מחקר זה מומן על ידי מענקים NIH AI062732 K08, K12 HD001401 ו 1UL1RR024139-02 ו לבריאות הילד מענק מחקר של ה צ&#39;ארלס הוד הקרן ל SB-M. ועל ידי קרן המחקר של אוניברסיטת מדינת ניו יורק בסטוני ברוק.

1. EBV הכנה מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת גדל באופן אקספוננציאלי B95-8 תאים (CRL ATCC # 1612; 13) ב 3 x 10 5 תאים / מ&quot;ל בקבוקון 75 ס&quot;מ 2 רקמות התרבות באמצעות טכניקה סטרילית. תאים גדלים RPMI להשלים 1640 המכיל חום מומת 10% בסרום שור עוברית (FBS), פניצילין / סטרפטומיצין ב 100U/ml ו -100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה, amphotericin B ב 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב 37 ° C בנוכחות של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעים ושמונה שעות מאוחר יותר, תאים resuspend ב RPMI שלם טרי ב 1640 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. כדי לגרום לייצור וירוס, לעורר תאים עם אצטט 20ng/ml phorbol tetradecanoyl (TPA) במשך שעה 1 ב תקן ה-CO 2 באינקובטור. שטפו תאים שלוש פעמים עם RPMI 1640 כדי להסיר TPA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בהיקף המקורי של RPMI להשלים 1640 (מתוך 1.2) והמקום הבקבוק ב-CO 2 באינקובטור למשך 96 שעות. שיטה זו הוכח לייצר titers גבוהה נקוב וירוס מדבקticles 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C להפריד EBV המכילים supernatant התרבות של תאים. Supernatant סינון דרך מסנן 0.45 מיקרון, aliquot, ולאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך למעלה משנה. חלופה אחת היא כדי להשיג את supernatant מ B95-8 התאים המכילים EBV מן ATCC (VR-1492) ולהשתמש בדילול המומלץ על ידי ATCC. </li></ol> 2. בידוד של כדוריות דם היקפיים mononuclear (PBMC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 10 מ&quot;ל דם מתורם לתוך מזרק heparinized או צינור דם heparinized. דם מדולל עם 20 מ&quot;ל PBS בטמפרטורת החדר צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסוד דם מדולל עם 15 מ&quot;ל בינוני Hypaque ההפרדה Ficoll הלימפוציטים. צנטריפוגה ב x 225 גרם ללא הבלם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעיל באפי ולהעביר לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל חרוטי. העלאת נפח 50 מ&quot;ל PBS עם ספין על XG 600 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוr את supernatant. שטפו תאים על ידי resuspending גלולה ב 50 מ&quot;ל PBS ו ספינינג ב 600 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף פעמיים נוספות באופן דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שטף תאים מ&quot;ל 1 של RPMI להשלים. השתמש 5 μL של תאים להכין דילול 1 / 10 ב Trypan כחול. ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הקול באמצעות RPMI מלא 25 ס&quot;מ 2 בקבוק רקמה תרבות להשיג ריכוז של התא 2 x מ&quot;ל 10 / 6. </li></ol> 3. זיהום EBV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף FK506 (AG מדעי) על השעיית התא מ 2.6 עד ריכוז סופי של 20 ננומטר. מניחים בקבוק ב-CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר aliquot של EBV. הסר בקבוק מן החממה ולהוסיף EBV לתאי בדילול 1 / 10. בדרך כלל, דילול זה מספק משרד הפנים של 5-10. מערבולת בבקבוק לערבב ולמקם אותו זקוף CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li></ol> הערה הב 4 שלב, ביצע לחזות תוצאה מוצלחת, היא צעד אופציונלי. אם שלב 4 יש לבצעם, תצטרך דגירה בקבוק נוסף של בלתי נגוע PBMC ב 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל כמו שליטה. 4. זיהוי אוכלוסייה של תאים מתרבים (שלב אופציונאלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן FACS חיץ: PBS + 5% FBS. