Biz örnek edinme konusunda yardım için Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), ve Betty Marose (UMD) teşekkür . Biz video filme yaptığı çalışmaların öğrencileri Andrew Adrian (UA-Huntsville) ve Derek Thacker (UA-Huntsville) bu protokol test kendi yardım için, ve Joseph Herdy teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Balık ve Yaban Hayatı Vakfı tarafından finanse edildi.

1. Örnek Toplanması ve Korunması Bu yöntem geliştirilmiş ve taze, dondurulmuş, kurutulmuş yaprak ve son zamanlarda doku kullanılarak test edildi. <ol><li> Cogongrass ve / veya ot türlerinin belirlenmesi konusunda uzmanlaşmış bir taksonomisti yardımı ile dokulara JBG tanımlayın. Onun parlak kırmızı yapraklı, süs JBG görsel dönmek wild-tip cogongrass ve JBG ayırt etmek kolaydır, ancak cogongrass ve JBG dönmek birbirinden neredeyse ayırt edilemez niteliktedir. Cogongrass ve JBG rücu fenotipi yeşil, uzun yapraklı, oldukça büyük ve uzun rizomlar ve JBG 12 (Şekil 1) daha fazla yaprak alanı var. </li><li> Taze yaprak dokusu en bol ve en yüksek kalitede DNA sağlar ve tarla veya sera yetiştirilen I. tahsil edilebilir cylindrica bitkiler. Taze doku kullanılacak ise, bozulması önlemek için toplama 3 saat içinde DNA ayıklayın. Aksi takdirde, depolama, keepi için doku hazırlanmasıdoğrudan güneş ışığı ng doku serin ve dışarı. </li><li> Daha sonraki bir tarihte DNA ekstraksiyonu için dokuların saklamak için en uygun yöntem hemen -80 ° C de doku dondurmak ve depolanmasıdır. Dondurulmuş doku DNA ekstraksiyon önce çözülmeyi izin vermeyin. Çözülme önlemek için DNA ekstraksiyon taşlama adımları önce sıvı azot için dondurulmuş doku aktarın. </li><li> Bir -80 ° C derin dondurucuda kullanılabilir değilse, kuru doku hemen. Kuru depolanması için, bir kağıt zarf halinde doku yerleştirmek ve kurutulmuş silika jel veya oda sıcaklığında diğer aktif kurutucular içinde zarfı depolamak. Karıştırılır göstergesi silika küçük bir miktarı olmayan gösteren bir silika silika için tamamen kurutulmuş ve uygundur sağlayacak olan bitki doku kurutma. </li><li> En az 10 kat ağırlık taze yaprak daha silika jel kullanın. Bitki dokusunda 24 saat içinde kuru olmalıdır. DNA nitelik ve nicelik (herbaryum numunenin durumunda olduğu gibi, zaman içinde kuru depolanması aracılığıyla azalırs). </li></ol> 2. DNA Ekstraksiyonu Bir küçük değişiklik ile üreticinin talimatlarına; bitki dokularından DNA ayıklamak için, DNeasy Bitki Mini Kit (Cat # 69.104 veya 69.106 Qiagen, Valencia, CA) izleyin. Bunun yerine her sütun için önerilen en az 100 mg taze doku veya daha az 20 mg kuru doku kullanarak, uygun tüplere (kuru doku veya&gt; 20 mg), taze veya dondurulmuş doku 100 mg aktarmak den az 100 mg eziyet ve ekstraksiyonu için. Nükleer ve plastid DNA aynı anda elde edilir. <ol><li> Bu işlemler başlamadan önce, etanol doğrulamak tamponlar AP3 / E ve AW ilave edildi. </li><li> Soğutulmuş bir havanda in taşlama ile sıvı azot üç tur kullanılarak ince bir toz olarak taze dondurulmuş doku yaprağı (ya da kuru yaprak doku&gt; 20 mg)&gt; 100 mg öğütün. Başlangıç ​​materyali yetersiz bozulması ya da yetersiz lizis olabilir, aynı zamanda DNA düşük verimler yol açar. Dikkatle Tiss öğütmekue ve çok fazla doku ile sütunlar aşırı değildir. </li><li> Tampon AP1 400 ul ve her bir tüp, bir küçük bir raf yerleştirilebilir RNaz A. 4 ul içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne taze dondurulmuş doku (ya da kuru toz dokudan 20 mg) ila 100 mg donmuş toz transferi tüp başına doku ağırlığı doğru izlemek için dengelemek. </li><li> Vorteks veya titreme örneği (ler) karıştırılır ve 65 &#39;de 10 dakika inkübe ° C arasında, 2-3 kere inkübasyon sırasında ters tüp (s). </li><li> Her numune için Tampon AP2 130 ul ekleyin. Ters tüp (s), birkaç kez ve buz üzerinde 5 dakika süreyle inkübe ile karıştırılır. </li><li> Pipetleyin her biri ayrı bir QIAshredder Mini spin kolon içine lizat ve 2 ml toplama tüpüne (kiti ile sağlanır) her sütuna yerleştirin. 2 20.000 xg (~ 14.000 rpm) dk ve her yeni bir tüp (kit ile birlikte) içine fraksiyon akış yoluyla herhangi oluşan pelet bozmadan aktarmak için Santrifüj kolon (lar). </li><li> / Tampon AP3 1.5 hacimleri ekleE, ve pipetleme ile karıştırın. </li><li> 2 ml&#39;lik toplama tüpüne bir DNeasy Mini spin kolon karışımın içine 650 ul aktarın. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar). Her numune için kalan karışımı ile bu adımı yineleyin. </li><li> Yeni bir 2 ml toplama tüp (ler) içine spin kolon (lar) yerleştirin ve her sütunun üst Tampon AW 500 ul ekleyin. 1 6.000 xg (~ 8,000 rpm) dk ve akış yoluyla atmak için Santrifüj kolon (lar). </li><li> Her sütunun üst Tampon AW başka 500 ul ekleyin. 20,000 xg (~ 14.000 rpm) 2 dakika süreyle santrifüjleyin. Bu aşama, böylece PCR inhibe edebilir tamponlar içinde bulunan herhangi bir kalıntı etanol kaldırarak, kolon kuruyacak. </li><li> Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj örnek tüp için her spin kolon aktarın. Elüsyon için her sütun başına 100 mikrolitre Tampon AE ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kolonu (ler) inkübe edilir. DNA toplamak için 6000 x g&#39;de (~ 8.000 rpm) 1 dakika boyunca santrifüj; kolon (s). </li><li> Bu elüsyon 200 ul numune elde etmek için aynı 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine DNA elüt edilerek, bir kez adımları tekrar. Kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklayın DNA örnekleri. DNA konsantrasyonları doku tipi ve depolama koşullarına bağlıdır. Tampon AE 200 ul toplam ile elüt DNA zaman optimum verimleri elde edilmiştir, ancak konsantrasyonları elüsyon hacmi kadar az 50 ul kadar indirgenmiş halinde arttırılabilir. </li></ol> 3. DNA Kalite ve Miktar doğrulanması <ol><li> Bir