Biz örnek edinme konusunda yardım için Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), ve Betty Marose (UMD) teşekkür . Biz video filme yaptığı çalışmaların öğrencileri Andrew Adrian (UA-Huntsville) ve Derek Thacker (UA-Huntsville) bu protokol test kendi yardım için, ve Joseph Herdy teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Balık ve Yaban Hayatı Vakfı tarafından finanse edildi.

1. Örnek Toplanması ve Korunması Bu yöntem geliştirilmiş ve taze, dondurulmuş, kurutulmuş yaprak ve son zamanlarda doku kullanılarak test edildi. <ol><li> Cogongrass ve / veya ot türlerinin belirlenmesi konusunda uzmanlaşmış bir taksonomisti yardımı ile dokulara JBG tanımlayın. Onun parlak kırmızı yapraklı, süs JBG görsel dönmek wild-tip cogongrass ve JBG ayırt etmek kolaydır, ancak cogongrass ve JBG dönmek birbirinden neredeyse ayırt edilemez niteliktedir. Cogongrass ve JBG rücu fenotipi yeşil, uzun yapraklı, oldukça büyük ve uzun rizomlar ve JBG 12 (Şekil 1) daha fazla yaprak alanı var. </li><li> Taze yaprak dokusu en bol ve en yüksek kalitede DNA sağlar ve tarla veya sera yetiştirilen I. tahsil edilebilir cylindrica bitkiler. Taze doku kullanılacak ise, bozulması önlemek için toplama 3 saat içinde DNA ayıklayın. Aksi takdirde, depolama, keepi için doku hazırlanmasıdoğrudan güneş ışığı ng doku serin ve dışarı. </li><li> Daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu için dokuların saklamak için en uygun yöntem hemen -80 ° C de doku dondurmak ve depolanmasıdır. Dondurulmuş doku DNA ekstraksiyon önce çözülmeyi izin vermeyin. Çözülme önlemek için DNA ekstraksiyon taşlama adımları önce sıvı azot için dondurulmuş doku aktarın. </li><li> Bir -80 ° C derin dondurucuda kullanılabilir değilse, kuru doku hemen. Kuru depolanması için, bir kağıt zarf halinde doku yerleştirmek ve kurutulmuş silika jel veya oda sıcaklığında diğer aktif kurutucular içinde zarfı depolamak. Karıştırılır göstergesi silika küçük bir miktarı olmayan gösteren bir silika silika için tamamen kurutulmuş ve uygundur sağlayacak olan bitki doku kurutma. </li><li> En az 10 kat ağırlık taze yaprak daha silika jel kullanın. Bitki dokusunda 24 saat içinde kuru olmalıdır. DNA nitelik ve nicelik (herbaryum numunenin durumunda olduğu gibi, zaman içinde kuru depolanması aracılığıyla azalırs). </li></ol> 2. DNA Ekstraksiyonu Bir küçük değişiklik ile üreticinin talimatlarına; bitki dokularından DNA ayıklamak için, DNeasy Bitki Mini Kit (Cat # 69.104 veya 69.106 Qiagen, Valencia, CA) izleyin. Bunun yerine her sütun için önerilen en az 100 mg taze doku veya daha az 20 mg kuru doku kullanarak, uygun tüplere (kuru doku veya&gt; 20 mg), taze veya dondurulmuş doku 100 mg aktarmak den az 100 mg eziyet ve ekstraksiyonu için. Nükleer ve plastid DNA aynı anda elde edilir. <ol><li> Bu işlemler başlamadan önce, etanol doğrulamak tamponlar AP3 / E ve AW ilave edildi. </li><li> Soğutulmuş bir havanda in taşlama ile sıvı azot üç tur kullanılarak ince bir toz olarak taze dondurulmuş doku yaprağı (ya da kuru yaprak doku&gt; 20 mg)&gt; 100 mg öğütün. Başlangıç ​​materyali yetersiz bozulması ya da yetersiz lizis olabilir, aynı zamanda DNA düşük verimler yol açar. Dikkatle Tiss öğütmekue ve çok fazla doku ile sütunlar aşırı değildir. </li><li> Tampon AP1 400 ul ve her bir tüp, bir küçük bir raf yerleştirilebilir RNaz A. 4 ul içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne taze dondurulmuş doku (ya da kuru toz dokudan 20 mg) ila 100 mg donmuş toz transferi tüp başına doku ağırlığı doğru izlemek için dengelemek. </li><li> Vorteks veya titreme örneği (ler) karıştırılır ve 65 &#39;de 10 dakika inkübe ° C arasında, 2-3 kere inkübasyon sırasında ters tüp (s). </li><li> Her numune için Tampon AP2 130 ul ekleyin. Ters tüp (s), birkaç kez ve buz üzerinde 5 dakika süreyle inkübe ile karıştırılır. </li><li> Pipetleyin her biri ayrı bir QIAshredder Mini spin kolon içine lizat ve 2 ml toplama tüpüne (kiti ile sağlanır) her sütuna yerleştirin. 