אנו מודים אלן טסקר (USDA-כנימות, ריברדייל, MD), סטיבן קומפטון (Clemson), שרי Aultman (Clemson), קרייג רמזי (USDA-כנימות, פורט קולינס, CO), ובטי Marose (UMD) לקבלת סיוע בהשגת דגימות . אנו מודים לתלמידים אנדרו אדריאן (UA-Huntsville) ודרק Thacker (UA-Huntsville) על עזרתם בבדיקת פרוטוקול זה, ויוסף Herdy עבור עבודתו צילומי וידאו. עבודה זו מומנה על ידי דגים הלאומי קרן חיות הבר.

<ol>
	<li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Geographical Atlas of World Weeds. , (1979).</li><li>CABI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crop+Protection+Compendium.">Crop Protection Compendium.</a> Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , (2007).</li><li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+-+Biology,+ecology,+and+management.">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li><li>Talley, S. M., Cseke, L. J., Zink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostic+technologies+for+invasive+plants.">Molecular diagnostic technologies for invasive plants.</a> CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. , 27-28 (2009).</li><li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -. K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogongrass+in+the+United+States:+History,+ecology,+impacts,+and+management.">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li><li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa.">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li><li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , (2003).</li><li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+from+shaded+and+exposed+habitats.">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li><li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities.">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li><li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+(Imperata+cylindrica)+viability.">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li><li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States.">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li><li>Talley, S. M., Ramsey, C. L., Zink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimentally+assessing+the+invasive+potential+of+plants.">Experimentally assessing the invasive potential of plants.</a> CPHST Laboratory 2009 Annual Report. , 29-30 (2009).</li><li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lled&#243;, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics+of+Miscanthus,+Saccharum+and+related+genera+(Saccharinae,+Andropogoneae,+Poaceae)+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers.">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li><li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants.">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li><li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+(Poaceae)+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data.">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li><li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+boric+acid:+a+Tris-free,+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis.">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li><li>Chou, C. -. H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+(L.)+Beauv.+var.+major+(Cogongrass)+populations+in+Taiwan.">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