spektrofotometre veya florimetre ve jel elektroforezi kullanılarak PCR kurulum öncesinde çıkarılan DNA kalitesi ve miktarı test edin. Bu, sonraki adımların başarı sağlamaya yardımcı olur. </li><li> Bir spektrofotometre, DNA testi kalite ve miktar kullanma. İyi DNA verimleri 50 ile 150 arasında olmalıdır 2.0 yakın 260/280 ve 230/280 oranlarında ul / ng. Bir örnek olarak, Şekil 2 NanoDrop spektrofotometre (ThermoScientific kullanılarak iyi kalitede sonuçlarını göstermektedir<html> , Wilmington, DE). </li><li> Standart% 1 agaroz jel kullanılarak elektroforez yürütün. RNA kontaminasyonu çok az şeritli (Şekil 3) hiçbir nispeten geniş bant (&gt; 10 Kb) varlığını doğrulayın. </li><li> DNA konsantrasyonu yüksek, seyreltik DNA örnekleri sonraki adım için 70 ng / ul için ise. </li></ol> 4. PCR primerleri Bu protokolde kullanılan PCR primerleri cogongrass ve JBG genotiplerinin plastid trnL-F ayırıcı bölgesi arasındaki farklılıklar sekansı esas alır. Bu farklılıklar SNP&#39;lerin formu (tek nükleotid polimorfizmleri) ve benzersiz dizilerinin siteleri (Şekil 4) primerler bularak çeşitli spesifik primerler gelişimine izin indellerin (Eklemeler ve Silmeler) gelir. <ol><li> Primerlerin kalitesi PCR sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Saygın bir şirketten Sipariş astarlar. Biz Eğik Bio, Inc (bizim astar siparişWww.obliquebio.com/web/ :/ / &quot;target =&quot; _blank &quot;sadece standart tuzsuzlaştırma prosedürleri talep&gt; http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL). </li><li> trnL-F pozitif kontrol primerleri: Bu primer seti 11-13 en çim takson plastid trnL-F boşluk bölgesi güçlendirir ve iyi bir pozitif kontrol (bir 890 bp bant ile sonuçlanan) olarak hizmet vermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Dizi </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> 5&#39;-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;ekzon)-C </td><td> 5&#39;-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> Yabani tip cogongrass primerler: Bu primer seti cogongrass özeldir ve genotiplerinin JBG arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 595 bp bir bantta set sonuçları. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Sequence </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 5&#39;-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 5&#39;-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> JBG ve JBG primerler dönme: Bu primer seti genotipine JBG özeldir ve cogongrass arasında trnL-F bölgesi amplifiye değildir. 594 bp bir bantta set sonuçları. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Dizi </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 5&#39;-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2, </td><td> 5&#39;-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> -20 ° C, uzun süreli saklanabilir 100 mM stok çözümler elde etmek için nükleaz içermeyen GKD 2 O yeterli hacmi her astar yeniden süspanse edin. </li><li> PCR kurulum adımları önce 12 mM her astar stok sulandırınız. </li></ol> 5.. PCR Kurulum DNA ekstraksiyon PCR reaksiyonlarında primer seti Yukarıdaki her biri kullanılarak amplifiye edilir. Tüm PCR iyi çalışıyoruz ve bir grup oluşturabilir sağlamak için bir pozitif kontrol ekleyin. Reaktiflerin hiçbirinin istenmeyen DNA ile kontamine sağlamak için bir negatif kontrol ekleyin. Negatif kontrol yapılması şablonu içeren ve hiçbir bant üretimi neden. <ol><li> Termalcycler blok ve örnek arasında daha iyi ısı transferi sağlamak için ince duvarlı PCR tüpleri tüm reaksiyonlar hazırlayın. Biz kontaminasyonu önlemek için piyasada bulunan aerosol-free pipet uçları kullanmanızı öneririz. </li><li> Her izole DNA örneği için, aşağıda listelenen sırada ICE aşağıdaki reaktifler ekleyerek 0.2-ml ince duvarlı PCR tüpleri yukarıdaki primer setleri her kullanılarak 50 ul PCR reaksiyonları kurdu. Birden fazla numune hazırlanmaktadır, özel durum tüm reaktifleri içeren bir kokteyl yapmakDNA örneğinin bütün reaksiyonlar arasında düzgün koşulları kurmak. <table border="1"><tbody><tr><td> PCR Reaktif </td><td> İkinci Cilt </td><td> Final zenginleştirmesi </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen GKD 2 O </td><td> 40.5 ul </td><td></td></tr><tr><td> Avantaj 2 10X PCR Buffer (Clonetech, CA) </td><td> 5.0 ul </td><td> 10% (v / v) </td></tr><tr><td> Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix (10 mM her biri Clonetech, CA) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Primer 1 (GKD 2 O 12μM) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.24 uM </td></tr><tr><td> Primer 2 (GKD 2 O 12μM) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0.24 uM </td></tr><tr><td> Avantaj 2 Polimeraz Mix (Clonetech, CA) </td><td> 0.5 ul </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> DNA ekstraksiyonu(70 ng / reaksiyon; gerektiği gibi GKD 2 O ses seviyesini ayarlamak) </td><td> 1.0 ul </td><td> 1.4 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Toplam: 50.0 ul </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Tüm PCR iyi çalıştığından emin olmak için, pozitif kontrol primerler kullanılarak pozitif kontrol kurmak. Bu primer seti dönmek ve diğer otlar JBG, cogongrass, JBG için eşit derecede iyi çalışıyor ve 890 bp olan bir bant ile sonuçlanacaktır. </li><li> Bunun yerine DNA ekstraksiyon GKD 2 O kullanılarak, pozitif kontrol olarak ayarlanır aynı kontrol primer kullanılarak negatif kontrol ayarlamak. Tüm reaktifler DNA kirletiyorsa serbest ise, bu reaksiyon bir grubu ile sonuçlanacaktır. </li><li> DNA konsantrasyonu düşük olması durumunda, fazla DNA nükleaz içermeyen GKD 2 O miktarı 50 ul kadar toplam reaksiyon hacmi getirmek için kullanılan ayarlayarak, her bir