2 20.000 xg (~ 14.000 rpm) dk ve her yeni bir tüp (kit ile birlikte) içine fraksiyon akış yoluyla herhangi oluşan pelet bozmadan aktarmak için Santrifüj kolon (lar). </li><li> / Tampon AP3 1.5 hacimleri ekleE, ve pipetleme ile karıştırın. </li><li> 2 ml&#39;lik toplama tüpüne bir DNeasy Mini spin kolon karışımın içine 650 ul aktarın. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar). Her numune için kalan karışımı ile bu adımı yineleyin. </li><li> Yeni bir 2 ml toplama tüp (ler) içine spin kolon (lar) yerleştirin ve her sütunun üst Tampon AW 500 ul ekleyin. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar). </li><li> Her sütunun üst Tampon AW başka 500 ul ekleyin. 20,000 xg (~ 14.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüjleyin. Bu aşama, böylece PCR inhibe edebilir tamponlar içinde bulunan herhangi bir kalıntı etanol kaldırarak, kolon kuruyacak. </li><li> Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj örnek tüp için her spin kolon aktarın. Elüsyon için her sütun başına 100 mikrolitre Tampon AE ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kolonu (ler) inkübe edilir. DNA toplamak için 6000 x g&#39;de (~ 8.000 rpm) 1 dakika boyunca santrifüj; kolon (s). </li><li> Bu elüsyon 200 ul numune elde etmek için aynı 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine DNA elüt edilerek, bir kez adımları tekrar. Kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklayın DNA örnekleri. DNA konsantrasyonları doku tipi ve depolama koşullarına bağlıdır. Tampon AE 200 ul toplam ile elüt DNA zaman optimum verimleri elde edilmiştir, ancak konsantrasyonları elüsyon hacmi kadar az 50 ul kadar indirgenmiş halinde arttırılabilir. </li></ol> 3. DNA Kalite ve Miktar doğrulanması <ol><li> Bir spektrofotometre veya florimetre ve jel elektroforezi kullanılarak PCR kurulum öncesinde çıkarılan DNA kalitesi ve miktarı test edin. Bu, sonraki adımların başarı sağlamaya yardımcı olur. </li><li> Bir spektrofotometre, DNA testi kalite ve miktar kullanma. İyi DNA verimleri 50 ile 150 arasında olmalıdır 2.0 yakın 260/280 ve 230/280 oranlarında ul / ng. Bir örnek olarak, Şekil 2 NanoDrop spektrofotometre (ThermoScientific kullanılarak iyi kalitede sonuçlarını göstermektedir<html> , Wilmington, DE). </li><li> Standart% 1 agaroz jel kullanılarak elektroforez yürütün. RNA kontaminasyonu çok az şeritli (Şekil 3) hiçbir nispeten geniş bant (&gt; 10 Kb) varlığını doğrulayın. </li><li> DNA konsantrasyonu yüksek, seyreltik DNA örnekleri sonraki adım için 70 ng / ul için ise. </li></ol> 4. PCR primerleri Bu protokolde kullanılan PCR primerleri cogongrass ve JBG genotiplerinin plastid trnL-F ayırıcı bölgesi arasındaki farklılıklar sekansı esas alır. Bu farklılıklar SNP&#39;lerin formu (tek nükleotid polimorfizmleri) ve benzersiz dizilerinin siteleri (Şekil 4) primerler bularak çeşitli spesifik primerler gelişimine izin indellerin (Eklemeler ve Silmeler) gelir. <ol><li> Primerlerin kalitesi PCR sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Saygın bir şirketten Sipariş astarlar. Biz Eğik Bio, Inc (bizim astar siparişWww.obliquebio.com/web/ :/ / &quot;target =&quot; _blank &quot;sadece standart tuzsuzlaştırma prosedürleri talep&gt; http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL). </li><li> trnL-F pozitif kontrol primerleri: Bu primer seti 11-13 en çim takson plastid trnL-F boşluk bölgesi güçlendirir ve iyi bir pozitif kontrol (bir 890 bp bant ile sonuçlanan) olarak hizmet vermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Dizi </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> 5&#39;-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;ekzon)-C </td><td> 5&#39;-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> Yabani tip cogongrass primerler: Bu primer seti cogongrass özeldir ve genotiplerinin JBG arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 595 bp bir bantta set sonuçları. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Sequence </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 5&#39;-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 5&#39;-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> JBG ve JBG primerler dönme: Bu primer seti genotipine JBG özeldir ve cogongrass arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 594 bp bir bantta set sonuçları. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Dizi </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 5&#39;-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2, </td><td> 5&#39;-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> -20 ° C, uzun süreli saklanabilir 100 mM stok çözümler elde etmek için nükleaz içermeyen GKD 2 O yeterli hacmi her astar yeniden süspanse edin. </li><li> PCR kurulum adımları önce 12 mM her astar stok sulandırınız. </li></ol> 5.. PCR Kurulum DNA ekstraksiyon PCR reaksiyonlarında primer seti Yukarıdaki her biri kullanılarak amplifiye edilir. Tüm PCR iyi çalışıyoruz ve bir grup oluşturabilir sağlamak için bir pozitif kontrol ekleyin. Reaktiflerin hiçbirinin istenmeyen DNA ile kontamine sağlamak için bir negatif kontrol ekleyin. Negatif kontrol yapılması şablonu içeren ve hiçbir bant üretimi neden. <ol><li> Termalcycler blok ve örnek arasında daha iyi ısı transferi sağlamak için ince duvarlı PCR tüpleri tüm reaksiyonlar hazırlayın. Biz kontaminasyonu önlemek için piyasada bulunan aerosol-free pipet uçları kullanmanızı öneririz. </li><li> Her izole DNA örneği için, aşağıda listelenen sırada ICE aşağıdaki reaktifler ekleyerek 0.2-ml ince duvarlı PCR tüpleri yukarıdaki primer setleri her kullanılarak 50 ul PCR reaksiyonları kurdu. Birden fazla numune hazırlanmaktadır, özel durum tüm reaktifleri içeren bir kokteyl yapmakDNA örneğinin bütün reaksiyonlar arasında düzgün koşulları kurmak. <table border="1"><tbody><tr><td> PCR Reaktif </td><td> İkinci Cilt </td><td> Final zenginleştirmesi </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen GKD 2 O </td><td> 40.5 ul </td><td></td></tr><tr><td> Avantaj 2 10X PCR Buffer (Clonetech, CA) </td><td> 5.0 ul </td><td> 10% (v / v) </td></tr><tr><td> Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix (10 mM her biri Clonetech, CA) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Primer 1 (GKD 2 O 12μM) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.24 uM </td></tr><tr><td> Primer 2 (GKD 2 O 12μM) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.24 uM </td></tr><tr><td> Avantaj 2 Polimeraz Mix (Clonetech, CA) </td><td> 0.5 ul </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> DNA ekstraksiyonu(70 ng / reaksiyon; gerektiği gibi GKD 2 O ses seviyesini ayarlamak) </td><td> 1.0 ul </td><td> 1.4 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Toplam: 50.0 ul </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Tüm PCR iyi çalıştığından emin olmak için, pozitif kontrol primerler kullanılarak pozitif kontrol kurmak. Bu primer seti dönmek ve diğer otlar JBG, cogongrass, JBG için eşit derecede iyi çalışıyor ve 890 bp olan bir bant ile sonuçlanacaktır. </li><li> Bunun yerine DNA ekstraksiyon GKD 2 O kullanılarak, pozitif kontrol olarak ayarlanır aynı kontrol primer kullanılarak negatif kontrol ayarlamak. Tüm reaktifler DNA kirletiyorsa serbest ise, bu reaksiyon bir grubu ile sonuçlanacaktır. </li><li> DNA konsantrasyonu düşük olması durumunda, fazla DNA nükleaz içermeyen GKD 2 O miktarı 50 ul kadar toplam reaksiyon hacmi getirmek için kullanılan ayarlayarak, her bir reaksiyonun eklenebilir. DNA fazla 5 ul (% 10 kullanılmamalıdır r başına toplam hacmi)eaction, DNA örnekleri içindeki mümkün safsızlıklar PCR reaksiyonları inhibe edebilir. </li></ol> 6. PCR Bisiklete binme <ol><li> Aşağıdaki PCR bisiklet parametreleri kullanarak ısıtılmış bir kapak ile donatılmış bir termalcycler PCR amplifikasyon yürütmek. Biz standart sıcaklık tırmanışı koşulları ile çalışacak şekilde ayarlanır Mastercycle yanlısı S termalcycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) kullanın. Herhangi bir kalite termalcycler iyi yapmalıdır. <table border="1"><tbody><tr><td> Devir </td><td> Tavlama denatürasyon </td><td> Polimerizasyon </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 de 2 dakika ° C </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 ° C de 30 saniye </td><td> 30 sn 61 ° C de 90 saniye 68 ° C&#39;de 35 döngü </td></tr><tr><td> 3 </td><td></td><td> 68 de 5 dakika ° C </td></tr><tr><td colspan="3"> Örnek