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הנוגדנים הבאים מתערבב בנפח 50 μL כל אחד מכתים תאים בשלב 4.6. דילולים נוגדן צריך להיעשות במאגר FACS המכיל 1mg/ml של העכבר IgG (Sigma) לעכב הלא ספציפית מחייב על ידי נוגדנים. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מוכתמת PE נוגדן אנטי CD23 מצומדות (1 / 50 דילול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מוכתמת FITC נוגדן אנטי CD58 מצומדות (1 / 50 דילול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מוכתמת PE-Cy5 נוגדן נגד CD19 מצומדות (1 / 50 דילול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משולש מוכתם עבור CD23, CD58, CD19 ו - (1 / 50 כל דילול) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מוכתמת עם שליטה אלוטיפ PE מצומדותנוגדנים מתאימים CD23-PE (בריכוז זהה נוגדן נגד CD23) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מוכתמת FITC נוגדן לשלוט מצומדות אלוטיפ מתאימים CD58-FITC (בריכוז זהה נוגדן נגד CD58) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מוכתמת PE-Cy5 נוגדן מצומדות לשלוט אלוטיפ מתאימים CD19-PE-Cy5 (בריכוז זהה נוגדן נגד CD19) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משולש מוכתמת כל שלושת הנוגדנים לשלוט אלוטיפ. </li></ol> זמני בחנות תערובות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלושה חשיפה שלאחר יום EBV, בעדינות בקבוק מערבולת לקבל השעיה תא אחיד יותר. הסר 2ml מן הבקבוק לתוך צינור Eppendorf 2ml. ספין הצינורית microcentrifuge ב 3000 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאים supernatant ו resuspend במאגר FACS ב 5 x 06-01 אוקטובר 7 x 10 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר eight aliquots 50μl לתוך צינורות בודדים Eppendorf או 96-V-היטב לתחתית צלחת. ספין צינורות או צלחת ב 1500 x gבמשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל צינורות supernatant ו מערבולת / צלחת. תאים Resuspend בצינור אחד / היטב μL 50 של חיץ FACS דילולים המכיל נוגדנים המתאימים שהוכנו 4.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות / צלחת על הקרח בחושך במשך 30 דקות. תאים צנטריפוגה בסל&quot;ד 3000 למשך 3 דקות, להסיר supernatant, ולהוסיף 200 μL של חיץ FACS. צנטריפוגה תאים שוב להסיר supernatant כדי להשלים את לשטוף. חזור two שוטף יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 200 FACS μL חיץ ולרכוש נתונים באמצעות cytometer זרימה, רכישת 20,000 אירועים / צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים באמצעות WinMDI (freeware לניתוח נתונים במחשב FACS). שער על תאים חיים באמצעות פרופילים פיזור קדימה בצד. לאחר מכן, התאים שער לחיות ביטוי CD19 + (B סמן התא) לאחר השוואה עם תאים מוכתם נוגדנים מתאימים כדי לשלוט אלוטיפ נוגדן נגד CD19. מגרש CD19 + B תאים חיים עם עוצמת הקרינה עבור CD23 על ציר X ואת עוצמת הקרינה עבור CD58 על ציר y. קבע CD23 + CD58 + ו תאים על ידי השוואת ל-EBV בתאים שנחשפו מוכתם נוגדנים בקרה מתאימים אלוטיפ. נוכחות של היי CD23 CD58 + תאים בתרבית EBV חשוף (איור 2C) מנבא תוצאה מוצלחת של תאים נגועים הפך EBV צמיחה. לעומת זאת, היי CD23 CD58 + תאים לא מופיעים כאשר תאים אינם חשופים EBV (איור 2 א) או חשופים למתח הלא המנציחה של EBV (תרשים 2B). היי CD23 CD58 + תאים הוכחו בניסוי לעבור התפשטות ובהמשך להקים LCL (14). </li></ol> 5. התרחבות cryopreservation של LCL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה של תאים על ידי מיקרוסקופ אור: עד שבוע לאחר זיהום EBV, אשכולות של תאים גלויים על ידי מיקרוסקופ אור. איור 3 מראה דוגמא של אשכולות בתחילת מיקרוסקופיים (איור 3B) בבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל שהזמן מתקדם, אשכולות מיקרוסקופיים הופכים גדולים יותר כגון גושים הנראיםmacroscopically בבקבוק. איור 3C מציג אשכולות גדולים של תאים LCL שהוקמה על ידי מיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האכלה