reaksiyonun eklenebilir. DNA fazla 5 ul (% 10 kullanılmamalıdır r başına toplam hacmi)eaction, DNA örnekleri içindeki mümkün safsızlıklar PCR reaksiyonları inhibe edebilir. </li></ol> 6. PCR Bisiklete binme <ol><li> Aşağıdaki PCR bisiklet parametreleri kullanarak ısıtılmış bir kapak ile donatılmış bir termalcycler PCR amplifikasyon yürütmek. Biz standart sıcaklık tırmanışı koşulları ile çalışacak şekilde ayarlanır Mastercycle yanlısı S termalcycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) kullanın. Herhangi bir kalite termalcycler iyi yapmalıdır. <table border="1"><tbody><tr><td> Devir </td><td> Tavlama denatürasyon </td><td> Polimerizasyon </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 95 de 2 dakika ° C </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 ° C de 30 saniye </td><td> 30 sn 61 ° C de 90 saniye 68 ° C&#39;de 35 döngü </td></tr><tr><td> 3 </td><td></td><td> 68 de 5 dakika ° C </td></tr><tr><td colspan="3"> Örnek kaldırılır ° C&#39;ye kadar, 4 at tut </td&gt; </tr></tbody></table></li><li> DNA kalitesine bağlı olarak gerektiği gibi PCR (primer tavlama sıcaklığı, uzatma süreleri ve devir sayısı dahil) için koşulları optimize, astar, PCR ile Taq polimeraz veya türü kullanılır. Biz optimum belirlerken bir degrade yetenekli thermocycler kullanmanızı öneririz sıcaklıklarda tavlama. </li><li> Kullanılan termalcycler ısıtılmış bir kapağı yoksa, PCR devir esnasında buharlaşmasını önlemek için her numunenin üst mineral yağı 1 damla ekleyin. </li></ol> 7. PCR Ürünlerinin Jel Elektroforez Analizin sonuçları görselleştirme, standart elektroforez ile% 1 agaroz jel üzerinde ayrı PCR ürünleri. <ol><li> Her amplifiye PCR ürün 5 ul ile standart bir DNA yükleme tamponu 2 ul (tipik olarak bir ya da 5x 6x çözeltisi) birleştirir. </li><li> E yapılan EtBr (DNA boyama etidyum bromid) ihtiva eden bir% 1 agaroz jel üzerine örnekleri Yükither TAE veya SB (sodyum borat) tampon sistemleri 16. Biz, 100 ml% 1 agaroz (0.1 ug / ml) başına 10 mg / ml EtBr stok solüsyonu 1 ul kullanabilir. </li><li> Boya ön ulaşıncaya kadar ~ 120V azından örnekleri çalıştırmak ¾ jel toplam uzunluğunun. </li><li> UV ışık altında (kısa dalga UV ışık kutusu gibi), uygun bir parçası amplifiye edildi görmek için çıkan bantları kontrol edin. </li><li> Kullanılabilir bir foto-dokümantasyon sistemi veya kamera kullanarak jel ve çıkan bantları belgeleyin. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar PCR ürünleri görselleştirme üzerine, cogongrass JBG ya JBG (Şekil 5) döndürülmesi ile karşılaştırıldığında özel bir bantlama desene sahiptir. Her bir DNA örneği için, trnL-F pozitif kontrol primer seti ~ 890 bp tek bir yüksek yoğunluklu bant neden. Bu, tüm PCR iyi çalıştığını doğrular. Benzer şekilde, negatif kontrol (hiçbir şablon) reaksiyonu herhangi bir astar s için bir bant içermelidiret kullanılır. Bu durum, reaktifler hiçbiri kontamine oldu doğrular. DNA vahşi tip cogongrass, JBG spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken cogongrass spesifik primer seti ~ 595 bp tek bir grup ile sonuçlanacaktır kullanılarak bir PCR reaksiyonunda elde edilirse. DNA JBG türetilen ya JBG döndürülmesi durumunda cogongrass spesifik primerlerin herhangi bir bant neden olurken Keza, JBG spesifik primer seti kullanılarak bir PCR reaksiyonunda azından ~ 594 bp&#39;lik bir tek grubu ile sonuçlanacaktır. JBG ve JBG geri intikal özdeş nükleik asit dizisi olduğu için, dolayısıyla aynı bant desenleri olacaktır. Birçok örnekte, aynı zamanda bir jel üzerinde karşılaştırılacak olursak, biz böylece daha kolay olumlu sonuçlar için numunelerin tarama yaparak, birbirlerine yanında kurulan her astar türetilen tüm örnekler çalıştırmanızı öneririz. Döner JBG ve JBG arasındaki morfolojik farklılıklar oldukça açıktır (yaprak ve JB küçük boy örneğin kırmızı renk<html> PCR sonuçları aynı olacak ise G vs yeşil rengi, büyük boy ve JBG agresif büyüme dönmek), böylece, JBG çeşitleri bitkisel özellikleri kullanarak ayırt etmek kolaydır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig1.jpg" /> Şekil 1. Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) yetiştirilen sera Karşılaştırılması, I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir NanoDrop spektrofotometre kullanılarak teyit DNA örnekleri bir örnek. Bakılmaksızın kullanılan spektrofotometrenin, 260/280 oranı 1.8 &#39;e yakın olmalı ve 260/230 oranı 2.0 yakın gerektiğini unutmayın. ontent &quot;&gt; <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig3.jpg" /> Şekil 3. DNA örnekleri% 1 agaroz jel üzerinde standart jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı. Bir ticari DNA işaret boyutu analizi için kullanıldı. Lane # 4 bulaşmasını ve bazı RNA kirlenme gösteren, düşük kaliteli DNA bir örnektir. <a href="/files/ftp_upload/3265/3265fig4_lg.jpg"><img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig4.jpg" /></a> Imperata cylindrica var. Koenigii (Japonca kan otu) ile trnL-F bölgelerin Şekil 4. Sıra diziler I. küçültülmüş cylindrica var. koenigii (JBG Döndür) ve I. cylindrica (Wild tip cogongrass). Dikey siyah oklar SNP ve indellerin kaynaklanan dizileri farklılıklar göstermektedir. Yatay yeşil oklar cogongrass özgü PCR için kullanılmıştır yabanıl tür cogongrass primerlerin pozisyonları göstermektedir. Yatay kırmızı oklar po göstermektedirJBG ve JBG ve sonrası olarak bölünmüştür JBG özgü PCR için kullanılan primerler döner. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3265/3265fig5.jpg" /> Şekil 5. Cogongrass-ve JBG spesifik primerlerin ile yanı sıra trnL-F pozitif kontrol ve bir şablon negatif kontrol herhangi bir araya DNA örnekleri JBG ve geri JBG cogongrass türetilen PCR ürünlerinin jel elektroforezi, temsili sonucu.