<html> הילדים בארה&quot;ב תעשיות נוף ניזונים טיפוח ומכירת מיני צמחים אקזוטיים רומן. זה, יחד עם הגלובליזציה הגוברת של הסחר, מגביר את הסיכוי זן צמחים פולשניים יהיה להיכנס, להקים, ופרש בארה&quot;ב היכולת לווסת פדרלי צמחים כאלה מסתמך על מידע שהוא לעיתים קרובות אינה זמינה, כולל פוטנציאל להפוך פולשנית , טקסונומיה נכונה, ואבחנה גנטית בין מינים יליד לאזרח. בגלל הידע שלנו על צמחים פולשניים בדרך כלל מוגבל, צמחים מיובאים עם מאפיינים פולשניים מוסתרים הוכנסו רק ברצון ללמוד לאחר מכן כי הם פולשים משאבים חקלאיים וטבעיים שלנו. פרוטוקול זה נועד לטפל בבעיות כאלה הקשורים עם י cylindrica זנים ידי מתן השיטה הראשונה מולקולרית פשוטה שיכולה במדויק להבחין בין wild-type cogongrass וצורת חזרה של עמיתו JBG נוי שלה. &quot;jove_content&gt; עבור פיתוח של פרוטוקול זה, wild-type cogongrass נאסף אוכלוסיות שהתאזרח בבית יחידת קריק יערנות בריכה סנטה רוזה במחוז ליד ג&#39;יי, פלורידה ביוני 2008. JBG היה רכש מהמשתלה מסחרי (הציפור הכחולה משתלת, Inc ..) בחודש יוני 2008 וכן מאוסף של בעל הבית בקולומביה, מיזורי JBG חוזר התקבלו בחצר מוזיאון קמפבל הגיאולוגית ב אוניברסיטת קלמסון, SC ביוני 2008; מאוניברסיטת פארק ריברדייל, MA ביוני 2009; ו מן החצר הקדמית של בעל הבית בקולומביה, מיזורי בשנת 2009 (מזוהה על ידי לילנד Cseke). כל הצמחים נשמרו בחממה ממוקם באוניברסיטת אלבמה בהאנטסוויל (Huntsville, AL). רצף גנטי של ה-DNA שנאספו מצמחים אלה כלל בהשוואות עומק של 9 אזורים דנ&quot;א עצמאיים הנפוצים לצמחים ברקוד 2. בכל מקרה, רצף של JBG היו במשחק 100% לאלו של JBG לחזור, ובכך עוזרלוודא כי אכן JBG לחזור לטופס, ירוק פולשנית. רק ITS גרעיני trnL-F אזורים הכלורופלסט יש הבדלים שניתן להשתמש בהם כדי להבחין בין גנטית cogongrass ו JBG. באזור שלה יש בסך הכל 3 SNPs (פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד) בין cogongrass ו JBG, ואילו באזור trnL-F יש 2 SNPs ו 2 InDels (הוספות ומחיקות). אלה הבדלים גנטיים שונים מותר ספציפיים primers ה-PCR יש לפתח שיכולים להבחין בין wild-type cogongrass ו JBG חוזר. את התוצאות הכי אמין הגיעו primers שמקורם באזור trnL-F plastid. כך, פרוטוקול זה מבוסס על ההבדלים בין רצף ה-F-trnL אזורים בגנום הכלורופלסט של cogongrass, JBG וחזרו JBG (איור 4). כדי לסייע ביצירת פריימרים ספציפיים יותר את הזנים הנדונים ועל מנת למנוע תוצאות חיוביות שגויות ממינים הקשורים באופן הדוק, אלידוע וסעד trnL-F רצפים של א זנים cylindrica הושוו trnL-F רצפים ממינים דשא הקשורים (43 רצפים עצמאיים מ 29 מינים, כגון Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, קמיליה Miscanthus, Saccharum officinarum, halepense דורה). אמנם, בחנו מגוון ספציפיים רצפים פריימר על 29 מינים של הדשא, את הספציפיות של מגוון ספציפיים primers לא נבדקה באופן מקיף על יכולתו להגביר את ה-DNA מרוב מיני דשא אחרים. כתוצאה מכך, רקמת משמש להפקת DNA יש לזהות היטב כמוני cylindrica לפני החל בפרוטוקול זה. אם הדשא לא ניתן לזהות או cogongrass או JBG, אז אנחנו מציעים רצף של מוצר ה-PCR על מנת לוודא כי הם רצפים התאמה מדויקת כדי cogongrass או JBG. נכון לעכשיו, השיטה המדויקת ביותר כדי לוודא את זהותו של הדגימה הדשא נתון הוא לבצע PCR על שניהם לאrnL-F ואזורים שלה, שייבדק על ידי רצף של מוצרי ה-PCR והשוואה של רצפים על רצפים של מינים ידועים לזהות במדויק. ה-DNA יכול להיות מוגבר באמצעות primers בקרה המפורטים בפרוטוקול זה (לאזור trnL-F) או פריימרים אחרים הזמינים בפרסומים אחרים 13-15. סידור העבודה הוא הרבה יותר ועלות אינטנסיבית יותר באמצעות הליך פשוט שלנו. האיכות של פריימרים המשמשים PCR היא קריטית להצלחת ההליך. עשינו את primers עבור הליך זה זמין אלכסוני ביו, Inc ( <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). יתרון הזמנת את primers מ ביו אלכסוני היא שהם לאחסן מספר רב של aliquots של צבע יסוד אחד מתוך סדרת ייצור זהה מדגם כמו primers השתמשנו לאופטימיזציה במעבדה שלנו. כתוצאה מכך, primers לא רק את רצף זהה, אך לאהיי באים הרבה הייצור המדויק ששימשה בפרוטוקול זה. באמצעות פריימרים ממגרש זאת, יכול לסייע במניעת משתנים חיצוניים בהליך הנובעים הבדלים באיכות של primers PCR. כמו כן, בעוד אחרים polymerases Taq אמור לעבוד בסדר עבור ה-PCR, איכות פולימראז Taq בשימוש תהיה השפעה על איכות תוצאות ה-PCR. כדי לאפשר מרקם טוב יותר PCR ריאגנטים, יש לנו מותאם פרוטוקול באמצעות חומרים כימיים מ Clontech. 2 Advantage פולימראז (Clontech, Mountain View, קליפורניה, חתול # 639201 או 639202) הוא תערובת של פולימראז חזקים, Taq חם ההתחלה האנזים הוכחה קריאה המסייע לספק סגוליות גבוהה amplifications מדויקות יותר. כי פרוטוקול זה מסתמך על ה-DNA הכלורופלסט, אשר ירש אימהי של עשבים, אירועים הכלאה בין גנוטיפים cogongrass ו JBG לא יכול ליפול בפח עם הליך הזיהוי המולקולרי שלנו. במקרים בהם hypridization הוא suspected, מומלץ להשתמש באזורים גרעיני שעברו בירושה משני ההורים. הנפוץ ביותר לא plastid האזור משתנה לשקול genotyping המפעל הוא האזור גרעינית ריבוזומלי ITS 13-15,17. נכון לעכשיו, אנו מתקדמים לקראת ריבוב הגברה של האזור הכלורופלסט trnL-F עם זה של אזור הגרעין שלה בצינור PCR אחת. ריבוב plastid עם אזורים דנ&quot;א גרעיני היה פוטנציאל לעקוף את מגבלות השימוש לבד, עם זאת, שיטות אלו דורשות אופטימיזציה והערכה נוספת כדי לקבוע היתכנות על מקרה לגופו. השימוש כמותי בזמן אמת PCR (QPCR) וטכנולוגיות חדשות יותר, כגון אלומות מולקולריות (בדיקות פריימר ניאון), הם גם העריכו כמו שיטות genotyping כשל ומדויק הצמח. הפרוטוקול המובא כאן מספק גישה מהירה ואמינה להבחין JBG לחזור מזה של wild-type cogongrass. אנו ממליצים להשתמשRS פרוטוקול זה לפנות אלינו על מנת לדווח על תוצאות הנובעת משימוש של פרוטוקול זה. מידע משותפים אלה יסייעו לספק מידע על התפלגות JBG חוזר. זה גם יעזור הרגולטורים ב USDA לקבל החלטות מושכלות על פעולות שניתן צריך לעקוף את התפשטות פוטנציאל הכלאה של זנים פולשניים מאוד cogongrass.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> DNeasy הצמח מיני קיט </td><td> Qiagen, ולנסיה, CA </td><td> 69104 או 69106 </td><td> כל הגנומי מכובד במפעל ערכת ה-DNA כי התשואות DNA באיכות טובה אמורה לפעול על נהלים אלה. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0578 </td><td> בקרה חיובית קדימה פריימר </td></tr><tr><td> trnL (אקסון &#39;5), C </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0579 </td><td> הפוך פריימר בקרה חיובית </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0864 </td><td> קדימה wild-type cogongrass פריימר </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0865 </td><td> להפוךwild-type cogongrass פריימר </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0866 </td><td> קדימה JBG ו JBG לחזור פריימר </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> אלכסונית ביו, Inc </td><td> 3-0867 </td><td> הפוך JBG ו JBG לחזור פריימר </td></tr><tr><td> היתרון ultrapure PCR dNTP Mix </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> 2 היתרון פולימראז </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639201 או 639202 </td><td> טוב הוכחה לקריאה, חם תחילת Taq פולימראז </td></tr></tbody></table>