kaldırılır ° C&#39;ye kadar, 4 at tut </td&gt; </tr></tbody></table></li><li> DNA kalitesine bağlı olarak gerektiği gibi PCR (primer tavlama sıcaklığı, uzatma süreleri ve devir sayısı dahil) için koşulları optimize, astar, PCR ile Taq polimeraz veya türü kullanılır. Biz optimum belirlerken bir degrade yetenekli thermocycler kullanmanızı öneririz sıcaklıklarda tavlama. </li><li> Kullanılan termalcycler ısıtılmış bir kapağı yoksa, PCR devir esnasında buharlaşmasını önlemek için her numunenin üst mineral yağı 1 damla ekleyin. </li></ol> 7. PCR Ürünlerinin Jel Elektroforez Analizin sonuçları görselleştirme, standart elektroforez ile% 1 agaroz jel üzerinde ayrı PCR ürünleri. <ol><li> Her amplifiye PCR ürün 5 ul ile standart bir DNA yükleme tamponu 2 ul (tipik olarak bir ya da 5x 6x çözeltisi) birleştirir. </li><li> E yapılan EtBr (DNA boyama etidyum bromid) ihtiva eden bir% 1 agaroz jel üzerine örnekleri Yükither TAE veya SB (sodyum borat) tampon sistemleri 16. Biz, 100 ml% 1 agaroz (0.1 ug / ml) başına 10 mg / ml EtBr stok solüsyonu 1 ul kullanabilir. </li><li> Boya ön ulaşıncaya kadar ~ 120V azından örnekleri çalıştırmak ¾ jel toplam uzunluğunun. </li><li> UV ışık altında (kısa dalga UV ışık kutusu gibi), uygun bir parçası amplifiye edildi görmek için çıkan bantları kontrol edin. </li><li> Kullanılabilir bir foto-dokümantasyon sistemi veya kamera kullanarak jel ve çıkan bantları belgeleyin. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar PCR ürünleri görselleştirme üzerine, cogongrass JBG ya JBG (Şekil 5) döndürülmesi ile karşılaştırıldığında özel bir bantlama desene sahiptir. Her bir DNA örneği için, trnL-F pozitif kontrol primer seti ~ 890 bp tek bir yüksek yoğunluklu bant neden. Bu, tüm PCR iyi çalıştığını doğrular. Benzer şekilde, negatif kontrol (hiçbir şablon) reaksiyonu herhangi bir astar s için bir bant içermelidiret kullanılır. Bu durum, reaktifler hiçbiri kontamine oldu doğrular. DNA vahşi tip cogongrass, JBG spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken cogongrass spesifik primer seti ~ 595 bp tek bir grup ile sonuçlanacaktır kullanılarak bir PCR reaksiyonunda elde edilirse. DNA JBG türetilen ya JBG döndürülmesi durumunda cogongrass spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken Keza, JBG spesifik primer seti kullanılarak bir PCR reaksiyonunda azından ~ 594 bp&#39;lik bir tek grubu ile sonuçlanacaktır. JBG ve JBG geri intikal özdeş nükleik asit dizisi olduğu için, dolayısıyla aynı bant desenleri olacaktır. Birçok örnekte, aynı zamanda bir jel üzerinde karşılaştırılacak olursak, biz böylece daha kolay olumlu sonuçlar için numunelerin tarama yaparak, birbirlerine yanında kurulan her astar türetilen tüm örnekler çalıştırmanızı öneririz. Döner JBG ve JBG arasındaki morfolojik farklılıklar oldukça açıktır (yaprak ve JB küçük boy örneğin kırmızı renk<html> PCR sonuçları aynı olacak ise G vs yeşil rengi, büyük boy ve JBG agresif büyüme dönmek), böylece, JBG çeşitleri bitkisel özellikleri kullanarak ayırt etmek kolaydır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig1.jpg" /> Şekil 1. Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) yetiştirilen sera Karşılaştırılması, I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir NanoDrop spektrofotometre kullanılarak teyit DNA örnekleri bir örnek. Bakılmaksızın kullanılan spektrofotometrenin, 260/280 oranı 1.8 &#39;e yakın olmalı ve 260/230 oranı 2.0 yakın gerektiğini unutmayın. ontent &quot;&gt; <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig3.jpg" /> Şekil 3. DNA örnekleri% 1 agaroz jel üzerinde standart jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı. Bir ticari DNA işaret boyutu analizi için kullanıldı. Lane # 4 bulaşmasını ve bazı RNA kirlenme gösteren, düşük kaliteli DNA bir örnektir. <a href="/files/ftp_upload/3265/3265fig4_lg.jpg"><img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig4.jpg" /></a> Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) ile trnL-F bölgelerin Şekil 4. Sıra diziler I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass). Dikey siyah oklar SNP ve indellerin kaynaklanan dizileri farklılıklar göstermektedir. Yatay yeşil oklar cogongrass özgü PCR için kullanılmıştır yabanıl tür cogongrass primerlerin pozisyonları göstermektedir. Yatay kırmızı oklar po göstermektedirJBG ve JBG ve sonrası olarak bölünmüştür JBG özgü PCR için kullanılan primerler döner. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3265/3265fig5.jpg" /> Şekil 5. Cogongrass-ve JBG spesifik primerlerin ile yanı sıra trnL-F pozitif kontrol ve bir şablon negatif kontrol herhangi bir araya DNA örnekleri JBG ve geri JBG cogongrass türetilen PCR ürünlerinin jel elektroforezi, temsili sonucu.