<ol>
	<li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Geographical Atlas of World Weeds. , (1979).</li><li>CABI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crop+Protection+Compendium.">Crop Protection Compendium.</a> Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , (2007).</li><li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+-+Biology,+ecology,+and+management.">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li><li>Talley, S. M., Cseke, L. J., Zink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnostic+technologies+for+invasive+plants.">Molecular diagnostic technologies for invasive plants.</a> CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. , 27-28 (2009).</li><li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -. K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogongrass+in+the+United+States:+History,+ecology,+impacts,+and+management.">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li><li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa.">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li><li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , (2003).</li><li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+from+shaded+and+exposed+habitats.">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li><li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities.">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li><li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+(Imperata+cylindrica)+viability.">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li><li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+(Imperata+cylindrica)+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States.">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li><li>Talley, S. M., Ramsey, C. L., Zink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimentally+assessing+the+invasive+potential+of+plants.">Experimentally assessing the invasive potential of plants.</a> CPHST Laboratory 2009 Annual Report. , 29-30 (2009).</li><li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lled&#243;, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics+of+Miscanthus,+Saccharum+and+related+genera+(Saccharinae,+Andropogoneae,+Poaceae)+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers.">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li><li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants.">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li><li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+(Poaceae)+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data.">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li><li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+boric+acid:+a+Tris-free,+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis.">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li><li>Chou, C. -. H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+(L.)+Beauv.+var.+major+(Cogongrass)+populations+in+Taiwan.">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