תאים: פעמיים נפח בינוני תרבות בבקבוק התרבות ביום 12. לאחר מכן, להרחיב את התרבות על ידי הגדלת נפחו פי 2-3 באמצעות RPMI להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזוריות של תאים האכלה צריך להיקבע על בסיס שיעור צמיחת תאים. כאשר המדיום תרבות הופך צהוב, הוא בדרך כלל הזמן להחליף את התקשורת לעיל. בדרך כלל, זה קורה פעם בשבוע. עם זאת, כמה שורות תאים עשויים צריך להאכיל יותר או בתדירות נמוכה יותר. הרחב את התרבות 75-100 מ&quot;ל בשבועות הקרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryopreservation: כאשר המקפיא למטה תאים, התאים צנטריפוגות ב 600 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תא גלולה supernatant ו resuspend במדיום קפוא המכיל 90% FBS ו dimethylsulfoxide 10% ב 1 7 x 10 תאים / מ&quot;ל. המקום הצינורית חנקן נוזלי. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <html> התוצאה המוצלחת הוא ניבא על ידי נוכחות של היי CD23 CD58 + תאים. כ 2-3% של תאים חיים ביום 3-4 לאחר חשיפה EBV צריך את הפרופיל (איור 2C). אחרים תת אוכלוסיות של CD23 + CD23 - CD58 + CD58 ו - תאים שנצפו לאחר חשיפה EBV להראות התפשטות מינימלי 14. Un תאים הנגועים (איור 2A) ותאים שנחשפו EBV מ HH514-16 תאים (תרשים 2B), מחסה זן שאינו מנציח של EBV, לא להפגין היי CD23 CD58 + תאים. אתה יכול גם לחזות תאים על ידי מיקרוסקופ אור לפקח התוצאה המוצלחת: כפי שצוין קודם לכן, בתוך שבוע לאחר זיהום EBV, אשכולות קטנים של תאים הבקבוק גלויים על ידי מיקרוסקופ אור (איור 3B). עם התקדמות הזמן, התאים להתפתח LCL, אשכולות מיקרוסקופיים הופכים גדולים יותר (איור 3 ג) כאלה גושים נראים macroscopically בבקבוק. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig1.jpg" /> באיור 1. Workflow עבור הדור cryopreservation של שורות תאים lymphoblastoid. דם היקפיים הוא centrifuged דרך מפל Ficoll. נוכח PBMC במעיל באפי של שיפוע הוקמה נחשפים FK506 ואחריו תוספת של EBV. EBV חשוף התאים גדלים ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5% 2 להקים ובהמשך להרחיב LCL עבור cryopreservation. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" /> באיור 2. זיהוי של האוכלוסייה משנה של תאים B צפוי לעבור שגשוג לאחר חשיפה EBV. Un-נגוע PBMC (א) או PBMC חשופים EBV נגזר HH514-16 תאים (B) או B95-8 תאים (C) בנוכחות FK506 נבצרו ביום 3. תאים הוכתמו fluorochrome-מצומדות נוגדנים כנגד CD19, CD23 ו CD58. לאחר gating על תא חיs, בלתי נגוע (א) ו-EBV חשוף (B ו-C) CD19 + B התאים נבדקו עבור ביטוי CD23 ו - CD58. אוכלוסיית משנה של תאים B להביע רמות גבוהות של CD58 ו CD23 (CD23 היי CD58 +), נצפה רק בתאים שנחשפו טרנספורמציה המוסמכת EBV (הנגזרות B95-8 תאים), מתואר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" /> באיור 3. ויזואליזציה של אשכולות תא EBV תאים הנגועים. PBMC טופלו FK506 ו נגוע EBV. Un-נגועים (א) ו-EBV חשוף (ב) בתאים שנבדקו שבוע לאחר הפגיעה על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב (בהגדלה 10X). חמישה שבועות הקו הישן תא lymphoblastoid מוצג ג

<ol>
	<li>Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+the+Epstein-Barr+virus+and+the+origins+of+associated+lymphomas.">Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).</li><li>Kubuschok, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+spontaneous+Epstein-Barr+virus+lymphoblastoid+cell+lines+genetically+modified+to+express+tumor+antigen+as+cancer+vaccines:+mutated+p21+ras+oncogene+in+pancreatic+carcinoma+as+a+model.">Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model.