ואקום להסיר רשתות מצופה לשימוש מאוחר יותר. הערה 1. השיטה מדויקת יותר של שליטה על עובי הפחמן היא באמצעות צג עובי הסרט. לחלופין, ניתן לכייל צבע איכותית נגד עובי מדויק נמדד על ידי המסך. עובי פחמן שימושי טכניקה זו היא בין 3 ל 7 ננומטר. </li></ol> זוהי שיטה פשוטה וקלה להכין כמות גדולה של רשתות פחמן מצופה, בדרך כלל ~ 100 רשתות לכל הכנה. רשתות מכילים שכבת פלסטיק דקה, אשר בדרך כלל אינו משפיע על האיכות של התמונה הצבעונית שלילי. עם זאת, רשתות שהוכנו בשיטה זו אינם מתאימים cryoEM. שכבה זו של פלסטיק ניתן להסיר על ידי השריית רשתות לתוך כלורופורם במשך כמה שעות. 3. הכנת formate uranyl פתרון (0.75%) עבור שליליים כתם EM. פרוטוקול מפורטשתואר לעיל 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 37.5mg של formate uranyl לתוך ספל קטן; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל מים רותחים ומערבבים במשך 5 דקות בחושך; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10μl 5M NaOH, להמשיך לערבב במשך 5 דקות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון באמצעות מזרק מסנן (Fisherbrand, 13mm מזרק מסנן, 0.2μm, ניילון לא סטריליים, מספר קטלוג 09-720-5), ולאחסן את פתרון סינון בצינור פלקון 8ml מכוסה בנייר אלומיניום; . Uranyl הערה אבקת Formate ניתן לרכוש למדעי מיקרוסקופית אלקטרונים (Hatfield, PA), מס &#39;קטלוגי 22451. Formate פתרון Uranyl אור רגיש צריך להישמר במרחק של אור ישיר, למשל על ידי כיסוי הצינור פלקון עם רדיד אלומיניום. פתרון מוכן טרי יש צבע צהוב בהיר (איור 3A). פתרון הכתם יכול להיות כל הזמן על הספסל במשך שבוע עד שבועיים לפני שהוא מתחיל מזרז. Formate Uranyl הוא חומצי עם pH ~ 4. הוספת NaOH מגדיל את ה-pH, אך הוספתו מהר מדיאו עודף יכול לגרום הכתם כדי לזרז. בנוסף להפקת לעומת זאת, formate uranyl מתקן גם את מדגם חלבון. בגלל קצב קיבוע מהיר כל כך, ה-pH נמוך בדרך כלל לא משפיע על תצורות החלבון הכללית או היווצרות חלבון מורכב 7. </li></ol> 4. פרוטוקול להכנת שלילי רשת כתם EM. פרוטוקול זה מתואר בפירוט בעבר 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוהר פריקה פחמן רשת מצופה, באמצעות PELCO easiGlow GlowDischarge המערכת (טד פלה Inc, ארה&quot;ב). הנוכחי נעשה שימוש הוא 15 mA ורשתות הם זוהר שוחרר עבור הערה 30. שניות. Glow-משוחררים רשתות יש להשתמש מיד לאחר פריקת זוהר. לעתים קרובות אנו משתמשים ברשתות בפחות מ 2 שעות לאחר השחרור זוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Two מקום 20μl טיפות של מים מזוקקים ושתי טיפות של תמיסת 25μl formate uranyl על פיסת parafilm (איור 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק זוהר, שוחרר לרשת באמצעות הפוכה כוח אנטי נימי מלקחיים עם המכוניתבון מצופה צד פונה כלפי מעלה. הערה: יש צורך להשתמש אנטי נימי מלקחיים. אחרת, מדגם נוזלי יהיה נשאב ממנו רשתות בכוח נימי בין מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מדגם חלבון 2μl לרשת, זוהר משוחררים, ולחכות 30 שניות. הערה: זמן ההמתנה ומשך הפריקה זוהר להשפיע על הריכוז של החלבונים adsorbed ברשת. דגימות מדולל מאוד לדרוש יותר פעמים ספיחה. עם זאת, ספיחה ממושכת עשויה לשנות את ריכוז חיץ מאז אדי מים. כדי להשיג פיזור החלקיקים נאות ברשת דורש קצת ניסוי בגישה שגיאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם את המדגם בעזרת נייר פילטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת במשטח לרשת כדי טיפת מים ולאחר מכן למחוק את המים עם נייר סינון. חזור עם ירידה של 2 מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת במשטח רשת לירידה הראשון של כתם בקצרה. כתם את הפתרון הכתם בנייר מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת במשטח רשת לירידה השני של הכתם למשך 20 שניות. כתם off פתרון הכתם בנייר מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הרשת באמצעות ואקום. הערה: אפשר גם להשאיר רשתות על הספסל או במנדף כימי לייבוש באוויר. היתרון של ואקום יבש הוא שאפשר לראות את רשתות ב EM מיד. חפץ אפשרי שנוצר על ידי ייבוש מהיר הכתם אינה אחידה. </li></ol> 5. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקרוסקופ משמש הפגנה זו היא T12 Tecnai (פיי החברה) מצויד במצלמת 4K Gatan x CCD 4k. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לבדוק את היישור של המיקרוסקופ לפני הכנסת מדגם: הערה: יש צורך פעם אחת בלבד לכל EM ​​הפגישה. בשנת מיקרוסקופ מודל, ליד יישור מושלם ניתן לשמור קודם לכן. טוען כזה קובץ יישור צריך לשחזר את יישור מיקרוסקופ למצב כמעט מושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את רשת ב EM מחזיק את הדגימה להטות יחיד סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס לתוך מחזיק CompuStage של T12. חכו במחזור שאיבה כדי להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחזיק לתוך העמודה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס הדגימה ולקבוע defocus הרצוי, בדרך כלל, 1.5um. הערה: ההתמקדות יכולה להיות מושגת באופן ידני או על ידי התמקדות בשיטת בניגוד מינימום או באמצעות מצלמת CCD ללכוד תמונות לחיות לחיות לחשב ספקטרום פורייה כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטת תמונה באמצעות מצלמת CCD; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב תמונות של דגימות שלילי חלבונים מוכתם, החלבונים נראים לעתים קרובות עם ניגודיות לבנה, כלומר צפיפות לבן על רקע כהה. שים לב כי בעוד ריכוזי חלבון באזורים שונים של אותה רשת הם בדרך כלל די דומה, אחד מקיים רמות שונות של כתמים באזורים שונים של הרשת זהה. לפעמים באזורים יכול היה מכתים אחיד או אפילו מכתים חיובי (החלבון מופיע כהה על רקע בהיר), בעוד כמה תחומים אחרים יש כתם מושלמת. זה לעתים קרובות יש צורך לחפש את הרשת כדי לאתר אזור טוב הדמיה. </li></ol> 6. נציג תוצאות דוגמאות של תמונות טובות אופייני שלילי staדגימות עומד לבחינה, הטחול סוס פריטין (איור 4 א), Fab (איור 4B), ה -20 archaeal הפרוטאזום (איור 4C) ו הנוקלאוזום (איור 4D), מוצגים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" /> באיור 1. הכנת רשתות פחמן מצופה עבור שלילי כתם א&quot;מ.) הצבת רשתות EM אחד על אחד דפוס אריזה סגורה על פני השטח של הסרט הקולודיון. ב) הצבת פיסת נייר מעט גדול יותר בשטח של רשתות. ג) המתן עד הנייר נרטב לגמרי. ד) להרים את הנייר יחד עם רשתות לייבוש האוויר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" /> באיור 2. . ציפוי רשתות EM עם פחמן) הגדרת המאייד פחמן: מקום שני מוטות פחמן במנגנון ציפוי, עם מוט אחד (משמאל) חידד עד קצה נקודה. מוט אחרים (מצד ימין) יש משטח שטוח לבוא במגע עם קצה של נקודה אחת ב ההפוך sIDE. ב) מקום כמות קטנה של שומן ואקום בצד אחד של זכוכית שקופית טיפחו. האזור בתוך המסגרת השחורה יש שומן ואקום. ג) הגדרת רשתות לציפוי. שקופיות הזכוכית משמשים כדי להחזיק את נייר העמדה. ראש החץ מצביע את האזור עם שמן ואקום. ד) לאחר הציפוי, הצבעים של השקופית עם גריז ואקום מכוסה אינו משנה את הצבע. לעומת זאת מצביע על עובי של פחמן מצופה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" /> באיור 3. הממחישות את ההליך מכתים שלילי). טרי formate מוכן (משמאל) פתרון uranyl שקוף ללא סימן של משקעים. אחרי 1 ~ 2 שבועות, ולהתחיל לצבור משקעים בתחתית בתחתית של התחתית. ב) מקום שתי טיפות (~ 25μl) של מים מזוקקים ושתי טיפות של תמיסת uranyl formate בפיסת parafilm. השתמש זוג אנטי נימי מלקחיים להחזיק זוהר משוחררים פחמן מצופה רשת EM עם הצד פחמןמעלה. ירידה של המדגם (~ 2μl) ממוקם ברשת. ג) אחרי המתנה של 30 לשנייה, כתם הפתרון עם נייר סינון. ד) תהפכו את הרשת לגעת בצד מדגם של רשת עם טיפת המים הראשונה. חזור על השלב C ו-D כדי להשלים את התהליך של מכתים. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות EM תמונות של דגימות חלבון מוכתם שלילי.) הטחול פריטין סוסים, ב &#39;) שבר מחייב האנטיגן (Fab), ג) ה -20 archaeal הפרוטאזום ו-D) הנוקלאוזום. כל התמונות נרשמו עם הגדלה זהה. סרגל קנה מידה הוא 20nm.