<ol>
	<li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Geographical Atlas of World Weeds. , (1979).</li><li>CABI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crop+Protection+Compendium.">Crop Protection Compendium.</a> Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , (2007).</li><li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+-+Biology,+ecology,+and+management.">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li><li>Talley, S. M., Cseke, L. J., Zink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostic+technologies+for+invasive+plants.">Molecular diagnostic technologies for invasive plants.</a> CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. , 27-28 (2009).</li><li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -. K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogongrass+in+the+United+States:+History,+ecology,+impacts,+and+management.">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li><li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa.">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li><li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , (2003).</li><li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+from+shaded+and+exposed+habitats.">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li><li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities.">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li><li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+(Imperata+cylindrica)+viability.">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li><li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States.">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li><li>Talley, S. M., Ramsey, C. L., Zink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimentally+assessing+the+invasive+potential+of+plants.">Experimentally assessing the invasive potential of plants.</a> CPHST Laboratory 2009 Annual Report. , 29-30 (2009).</li><li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lled&#243;, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics+of+Miscanthus,+Saccharum+and+related+genera+(Saccharinae,+Andropogoneae,+Poaceae)+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers.">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li><li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants.">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li><li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+(Poaceae)+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data.">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li><li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+boric+acid:+a+Tris-free,+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis.">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li><li>Chou, C. -. H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+(L.)+Beauv.+var.+major+(Cogongrass)+populations+in+Taiwan.">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