a pcr-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) הוא אחד מעשרת המפעלים המובילים פולשניים הגרועים ביותר בעולם, המשפיעים לרעה על משאבים חקלאיים וטבעיים ב 73 מדינות שונות ברחבי אפריקה, אסיה, אירופה, ניו זילנד, אוקיאניה ואמריקה 1-2. Cogongrass טפסים במהירות, להפיץ, דוכני monodominant כי את מקומו של מגוון רחב של מיני צמחים מקומיים בתורו לאיים על בעלי חיים מקומיים התלויים המין העקורים צמחים מקומיים עבור מספוא ומחסה. כדי להוסיף על הבעיה, מגוון נוי [א cylindrica var. koenigii (Retzius)] משווק באופן נרחב תחת שמות &quot;Rubra&quot; Imperata cylindrica, אדום ברון, ועשב הדם היפנית (JBG). מגוון זה הוא סטרילי putatively ו פולשנית ונחשב נוי רצוי עלים בצבע אדום שלה. עם זאת, בתנאים הנכונים, JBG יכול לייצר זרע בר קיימא (קרול Holko, 2009 תקשורת אישית) והוא יכול לחזור ירוק אניטופס nvasive כי היא לעתים קרובות נבדל cogongrass כפי שנדרש על המאפיינים הייחודיים של מגוון wild-type פולשנית 4 (איור 1). זה עושה את הזיהוי באמצעות מורפולוגיה משימה קשה אפילו מאומנים היטב הטקסונומים הצמח. חזרה של JBG כדי פנוטיפ ירוק אגרסיבי הוא גם לא נדיר. באמצעות השוואות רצף של קידוד אזורי ב-DNA משתנה גם גרעיני הכלורופלסט, יש לנו אישר כי JBG חזר לסורו פולשנית ירוק בתוך מדינות מרילנד, דרום קרוליינה, מיזורי. JBG נמכרה ושתל במצב כמעט בכל ביבשת ארה&quot;ב שבה אין התפשטות פעיל cogongrass. היקף הבעיה לחזור ב לא הבין היטב כי הצמחים הם חזרו והרסו מתועד לעתים קרובות. יישום של פרוטוקול זה מספק שיטה מולקולרית כדי לזהות JBG חוזר והוא יכול לסייע לשמור על אלו סוגים של שיתוף המתרחשיםND ואולי והכלאה. Cogongrass הוא outcrosser מחייבים, וכאשר חצה עם גנוטיפ אחר, יכול לייצר רוח התפזרו קיימא הזרעים להפיץ cogongrass למרחקים רחבים 5-7. JBG יש גנוטיפ שונה במקצת מאשר cogongrass ו יוכלו ליצור כלאיים קיימא עם cogongrass. כדי להוסיף על הבעיה, JBG קר יותר בצל סובלנית יותר cogongrass 8-10, ואת זרימת גנים בין שני זנים עשוי ליצור כלאיים, כי הם יותר אגרסיביים, בצל סובלנית, וקרה הארדי מ wild-type cogongrass. בעוד wild-type cogongrass כיום פושט מעל 490,000,000 דונם ברחבי העולם, בארה&quot;ב ובדרום מזרח הוא פושט על 500,000 דונם והוא מסוגל לכבוש ביותר של ארה&quot;ב כפי שהוא מתפשט במהירות צפונה בשל נישה רחבה שלה 3,7,11 הפוטנציאל הגיאוגרפי. הפוטנציאל של מעבר גנטית היא דאגה רצינית עבור התוכנית הפדרלית USDA-כנימות שבוע רעילים. נכון לעכשיו, משרד החקלאות, כנימות אוסר JBG במדינות ש&quot;שפה יש מכת cogongrass הגדולות (למשל, פלורידה, אלבמה, מיסיסיפי). עם זאת, למנוע שני סוגים של שילוב יכול להוכיח קשה יותר cogongrass ו JBG להרחיב הפצות שלהם. יתר על כן, חלוקת JBG לחזור אינו ידוע כרגע, ללא יכולת לזהות סוגים אלה באמצעות מורפולוגיה, כמה מכת cogongrass עשוי להיות תוצאה של JBG חוזר. למרבה הצער, שיטות מולקולריות שוטפות של זיהוי בדרך כלל לסמוך על AFLP (מוגבר אורך פולימורפיזמים שבר) ואת רצפי DNA, הן אלו זמן רב ויקר. כאן, אנו מציגים 1 חסכונית ואמינה המבוססת על שיטת ה-PCR genotyping מולקולרית במדויק להבחין בין cogongrass ו JBG לחזור.