<html> ABD fidanlık ve peyzaj sanayi egzotik ve yeni bitki türlerinin yetiştirilmesi ve satan gelişirler. Ticaretin giderek artan küreselleşme ile birleştiğinde Bu, bir istilacı bitki türleri, girmek kurmak ve ABD&#39;de federal invaziv olma potansiyeline de dahil olmak üzere, genellikle mevcut değildir bilgiye dayanır bu tür bitkilerin düzenleme yeteneği yayacağı şansını artırır , yerli ve vatandaşlığa taksonlar doğru taksonomisi ve genetik çeşitlilik. Invaziv bitkilerin bilgimiz genelde sınırlı olduğundan, gizli invaziv özellikleri ile ithal bitkiler isteyerek sadece onlar bizim tarım ve doğal kaynaklar işgal daha sonra öğrenmek için getirilmiştir. Bu protokol, I. ile ilişkili bu sorunlara yönelik amaçlar doğru wild-tip cogongrass ve süs JBG muadili rücu formu ayırt edebilirsiniz ilk basitleştirilmiş moleküler yöntem sağlayarak cylindrica çeşitleri. Bu protokolün geliştirilmesi için jove_content &quot;&gt;, wild-tip cogongrass 2008 yılının Haziran ayında Jay, FL yakınlarındaki Santa Rosa County Pond Creek Orman Biriminde vatandaşlığa nüfus toplanmıştır. JBG ticari bir kreş (Bluebird Kreş, Inc temin edildi .. Riverdale, MA University Park ve Haziran 2009 yılında;;) 2008 yılı Haziran ayında yanı sıra Columbia ev sahibi koleksiyonundan, MO JBG Haziran 2008&#39;de Clemson University, SC de Campbell Jeoloji Müzesi avlusunda elde edilen döner ve Columbia, 2009 yılında MO (Leland Cseke tarafından tanımlanan) bir ev sahibi ön avludan. Tüm bitkiler Huntsville, Alabama Üniversitesi (Huntsville, AL) bulunan bir serada tutuldu. Bu bitkilerden toplanan DNA Genetik sekans genellikle barkod tesisleri 2 için kullanılan 9 bağımsız DNA bölgeleri derinliği karşılaştırmalarda dahil. Tüm durumlarda, JBG ile dizilimler, böylece yardımcı JBG geri olanlar için bir% 100 idi eşleşmeJBG gerçekten yeşil, invaziv forma dönmek doğrulayın. Sadece nükleer ITS ve kloroplast trnL-F bölgelerde genetik cogongrass ve JBG ayırt etmek için kullanılabilir farklar var. TrnL-F bölgede 2 SNP ve 2 indellerin (eklemeler ve silmeler) sahipken ITS bölgesi, cogongrass ve JBG arasında 3 SNP (tek nükleotid polimorfizmleri) bir toplam vardır. Bu genetik farklılıkların doğal tip cogongrass ve JBG döner ayırt edebilirsiniz ki geliştirilecek çeşitli spesifik PCR primerleri izin verdi. En güvenilir sonuçları plastid trnL-F bölgede elde edilen primerler gelmiş. Dolayısıyla, bu protokol cogongrass, JBG ve kloroplast genomunun trnL-F bölge ve JBG (Şekil 4) döndürüldü arasındaki farklar dizisi dayanmaktadır. Söz konusu çeşitlerin daha spesifik primerler oluşturmak yardımcı olmak ve yakından ilgili türler, al yanlış pozitif önlemek içinI. l bilinen trnL-F sekansları cylindrica çeşitleri ile ilgili çimen türleri (29 türünden 43 bağımsız dizileri, örneğin, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-iş buldum, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorgum halepense) den trnL-F dizileri ile karşılaştırıldı. Biz çim, çeşitli özel primerlerin özgüllük 29 tür arasında çeşitli spesifik primer dizilerinden araştırılmasına karşın kapsamlı diğer birçok ot türleri DNA çoğaltılması için, yeteneği gidilmemiş. Sonuç olarak, DNA çıkarılması için kullanılan doku dikkatle I. olarak tespit edilmelidir cylindrica önce bu protokol başlangıç ​​için. Çim, sonra cogongrass veya JBG ya olarak tespit edilemiyorsa, biz dizileri cogongrass veya JBG için tam bir eşleşme olduğundan emin olmak için PCR ürünü sıralama öneririz. Şu anda, belirli bir otu numunenin bir kimlik doğrulama en doğru yöntem t her iki PCR gerçekleştirmek için olanRNL-F ve ITS bölgeler, dizisi PCR ürünlerinin doğrulanması ve kesin takson bilinen dizileri dizilerinin karşılaştırılması izledi. DNA kontrolü Bu protokol ayrıntılı primerler (trnL-F bölge için) ya da diğer primerler diğer yayın 13-15 bu kullanılabilir kullanılarak büyütüldü edilebilir. Sıralama çok daha fazla emek ve basitleştirilmiş usuller kullanılarak daha yoğun bir maliyettir. PCR için kullanılan primerler kalitesi prosedürün başarısı için kritiktir. Biz Eğik Bio, Inc (edinilebilir Bu prosedür için primerler yaptık <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). Eğik Bio gelen primerler sipariş için avantajı bizim laboratuarda optimizasyonu için kullanılan primerler olarak özdeş numune üretimi serisi her astar hacimde çok sayıda depolamak olmasıdır. Sonuç olarak, astar, sadece aynı sıra var, ama t değilhey bu protokolde kullanılan aynı üretim yeri gelir. Aynı partiden primerler kullanılarak, PCR primerleri kalitesinde farklılıklar sonucu olabilir prosedürü gereksiz değişkenler önlemek yardımcı olabilir. Aynı şekilde, diğer Taq polimeraz PCR, kullanılan Taq polimeraz kalitesi için sorunsuz çalışır ise PCR sonuçlarının kalitesi üzerinde bir etkisi olacak. PCR daha iyi tutarlılık sağlamak için, Clontech&#39;in reaktifleri kullanarak protokolü optimize etmiş. Avantaj 2 Polimeraz (Clontech, Mountain View, CA, Kedi # 639.201 veya 639.202) sağlam, sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz karışımı ve yüksek özgüllük ve daha doğru amplifikasyonlar sağlamak için yardımcı olan bir redaksiyon enzimdir. Bu protokol anneden Otların içinde miras kloroplast DNA dayanır Çünkü cogongrass ve JBG genotipleri arasında hibridizasyon olaylar bizim moleküler tanımlama prosedürü ile çekilmiş olabilir. Hypridization suspe olduğu durumlardacted, biz her iki ebeveyn devralınan nükleer bölgeler kullanmanızı öneririz. Bitki genotipleme dikkate almak en sık kullanılan non-plastid değişken bölgenin nükleer ribozomal ITS bölgesi 13-15,17 olduğunu. Şu anda, aynı PCR tüpünde nükleer ITS bölgenin bununla kloroplast trnL-F bölgenin amplifikasyonu multiplekslemesi doğru ilerleme kaydedilmektedir. Nükleer DNA bölgeleri ile plastid multiplekslemesi potansiyel olarak tek başına ya kullanma sınırlamaları aşmak olur, ancak bu yöntemlerin ayrı ayrı bir dava üzerinde fizibilite belirlemek için optimizasyon ve ek değerlendirme gerektirir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve bu tür moleküler işaretleri (floresan astar probları), gibi yeni teknolojilerin kullanımı da fail-safe ve doğru bitki genotipleme yöntemler olarak değerlendirilmektedir. Burada sunulan protokol JBG vahşi tip cogongrass bu gelen geri ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yaklaşım sağlar. Biz kullanmak teşvikBu protokolün rs Bu protokolün kullanılmasından elde edilen sonuçları rapor etmek bize. Bu paylaşılan bilgi JBG döner dağıtımı hakkında bilgi vermek yardımcı olacaktır. Bu aynı zamanda USDA de düzenleyiciler oldukça invaziv cogongrass çeşitlerinin yayılmasını ve potansiyel hibridizasyon aşmak gerekiyor olabilir eylemler hakkında bilinçli kararlar almanıza yardımcı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DNeasy Bitki Mini Kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 69104 veya 69.106 </td><td> Iyi kalitede DNA verir herhangi bir saygın genomik bitki DNA kiti bu işlemler için sorunsuz çalışır. </td></tr><tr><td> trnF (GAA)-F </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0578 </td><td> İleri pozitif kontrol astar </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;ekzon)-C </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0579 </td><td> Pozitif kontrol astar Ters </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0864 </td><td> İleri vahşi tip cogongrass astar </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0865 </td><td> Gerivahşi tip cogongrass astar </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0866 </td><td> İleri JBG ve astar dönmek JBG </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2, </td><td> Eğik Bio, Inc </td><td> 3-0867 </td><td> JBG ve astar dönmek JBG Ters </td></tr><tr><td> Avantajı ultrapure PCR dNTP Mix </td><td> Clontech&#39;in, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> Avantaj 2 Polimeraz </td><td> Clontech&#39;in, Mountain View, CA </td><td> 639.201 veya 639.202 </td><td> İyi bir redaksiyon, sıcak-start Taq polimeraz </td></tr></tbody></table>