</a> Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li><li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+under+influence:+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus.">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li><li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells:+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus.">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. Med. 10, 871-875 (2004).</li><li>Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells.">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298, 2199-2202 (2002).</li><li>Oh, H. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes.">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).</li><li>Ventura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simple+method+for+the+Epstein-Barr+virus+transformation+of+lymphocytes+from+members+of+large+families+of+Reunion+Island.">Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island.</a> Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).</li><li>Henderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+transformation+of+lymphocytes+by+Epstein-Barr+virus.">Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus.</a> Virology. 76, 152-163 (1977).</li><li>Bird, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+Epstein-Barr+virus+activation+of+human+B+lymphocytes.">Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes.</a> J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).</li><li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+method+for+the+establishment+of+permanent+growing+lymphoblastoid+cell+lines.">A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines.</a> Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).</li><li>Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+lymphocytes+immortalization+by+Epstein-Barr+virus+in+the+presence+of+cyclosporin+A.">Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).</li><li>Pressman, S., Rotter, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes:+prolonged+experience+with+technique.">Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique.</a> Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).</li><li>Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus:+Transformation,+cytopathic+changes,+and+viral+antigens+in+squirrel+monkey+and+marmoset+leukocytes.">Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).</li><li>Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+sub-population+of+B+cells+that+proliferates+after+infection+with+Epstein-Barr+virus.">Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus.</a> Virol. J. 8, 84-84 (2011).</li><li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Epstein-Barr+virus+(EBV)-immortalized+B+cell+lines.">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת במאמר זה מייצר LCL מדם היקפי התורם עם הנצחה מהירה cryopreservation פעמים. באמצעות שימוש FK506, תא T החיסון, ו titers גבוהה של הנגיף מדבק אנו מסוגלים לקדם הפצת EBV נגועים בתאי B מתאי דם היקפיים mononuclear. התערבויות אלה הופכות את השיטה המתוארת יעיל יותר, וכתוצאה מכך ההתרחבות המהירה של תאים לניסויים הבאים. באופן מסורתי, שינוי צמיחה נמצא במעקב על ידי ויזואליזציה של אשכולות של תאים על ידי מיקרוסקופ אור כשבוע לאחר החשיפה 6 EBV, 15. עם זאת, אשכולות של תאים אינו אינדיקטור מסוים של שינוי EBV בתיווך צמיחה. הוכחנו בעבר זיהוי עקבי של האוכלוסייה תא מתרבים באמצעות זרימת cytometry 14, מתן שיטה מדויקת ספציפיים כדי לקבוע תוצאה מוצלחת כבר שלושה ימים ומאחוראה חשיפה של תאים B ל-EBV.