<html> ABD fidanlık ve peyzaj sanayi egzotik ve yeni bitki türlerinin yetiştirilmesi ve satan gelişirler. Ticaretin giderek artan küreselleşme ile birleştiğinde Bu, bir istilacı bitki türleri, girmek kurmak ve ABD&#39;de federal invaziv olma potansiyeline de dahil olmak üzere, genellikle mevcut değildir bilgiye dayanır bu tür bitkilerin düzenleme yeteneği yayacağı şansını artırır , yerli ve vatandaşlığa taksonlar doğru taksonomisi ve genetik çeşitlilik. Invaziv bitkilerin bilgimiz genelde sınırlı olduğundan, gizli invaziv özellikleri ile ithal bitkiler isteyerek sadece onlar bizim tarım ve doğal kaynaklar işgal daha sonra öğrenmek için getirilmiştir. Bu protokol, I. ile ilişkili bu sorunlara yönelik amaçlar doğru wild-tip cogongrass ve süs JBG muadili rücu formu ayırt edebilirsiniz ilk basitleştirilmiş moleküler yöntem sağlayarak cylindrica çeşitleri. Bu protokolün geliştirilmesi için jove_content &quot;&gt;, wild-tip cogongrass 2008 yılının Haziran ayında Jay, FL yakınlarındaki Santa Rosa County Pond Creek Orman Biriminde vatandaşlığa nüfus toplanmıştır. JBG ticari bir kreş (Bluebird Kreş, Inc temin edildi .. Riverdale, MA University Park ve Haziran 2009 yılında;;) 2008 yılı Haziran ayında yanı sıra Columbia ev sahibi koleksiyonundan, MO JBG Haziran 2008&#39;de Clemson University, SC de Campbell Jeoloji Müzesi avlusunda elde edilen döner ve Columbia, 2009 yılında MO (Leland Cseke tarafından tanımlanan) bir ev sahibi ön avludan. Tüm bitkiler Huntsville, Alabama Üniversitesi (Huntsville, AL) bulunan bir serada tutuldu. Bu bitkilerden toplanan DNA Genetik sekans genellikle barkod tesisleri 2 için kullanılan 9 bağımsız DNA bölgeleri derinliği karşılaştırmalarda dahil. Tüm durumlarda, JBG ile dizilimler, böylece yardımcı JBG geri olanlar için bir% 100 idi eşleşmeJBG gerçekten yeşil, invaziv forma dönmek doğrulayın. Sadece nükleer ITS ve kloroplast trnL-F bölgelerde genetik cogongrass ve JBG ayırt etmek için kullanılabilir farklar var. TrnL-F bölgede 2 SNP ve 2 indellerin (eklemeler ve silmeler) sahipken ITS bölgesi, cogongrass ve JBG arasında 3 SNP (tek nükleotid polimorfizmleri) bir toplam vardır. Bu genetik farklılıkların doğal tip cogongrass ve JBG döner ayırt edebilirsiniz ki geliştirilecek çeşitli spesifik PCR primerleri izin verdi. En güvenilir sonuçları plastid trnL-F bölgede elde edilen primerler gelmiş. Dolayısıyla, bu protokol cogongrass, JBG ve kloroplast genomunun trnL-F bölge ve JBG (Şekil 4) döndürüldü arasındaki farklar dizisi dayanmaktadır. Söz konusu çeşitlerin daha spesifik primerler oluşturmak yardımcı olmak ve yakından ilgili türler, al yanlış pozitif önlemek içinI. l bilinen trnL-F sekansları cylindrica çeşitleri ile ilgili çimen türleri (29 türünden 43 bağımsız dizileri, örneğin, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-iş buldum, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorgum halepense) den trnL-F dizileri ile karşılaştırıldı. Biz çim, çeşitli özel primerlerin özgüllük 29 tür arasında çeşitli spesifik primer dizilerinden araştırılmasına karşın kapsamlı diğer birçok ot türleri DNA çoğaltılması için, yeteneği gidilmemiş. Sonuç olarak, DNA çıkarılması için kullanılan doku dikkatle I. olarak tespit edilmelidir cylindrica önce bu protokol başlangıç ​​için. Çim, sonra cogongrass veya JBG ya olarak tespit edilemiyorsa, biz dizileri cogongrass veya JBG için tam bir eşleşme olduğundan emin olmak için PCR ürünü sıralama öneririz. Şu anda, belirli bir otu numunenin bir kimlik doğrulama en doğru yöntem t her iki PCR gerçekleştirmek için olanRNL-F ve ITS bölgeler, dizisi PCR ürünlerinin doğrulanması ve kesin takson bilinen dizileri dizilerinin karşılaştırılması izledi. DNA kontrolü Bu protokol ayrıntılı primerler (trnL-F bölge için) ya da diğer primerler diğer yayın 13-15 bu kullanılabilir kullanılarak büyütüldü edilebilir. Sıralama çok daha fazla emek ve basitleştirilmiş usuller kullanılarak daha yoğun bir maliyettir. PCR için kullanılan primerler kalitesi prosedürün başarısı için kritiktir. Biz Eğik Bio, Inc (edinilebilir Bu prosedür için primerler yaptık <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). Eğik Bio gelen primerler sipariş için avantajı bizim laboratuarda optimizasyonu için kullanılan primerler olarak özdeş numune üretimi serisi her astar hacimde çok sayıda depolamak olmasıdır. Sonuç olarak, astar, sadece aynı sıra var, ama t değilhey bu protokolde kullanılan aynı üretim yeri gelir. Aynı partiden primerler kullanılarak, PCR primerleri kalitesinde farklılıklar sonucu olabilir prosedürü gereksiz değişkenler önlemek yardımcı olabilir. Aynı şekilde, diğer Taq polimeraz PCR, kullanılan Taq polimeraz kalitesi için sorunsuz çalışır ise PCR sonuçlarının kalitesi üzerinde bir etkisi olacak. PCR daha iyi tutarlılık sağlamak için, Clontech&#39;in reaktifleri kullanarak protokolü optimize etmiş. Avantaj 2 Polimeraz (Clontech, Mountain View, CA, Kedi # 639.201 veya 639.202) sağlam, sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz karışımı ve yüksek özgüllük ve daha doğru amplifikasyonlar sağlamak için yardımcı olan bir redaksiyon enzimdir. Bu protokol anneden Otların içinde miras kloroplast DNA dayanır Çünkü cogongrass ve JBG genotipleri arasında hibridizasyon olaylar bizim moleküler tanımlama prosedürü ile çekilmiş olabilir. Hypridization suspe olduğu durumlardacted, biz her iki ebeveyn devralınan nükleer bölgeler kullanmanızı öneririz. Bitki genotipleme dikkate almak en sık kullanılan non-plastid değişken bölgenin nükleer ribozomal ITS bölgesi 13-15,17 olduğunu. Şu anda, aynı PCR tüpünde nükleer ITS bölgenin bununla kloroplast trnL-F bölgenin amplifikasyonu multiplekslemesi doğru ilerleme kaydedilmektedir. Nükleer DNA bölgeleri ile plastid multiplekslemesi potansiyel olarak tek başına ya kullanma sınırlamaları aşmak olur, ancak bu yöntemlerin ayrı ayrı bir dava üzerinde fizibilite belirlemek için optimizasyon ve ek değerlendirme gerektirir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve bu tür moleküler işaretleri (floresan astar probları), gibi yeni teknolojilerin kullanımı da fail-safe ve doğru bitki genotipleme yöntemler olarak değerlendirilmektedir. Burada sunulan protokol JBG vahşi tip cogongrass bu gelen geri ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yaklaşım sağlar. Biz kullanmak teşvikBu protokolün rs Bu protokolün kullanılmasından elde edilen sonuçları rapor etmek bize. Bu paylaşılan bilgi JBG döner dağıtımı hakkında bilgi vermek yardımcı olacaktır. Bu aynı zamanda USDA de düzenleyiciler oldukça invaziv cogongrass çeşitlerinin yayılmasını ve potansiyel hibridizasyon aşmak gerekiyor olabilir eylemler hakkında bilinçli kararlar almanıza yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DNeasy Bitki Mini Kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 69104 veya 69.106 </td><td> Iyi kalitede DNA verir herhangi bir saygın genomik bitki DNA kiti bu işlemler için sorunsuz çalışır. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0578 </td><td> İleri pozitif kontrol astar </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;ekzon)-C </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0579 </td><td> Pozitif kontrol astar Ters </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0864 </td><td> İleri vahşi tip cogongrass astar </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0865 </td><td> Gerivahşi tip cogongrass astar </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0866 </td><td> İleri JBG ve astar dönmek JBG </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2, </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0867 </td><td> JBG ve astar dönmek JBG Ters </td></tr><tr><td> Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix </td><td> Clontech&#39;in, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> Avantaj 2 Polimeraz </td><td> Clontech&#39;in, Mountain View, CA </td><td> 639.201 veya 639.202 </td><td> İyi bir redaksiyon, sıcak-start Taq polimeraz </td></tr></tbody></table>

a pcr-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of imperata cylindrica

Yabani tip I cylindrica (cogongrass) olumsuz Afrika, Asya, Avrupa, Yeni Zelanda, Okyanusya ve Amerika 1-2 genelinde 73 farklı ülkede tarım ve doğal kaynakları etkileyen, dünyanın en kötü on invaziv bitkilerden biridir. Cogongrass yerli bitki türlerinin büyük bir çeşitlilik yerinden ve sırayla yem ve barınma için yerinden yerli bitki türleri bağlıdır yerli hayvanlarını tehdit hızla yayılan, monodominant standları oluşturur. Sorunun eklemek için, bir süs çeşitli [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] yaygın Imperata cylindrica &#39;Rubra&#39;, Red Baron ve Japon kan otu (JBG) adları altında pazarlanıyor. Bu çeşit varsay steril ve non-invaziv ve onun kırmızı renkli yaprakları için arzu edilen bir süs olarak kabul edilir. Ancak, doğru