<ol>
	<li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy.">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes.">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases.">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li><li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li><li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure,+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli.">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li><li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li><li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations.">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כתם שלילי EM הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד 3D מבנים של חלבונים מטוהרים דגימות, כגון שימוש להטות חרוטי אקראי 8 שיטה, אשר דורש איסוף זוג תמונות עם אחד מן הדגימה מוטה 60 מעלות ואחד מאותו אזור אבל untilted, כדי לחשב 3D שחזורים של קומפלקסים macromolecular. בנוסף, מכתים שלילי EM יכולים להיות יישומים רבים אחרים, כגון בדיקה דו ממדי (2D) גבישים של חלבונים בממברנה 9, חזותי קומפלקסים חלבונים ב 10 תצורות שונות, או פשוט המאפשר הדמיה ההומוגניות / או הטרוגניות של חלבונים מטוהרים מדגם ובכך מתן פידבקים לשיפור תהליכי טיהור חלבונים, וכו &#39;זה יכול להיות assay עוצמה ביוכימאים. במאמר זה, הצגנו את הפרוטוקולים החל בהכנת פחמן מצופה רשתות לאיסוף תמונות של דגימות חלבון שלילי מוכתם אלקטרון במיקרוסקופ. כפי שהודגם כאן,ההליך הוא פשוט למדי וקל בצע. אם מנסים לחשב 3D שחזורים של המדגם הנצפה על ידי שיטה אקראי להטות חרוטי, יש צורך לרכוש תמונות זוג הטיה. עם זאת, אם ביצוע ניתוח חלקיק יחיד המטרה, תמונות untilted מרובים יספיק. בשני המקרים, עיבוד תמונה נוספת נדרשת וזה מעבר להיקף של מאמר זה וידאו. כמו כל שיטה, יש וריאציות על הפרוטוקולים. Formate Uranyl עובד טוב מאוד מגיב כמו כתם שלילי ברוב המקרים. אצטט Uranyl הוא עוד מגיב נפוץ כתם שלילי. זה עובד דומה מאוד formate uranyl, אבל עם גודל גרגר גדול, במקרים רבים, לעומת נמוך יותר formate uranyl. היתרון של שימוש אצטט uranyl היא שהפתרון נמשך יותר formate uranyl. לא צריך להכין טרי כל פתרון שבועות אחד או שניים. שני formate uranyl ו אצטט הם חומציים. החשש הברור הוא כיpH נמוך יכול לגרום שינויים במדגם החלבון הנחקר. שני פתרונות כתם לפעול גם fixatives חלבון. מחקר קודם הראה כי גם חלבון דגימות לתקן במהירות 7. זה קיבעון מהיר הופך את ה-pH נמוך פחות חשוב. במהלך תהליך של צביעה, מדגם חלבון הופך להיות קבוע לפני pH נמוך יכול לגרום שינויים. עם זאת, אחרים ריאגנטים כתם שלילי, כגון אמוניום molybdate וחומצה phosphotungstic, עשוי להניב תוצאות טובות יותר עבור מכתים דגימות כאשר pH נמוך היא דאגה 7. שני molybdate אמוניום וחומצה phosphotungstic יש pH ניטרלי כ, אבל בניגוד דגימות חלבון שנוצר על ידי כתמים אלה הוא בדרך כלל נחות formate uranyl.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> הקולודיון </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים, פנסילבניה, ארה&quot;ב </td><td> 12620-30 </td><td> 30 מ&quot;ל, 2% Acetate amyl </td></tr><tr><td> גילדר Cu רשתות </td><td> טד פלה Inc, ארה&quot;ב </td><td> G400/G200 </td><td> 400/200 רשת </td></tr><tr><td> Cressington 208C ואקום גבוה טורבו Coater פחמן </td><td> טד פלה Inc, ארה&quot;ב </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> פעמיים הצביעה פחמן מוט </td><td> טד פלה Inc, ארה&quot;ב </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl formate </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים, פנסילבניה, ארה&quot;ב </td><td> 16984-59-1 </td><td> 99.9% טוהר </td></tr><tr><td> PELCO easiGlow מערכת GlowDischarge </td><td> Tעורך פלה Inc, ארה&quot;ב </td><td> 91000 </td><td> רכישה בבית המרקחת המקומי </td></tr><tr><td> Whatman # 1 מסנן נייר </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 09-805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים (EM), של מוכתם הן שליליות או קפוא דגימות ביולוגיות hydrated, הפך לכלי צדדי הביולוגיה המבנית 1. בשנים האחרונות שיטה זו זכתה להצלחה רבה בחקר מבנים של חלבונים מתחמי macromolecular 2, 3. לעומת אלקטרונים cryomicroscopy (cryoEM), שבו קפוא דגימות חלבון hydrated המוטבעים בשכבה דקה של קרח זגוגי 4, מכתים שלילי הכנה פשוטה מדגם שיטה שבה דגימות חלבון המוטבעים שכבה דקה של מלח מיובש מתכות כבדות כדי להגדיל הדגימה לעומת 5. הניגוד משופרת של כתם שלילי EM מאפשר בדיקה של דגימות ביולוגיות קטן יחסית. בנוסף לקביעת תלת ממדי (3D) המבנה של חלבונים מטוהרים או קומפלקסים חלבונים 6, שיטה זו יכולה לשמש למטרות הרבה יותר. לדוגמה, כתם שלילי EM ניתן להשתמש בקלות לדמיין מטוהריםדגימות חלבון, קבלת מידע כגון ההומוגניות / ההטרוגניות של המדגם, היווצרות של קומפלקסים חלבונים או מכלולים גדולים, או פשוט כדי להעריך את איכות הכנה חלבון. במאמר זה וידאו, אנחנו מציגים הפרוטוקול המלא ל באמצעות EM לצפות מדגם חלבון מוכתם שלילי, החל בהכנת רשתות פחמן מצופה עבור שלילי כתם EM לרכישת תמונות של דגימה מוכתמת שלילית מיקרוסקופ אלקטרונים המופעל על המתח מאיץ 120kV. פרוטוקולים אלה שימשו במעבדה שלנו שגרתי ניתן בעקבות בקלות על ידי משתמשים טירון.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition at JoVE.com