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> פישר Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> סיגמא </td><td> ד 2650 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית, חום מומת </td><td> סיגמא </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll ההפרדה Hypaque הלימפוציטים התקשורת </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG מדעי </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG בסרום של העכבר </td><td> סיגמא </td><td> אני 8765 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי מצומדות כדי PE CD23 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> עכבר אלוטיפ מצומדות כדי PE IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי מצומדות כדי FITC CD58 </td><td> פירס Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> עכבר אלוטיפ מצומדות כדי FITC IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי מצומדות ל PE-CD19 Cy5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> עכבר אלוטיפ מצומדות ל PE-Cy5 IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 התקשורת </td><td> סיגמא </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl phorbol אצטט (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS חוצץ (בופר פוספט 1X + 5% בסרום שור עוברית) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of epstein-barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines

זיהום של תאים עם B Epstein-Barr וירוס (EBV) מוביל הנצחה התפשטות הבאים, וכתוצאה מכך הקמת שורות תאים lymphoblastoid (LCL) במבחנה. מאז LCL נגועים רדום עם EBV, הם מספקים מערכת מודל לחקור חביון EBV ו מונחה וירוס B תא התפשטות tumorigenesis 1. LCL שימשו להציג אנטיגנים במגוון רחב של מבחני אימונולוגית 2, 3. בנוסף, LCL יכול לשמש כדי ליצור נוגדנים חד שבטיים אנושיים 4, 5 ו לספק מקור פוטנציאלי בלתי מוגבל כאשר גישה לחומרים ביולוגיים העיקרי הוא מוגבל 6, 7. מגוון של שיטות תוארו ליצור LCL. שיטות קודמות כללו את השימוש mitogens כגון phytohemagglutinin, lipopolysaccharide 8, 9 ו פיטולקה mitogen כדי להגביר את היעילות של הנצחה EBV בתיווך. לאחרונה, ואחרים השתמשו immunosupprסוכני essive כגון ציקלוספורין לעכב הרג T התא בתיווך של תאים נגועים ב &#39;7, 10-12. אורך זמן ניכר מזיהום EBV להקמתה של שורות תאים לכוננים את הדרישה שיטות מהיר ואמין יותר EBV מונחה טרנספורמציה תא B צמיחה. באמצעות שילוב של גבוה titer EBV וסוכן מדכאות חיסון, אנו מסוגלים בעקביות להדביק, לשנות, וליצור LCL מתאי B בדם ההיקפי. שיטה זו משתמשת בכמות קטנה של כדוריות דם היקפיים mononuclear נגועים בצברים של תאים במבחנה ניתן להדגים. הנוכחות של CD23 עם EBV בנוכחות FK506, תא T החיסון. באופן מסורתי, תולדה של תאים B מתרבים מנוטר על ידי ויזואליזציה של אשכולות מיקרוסקופי של תאים כשבוע לאחר זיהום EBV. גושים של LCL ניתן לראות בעין בלתי מזוינת, לאחר מספר שבועות. אנו מתארים assay מוקדם לקבוע אם EBV בתיווך gשינוי rowth מצליח עוד לפני אשכולות מיקרוסקופי של תאים ניתן להדגים. הנוכחות של CD23 היי CD58 + תאים נצפתה כבר שלושה ימים לאחר הפגיעה מצביעה על תוצאה מוצלחת.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines at JoVE.com

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

אנו מתארים שיטה להפקת הפך תא B באמצעות קווי Epstein-Barr הוירוס. אנחנו גם להמחיש assay רומן שיכולה לזהות תאים B עתידה לעבור שינוי מוקדם ככל שלושה ימים לאחר ההדבקה.

הקמת Epstein-Barr Virus צמיחה הפך שורות תאים Lymphoblastoid

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.9K Views.  State University of New York at Stony Brook. אנו מתארים שיטה להפקת הפך תא B באמצעות קווי Epstein-Barr הוירוס. אנחנו גם להמחיש assay רומן שיכולה לזהות תאים B עתידה לעבור שינוי מוקדם ככל שלושה ימים לאחר ההדבקה.

Video: Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...