Watch this Scientific Journal Video about A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica at JoVE.com

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

אנו מספקים פרוטוקול חסכונית ומהירה genotyping מולקולרי מעסיקה מגוון ספציפיים primers ה-PCR כי ה-DNA היעד רצף ההבדלים בתוך אזור trnL-F הכלורופלסט spacer להבחין בין סוגים שונים של<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass) שלא ניתן להבחין על ידי המורפולוגיה לבד. זנים אלו כוללים את העשב מזיק רשומים פדרלי, cogongrass מקרוב בנושא, התפשטות רחבה במגוון נוי, אני<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (עשב דם יפני).

PCR מבוסס genotyping שיטה להבחין בין זנים wild-type ו נוי של Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

JoVE Journal

Biology

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

31.4K Views.  The University of Alabama, Huntsville. אנו מספקים פרוטוקול חסכונית ומהירה genotyping מולקולרי מעסיקה מגוון ספציפיים primers ה-PCR כי ה-DNA היעד רצף ההבדלים בתוך אזור trnL-F הכלורופלסט spacer להבחין בין סוגים שונים של Imperata cylindrica (Cogongrass) שלא ניתן להבחין על ידי המורפולוגיה לבד. זנים אלו כוללים את העשב מזיק רשומים...

Video: A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר<em&gt; CMAH</em&gt; נוק- out עכברים.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...