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

דגימות חלבון חזותי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי כתם (EM) הפך פופולרי שיטת ניתוח מבניות. זה שימושי עבור ניתוח מבניות כמותיים, כגון חישוב שחזור 3D של מולקולות הנלמד, וגם לבחינה איכותית של איכות ההכנות חלבון. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת רשתות EM, מכתים את המדגם באופן חזותי את המדגם אלקטרון במיקרוסקופ. משתמשי המחשב השני יכול לעקוב אחר הפרוטוקולים הללו בקלות לנצל שלילי כתם EM כמו assay שגרתי, בנוסף מבחני ביוכימיים אחרים, להערכת דגימות חלבון שלהם.

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

58.4K Views.  University of California San Francisco. דגימות חלבון חזותי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי כתם (EM) הפך פופולרי שיטת ניתוח מבניות. זה שימושי עבור ניתוח מבניות כמותיים, כגון חישוב שחזור 3D של מולקולות הנלמד, וגם לבחינה איכותית של איכות ההכנות חלבון. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת רשתות EM,...

Video: Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

הכנה ואפיון ננו-פוטזומים לצורך מלכודת הידרופיזיאליות של חלבונים ביולוגיים

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

שימוש במגנטומטריה לניטור התאגדות תאית והתפרקות ביולוגית של חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתטיים כימית

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...