koşullar altında, JBG canlı tohum üretebilir (Carol Holko 2009, kişisel iletişim) ve i yeşil bir dönebilirsinizBu vahşi tip invaziv çeşitli 4 (Şekil 1) ayırt edici özellikleri üzerine alır gibi cogongrass çoğu zaman ayırt edilemez nvasive formu. Bu tanımlama bile iyi eğitimli bitki taksonomistlerin için morfolojisi zor bir görev kullanarak yapar. Saldırgan bir yeşil fenotipi JBG ile geri dönmesinin de nadir bir olay değildir. Kodlama ve nükleer ve kloroplast hem DNA değişken bölgelerin dizi karşılaştırmalar kullanarak, JBG Maryland, South Carolina, ve Missouri eyaletlerinde içinde yeşil invaziv gecmistir doğruladı. Aktif bir cogongrass istilası var olmadığı JBG kıta ABD&#39;nin hemen her eyaletinde satılan ve dikilmiş oldu. Iyi anlaşılmış değil geri sorunun ölçüde rücu bitkiler belgelenmemiş ve genellikle yok çünkü. Bu molekül protokolünün Uygulama JBG döner tanımlamak için bir yöntem sağlar ve co-meydana gelen, bu çeşitler kalmasına yardımcı birnd muhtemelen melezleştirerek. Cogongrass farklı bir genotip ile geçerken, bir zorunlu outcrosser ve,-rüzgar dağınık canlı üretmek 5-7 geniş mesafelerde cogongrass yayıldı tohumları olabilir. JBG cogongrass göre biraz farklı bir genotip vardır ve cogongrass olan canlı melezler oluşturur mümkün olabilir. Sorunun eklemek için JBG cogongrass 8-10 daha soğuk ve hoşgörülü bir gölge olduğunu ve bu iki çeşit arasındaki gen akışı daha agresif olan melezler oluşturmak için muhtemelen, vahşi tip cogongrass daha cesur, hoşgörülü, soğuk ve gölge. Yabani tip cogongrass anda Güneydoğu ABD&#39;nin dünya çapında 490 milyon hektarın üzerinde, infests iken 500.000 hektarı aşan infests ve hızla kuzeye geniş niş ve coğrafi potansiyeli 3,7,11 nedeniyle yayılır olarak ABD büyük kısmını işgal yeteneğine sahiptir. Genetik bir geçiş potansiyel USDA-APHIS Federal Zehirli Hafta Programı için ciddi bir endişe kaynağıdır. Şu anda, USDA-APHIS devletler wh JBG yasaklarere büyük cogongrass enfestasyonlar (örneğin, Florida, Alabama, Mississippi) vardır. Cogongrass ve JBG dağılımları genişletmek Ancak, bir araya gelen iki çeşit önlenmesi daha zor kanıtlayabilirim. Ayrıca, döner JBG dağılımı henüz bilinmeyen ve morfoloji aracılığıyla bu çeşitler tanımlamak için yeteneği olmayan bazı cogongrass istilalarını JBG döner bir sonucu olabilir. Ne yazık ki, mevcut kimliklenme moleküler yöntemler genellikle alıcı ve masraflı zaman her ikisi de AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) ve DNA dizi analizi, güveniyor. Burada, doğru cogongrass ve JBG dönmek ayırt ilk maliyet-etkin ve güvenilir PCR tabanlı moleküler genotiplendirme yöntemi sunuyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica at JoVE.com

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Biz kloroplast trnL-F boşluk bölge içinde hedef DNA dizisi farklılıklar çeşitler arasındaki farklılaştırmak için çeşitli spesifik PCR primerleri kullanan bir maliyet-etkin ve hızlı moleküler genotipleme protokol sağlar<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass) sadece morfoloji ile ayırt edilemez. Bu çeşit federal listelenen zararlı ot, cogongrass ve yakından ilgili, yaygın süs çeşitli, ben dahil<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (Japonca kan otu).

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

JoVE Journal

Biology

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

31.4K Görüntüleme.  The University of Alabama, Huntsville. Biz kloroplast trnL-F boşluk bölge içinde hedef DNA dizisi farklılıklar çeşitler arasındaki farklılaştırmak için çeşitli spesifik PCR primerleri kullanan bir maliyet-etkin ve hızlı moleküler genotipleme protokol sağlar Imperata cylindrica (Cogongrass) sadece morfoloji ile ayırt edilemez. Bu çeşit federal listelenen zararlı ot, cogongrass ve yakından ilgili, yaygın süs çeşitli, ben dahil. cylindrica Var. Koeni...

Video: A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biyoloji

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Mycoplasma optimize edilmiş PCR tabanlı Algılama

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Fare.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...