a pcr-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of imperata cylindrica

Yabani tip I cylindrica (cogongrass) olumsuz Afrika, Asya, Avrupa, Yeni Zelanda, Okyanusya ve Amerika 1-2 genelinde 73 farklı ülkede tarım ve doğal kaynakları etkileyen, dünyanın en kötü on invaziv bitkilerden biridir. Cogongrass yerli bitki türlerinin büyük bir çeşitlilik yerinden ve sırayla yem ve barınma için yerinden yerli bitki türleri bağlıdır yerli hayvanlarını tehdit hızla yayılan, monodominant standları oluşturur. Sorunun eklemek için, bir süs çeşitli [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] yaygın Imperata cylindrica &#39;Rubra&#39;, Red Baron ve Japon kan otu (JBG) adları altında pazarlanıyor. Bu çeşit varsay steril ve non-invaziv ve onun kırmızı renkli yaprakları için arzu edilen bir süs olarak kabul edilir. Ancak, doğru koşullar altında, JBG canlı tohum üretebilir (Carol Holko 2009, kişisel iletişim) ve i yeşil bir dönebilirsinizBu vahşi tip invaziv çeşitli 4 (Şekil 1) ayırt edici özellikleri üzerine alır gibi cogongrass çoğu zaman ayırt edilemez nvasive formu. Bu tanımlama bile iyi eğitimli bitki taksonomistlerin için morfolojisi zor bir görev kullanarak yapar. Saldırgan bir yeşil fenotipi JBG ile geri dönmesinin de nadir bir olay değildir. Kodlama ve nükleer ve kloroplast hem DNA değişken bölgelerin dizi karşılaştırmalar kullanarak, JBG Maryland, South Carolina, ve Missouri eyaletlerinde içinde yeşil invaziv gecmistir doğruladı. Aktif bir cogongrass istilası var olmadığı JBG kıta ABD&#39;nin hemen her eyaletinde satılan ve dikilmiş oldu. Iyi anlaşılmış değil geri sorunun ölçüde rücu bitkiler belgelenmemiş ve genellikle yok çünkü. Bu molekül protokolünün Uygulama JBG döner tanımlamak için bir yöntem sağlar ve co-meydana gelen, bu çeşitler kalmasına yardımcı birnd muhtemelen melezleştirerek. Cogongrass farklı bir genotip ile geçerken, bir zorunlu outcrosser ve,-rüzgar dağınık canlı üretmek 5-7 geniş mesafelerde cogongrass yayıldı tohumları olabilir. JBG cogongrass göre biraz farklı bir genotip vardır ve cogongrass olan canlı melezler oluşturur mümkün olabilir. Sorunun eklemek için JBG cogongrass 8-10 daha soğuk ve hoşgörülü bir gölge olduğunu ve bu iki çeşit arasındaki gen akışı daha agresif olan melezler oluşturmak için muhtemelen, vahşi tip cogongrass daha cesur, hoşgörülü, soğuk ve gölge. Yabani tip cogongrass anda Güneydoğu ABD&#39;nin dünya çapında 490 milyon hektarın üzerinde, infests iken 500.000 hektarı aşan infests ve hızla kuzeye geniş niş ve coğrafi potansiyeli 3,7,11 nedeniyle yayılır olarak ABD büyük kısmını işgal yeteneğine sahiptir. Genetik bir geçiş potansiyel USDA-APHIS Federal Zehirli Hafta Programı için ciddi bir endişe kaynağıdır. Şu anda, USDA-APHIS devletler wh JBG yasaklarere büyük cogongrass enfestasyonlar (örneğin, Florida, Alabama, Mississippi) vardır. Cogongrass ve JBG dağılımları genişletmek Ancak, bir araya gelen iki çeşit önlenmesi daha zor kanıtlayabilirim. Ayrıca, döner JBG dağılımı henüz bilinmeyen ve morfoloji aracılığıyla bu çeşitler tanımlamak için yeteneği olmayan bazı cogongrass istilalarını JBG döner bir sonucu olabilir. Ne yazık ki, mevcut kimliklenme moleküler yöntemler genellikle alıcı ve masraflı zaman her ikisi de AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) ve DNA dizi analizi, güveniyor. Burada, doğru cogongrass ve JBG dönmek ayırt ilk maliyet-etkin ve güvenilir PCR tabanlı moleküler genotiplendirme yöntemi sunuyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica at JoVE.com

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Biz kloroplast trnL-F boşluk bölge içinde hedef DNA dizisi farklılıklar çeşitler arasındaki farklılaştırmak için çeşitli spesifik PCR primerleri kullanan bir maliyet-etkin ve hızlı moleküler genotipleme protokol sağlar<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass) sadece morfoloji ile ayırt edilemez. Bu çeşit federal listelenen zararlı ot, cogongrass ve yakından ilgili, yaygın süs çeşitli, ben dahil<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (Japonca kan otu).

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

JoVE Journal

Biology

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

31.5K Görüntüleme.  The University of Alabama, Huntsville. Biz kloroplast trnL-F boşluk bölge içinde hedef DNA dizisi farklılıklar çeşitler arasındaki farklılaştırmak için çeşitli spesifik PCR primerleri kullanan bir maliyet-etkin ve hızlı moleküler genotipleme protokol sağlar Imperata cylindrica (Cogongrass) sadece morfoloji ile ayırt edilemez. Bu çeşit federal listelenen zararlı ot, cogongrass ve yakından ilgili, yaygın süs çeşitli, ben dahil. cylindrica Var. Koeni...

Video: A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Genetik

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including biological such as T-DNA or transposon, chemical such as ethyl methanesulfonate (EMS), or physical such as ionization radiation. The type of mutation observed varies depending on the mutagen used. For ionization radiation induced mutants, mutations include deletion, duplication, or rearrangement. While T-DNA or transposon-based mutagenesis is limited to species that are susceptible to transformation, chemical or physical mutagenesis can be applied to a broad range of species. However, the characterization of mutations derived from chemical or physical mutagenesis traditionally relies on a map-based cloning approach, which is labor intensive and time consuming. Here, we show that a high-density genome array-based comparative genomic hybridization (aCGH) platform can be applied to efficiently detect and characterize copy number variations (CNVs) in mutants derived from fast neutron bombardment (FNB) mutagenesis in Medicago truncatula, a legume species. Whole genome sequence analysis shows that there are more than 50,000 genes or gene models in M. truncatula. At present, FNB-induced mutants in M. truncatula are derived from more than 150,000 M1 lines, representing invaluable genetic resources for functional studies of genes in the genome. The aCGH platform described here is an efficient tool for characterizing FNB-induced mutants in M. truncatula.

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

This protocol provides experimental steps and information about reagents, equipment, and analysis tools for researchers who are interested in carrying out whole genome array-based comparative genomic hybridization (CGH) analysis of copy number variations in plants.

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Comparative Karyotype Analysis of Lycoris aurea Herb Populations Using Fluorochrome Banding and 45S and 5S rDNA-FISH

To understand karyotype variation in eight populations, detailed karyotypes were meticulously established using chromosomal measurements, fluorescence bands, and rDNA FISH signals. The number of 45S rDNA sites varies from one to five pairs per population, with the most common number per karyotype being four pairs. The 45S rDNA locus is predominantly located in the short arms and terminal regions of chromosomes, while the 5S rDNA locus is found mainly in the short arm and the terminal or proximal regions. Populations HBWF, HNXN, HBBD, and HNZX showed a similar distribution of 45S rDNA sites, as did GXTL, HBFC, and SCLS, indicating a close relationship between populations with similar 45S rDNA site distributions. The karyotypes of all studied populations are symmetrical, comprising stable and metastable centromeres or exclusively stable centromeres. Scatter plots of MCA and CVCL effectively distinguish their karyotypic structures. The analysis includes six quantitative parameters (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Additionally, the results indicate that PCoA based on these six parameters is a robust method for determining biological karyotype relationships among the eight populations. The chromosome number in Lycoris populations is x = 6-8. Based on the current study and literature, genomic differentiation of these populations is discussed in terms of genome size, heterochromatin, 45S and 5S rDNA sites, and karyotype asymmetry.

This protocol investigates the heterochromatin distribution in eight populations of Lycoris aurea (L&#8242;Her) Herb, using combined PI and DAPI chromosome staining, fluorescence in situ hybridization (FISH) with 18S-5.8-26S rRNA gene regions (45S rDNA regions), and 5S ribosomal DNA probes.

To understand karyotype variation in eight populations, detailed karyotypes were meticulously established using chromosomal measurements, fluorescence ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Biyoloji

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological assessment and chemical analytical methods. However, the lack of availability of botanists, especially in recent years, coupled with the need to enhance quality control to combat the stresses on the supply chain brought by increasing consumer demand and climate change, necessitates alternative approaches. The goal of this protocol is to facilitate botanical species identification using a portable qPCR system on the field or in any setting, where access to laboratory equipment and expertise is limited. Target DNA is amplified using dye-based qPCR, with DNA extracted from botanical reference materials serving as a positive control. The target DNA is identified by its specific amplification and matching its melting peak against the positive control. A detailed description of the steps and parameters, from hands-on field sample collection, to DNA extraction, PCR amplification, followed by data interpretation, has been included to ensure that readers can replicate this protocol. The results produced align with traditional laboratory botanical identification methods. The protocol is easy to perform and cost-effective, enabling quality testing on raw materials as close to the point of origin of the supply chain as possible.

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Presented here is a protocol for field identification of Matricaria chamomilla using a portable qPCR system. This easy-to-perform protocol is ideal as a method to confirm the identity of a botanical species at locations where access to laboratory equipment and expertise is limited, such as farms and warehouses.

Taşınabilir QPCR Sistemi ile Matricaria chamomilla Alan Tanımlama

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates

Fusarium wilt of watermelon (Citrullus lanatus), caused by Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), has reemerged as a major production constraint in the southeastern USA, especially in Florida. Deployment of integrated pest management strategies, such as race-specific resistant cultivars, requires information on the diversity and population density of the pathogen in growers' fields. Despite some progress in developing molecular diagnostic tools to identify pathogen isolates, race determination often requires bioassay approaches.
Race typing was conducted by root-dip inoculation, infested kernel seeding method, and the modified tray-dip method with each of the four watermelon differentials (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolates are assigned a race designation by calculation of disease incidence five weeks after inoculation. If less than 33% of the plants for a particular cultivar were symptomatic, they were categorized as resistant. Those cultivars with incidence greater than 33% were regarded as susceptible. This paper describes three different methods of inoculation to ascertain race, root-dip, infested kernel, and modified tray-dip inoculation, whose applications vary according to the experimental design.

A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates

Managing Fusarium wilt of watermelon requires knowledge of the pathogen races present. Here, we describe the root-dip, infested kernel seeding, and modified tray-dip inoculation methods to demonstrate their efficacy in race-typing of the pathogenic fungus Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Bilinmeyen Fusarium oxysporum f.sp. Irkını Belirlemek İçin Kullanılan Üç Aşılama Tekniğinin Kontrastı. niveum Yalı -tır

Fusarium wilt of watermelon (Citrullus lanatus), caused by Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), has reemerged as a major production constraint in the ...

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular fungi such as molds and unicellular fungi, broadly defined as yeasts, fulfill essential roles in soil ecosystems as decomposers of organic material and as food sources for other soil dwellers. Fungal species diversity in soil is dependent on a multitude of climatic factors such as rainfall and temperature, as well as soil properties including organic matter, pH, and moisture. Lack of adequate environmental sampling, especially in regions of Asia, Africa, South America, and Central America, hinders the characterization of soil fungal communities and the discovery of novel species. 
We characterized soil fungal communities in nine countries across six continents using ~4,000 soil samples and a protocol developed in the laboratory for the isolation of yeasts and molds. This protocol begins with separate selective enrichment for yeasts and the medically relevant mold Aspergillus fumigatus, in liquid media while inhibiting bacterial growth. Resulting colonies are then transferred to solid media and further processed to obtain pure cultures, followed by downstream genetic characterization. Yeast species identity is established via sequencing of their internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal RNA gene cluster, while global population structure of A. fumigatus is explored via microsatellite marker analysis. 
The protocol was successfully applied to isolate and characterize soil yeast and A. fumigatus populations in Cameroon, Canada, China, Costa Rica, Iceland, Peru, New Zealand, and Saudi Arabia. These findings revealed much-needed insights on global patterns in soil yeast diversity, as well as global population structure and antifungal resistance profiles of A. fumigatus. This paper presents the method of isolating both yeasts and A. fumigatus from international soil samples.

This protocol is an effective, speedy method of culturing yeasts and the mold Aspergillus fumigatus from large sets of soil samples in as little as 7 days. The methods can be easily modified to accommodate a range of incubation media and temperatures as needed for experiments.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler