שיטה זו תאפשר לנו לבודד חלקיקי נגיף אפשטיין בר מקו התאים P3HR1 ולכמת את מלאי הנגיף כך שניתן יהיה להשתמש בו למטרות מחקר שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה קלה יחסית, זולה, מהירה ואמינה להכנת מלאי ויראלי EB. החלקיקים החיוניים המיוצרים בטכניקה זו יכולים לשמש במודלים ניסיוניים רבים במבחנה או in vivo לאבחון EB.To מתחילים, מכינים נפח של תרחיף תאים A בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, מתאימים את הנפח כך שמספר התאים הוא בערך 2.2 מיליון תאים לצלחת תרבית של 100 מילימטר.
הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבות שלם לצינור. הוסף 80 מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד לצינור. לאחר מכן הוסף 350 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר PMA לצינור.
הריכוז הסופי של PMA צריך להיות 35 ננוגרם למיליליטר, וזה של DMSO צריך להיות 0.08% הוסף 4.27 מיליליטר של מדיום תרבית, כך שהנפח הכולל הוא 10 מיליליטר. מערבבים את תכולת הצינור על ידי הטיה, ואז מעבירים את התוכן לצלחת תרבית של 100 מילימטר. השאירו את הצלחת באינקובטור של תרבית תאים למשך חמישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני.
לאחר חמישה ימים באינקובטור צנטריפוגה את תוכן הצלחת ב 120 G במשך שמונה דקות כדי לזרוק את התאים לאסוף את הנגיף ללא תאים המכיל supernatant ולהשליך את כדור התא. שוב צנטריפוגה supernatant ב 16, 000 G במשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לזרוק את חלקיקי הנגיף. יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות את גלולת הנגיף בחמישה מיליליטרים של מדיום תרבית, Aliquot את ההשעיה הנגיפית לתוך 20 צינורות שכל אחד מהם מכיל 250 מיקרוליטר של התרחיף הנגיפי, ולאחסן את ההשעיה במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי להפריד את החלבונים מהדנ"א מוסיפים 500 מיקרוליטרים של פנול רווי טריס לאחד הצינורות המכילים את ההכנה הנגיפית. הוסף 100 microliters של מים מערבולת היטב כדי להשיג תחליב ורוד. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 9, 650 גרם, לאסוף את supernatant ולהעביר אותו חדש 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה צינור.
הוסיפו כמות שוות ערך לעשירית מנפח הנתרן אצטט הקר וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר גליקוגן, ומערבבים על ידי פיפטינג. הוסיפו פי שלושה מנפח הקור של הסופר-נטנט 100% אתנול ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לבודד את צנטריפוגת הדנ"א הנגיפית ב-9, 650 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט כדי לקבל גלולת DNA ושטפו את הכדור שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 70% אתנול קר. שוב צנטריפוגה ב 9, 650 G במשך 15 דקות ולהשליך את supernatant.
לאחר ייבוש האוויר של הכדור במשך כ-10 דקות, יש להשעות את הכדור ב-10 עד 50 מיקרוליטרים של מים מזוקקים נטולי נוקלאז. אחסנו את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להבטיח פירוק מרבי של הדנ"א, ולאחר מכן אחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר ניקוי הכן של מיקרו ספקטרופוטומטר עם מגב משימה עדין לטעון מיקרוליטר אחד של דגימת הדנ"א מוכן ולשים לב לריכוז הדנ"א בדגימה.
בדוק את יחסי הספיגה הן ב-260 עד 280 ננומטר, והן ב-260 עד 230 ננומטר. דנ"א ייספג ב-260 ננומטר, חלבונים ב-280 ננומטר, וחומרים אורגניים כמו פנול ייספגו ב-230 ננומטר. יחס של 1.8 ל -2 נחשב מספיק עבור PCR בזמן אמת.
כדי להכין את תערובות התגובה של PCR, הניחו חמישה מיקרוליטרים של תערובת PCR בזמן אמת בצבע ירוק סייבר בצינורות PCR של 0.2 מיליליטר. הוסף מיקרוליטר אחד של 7.5 שומות פיקו לכל מיקרוליטר פריימר קדמי ומיקרוליטר אחד של 7.5 שומות פיקו לכל מיקרוליטר של פריימר הפוך לכל צינור. כאן, גן RNA 2 קטן EBV מוגבר.
כדי לקבוע את מספר עותק הגנום של EBV. לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז ומיקרוליטר אחד של דנ"א נגיפי לאחד הצינורות. הנפח הכולל של תערובת התגובה הוא 10 microliters.
הכן צינורות אחרים שישמשו כתקנים עם מספרי העתקי גנום ידועים של EBV. הפעל את תערובות ה- PCR החל משלב הפעלה ראשוני ב- 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. ואז 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות, וב 58 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.
ייצא את כל גיליונות הנתונים כקבצי CSV וחשב את היומן של מספר עותקי הגנום של EBV לכל שפופרת סטנדרטית וערכי CQ ממוצעים. צור עקומת תקן qPCR על ידי התוויית ערכי ה- CT של התקנים כנגד היומן של מספר עותקי הגנום. באמצעות משוואת העלילה העקומה הסטנדרטית, לגזור את מספר עותקי הגנום של EBV בצינור ה-PCR המכיל את הדנ"א הנגיפי המושרה.
לבסוף, השתמש בנוסחה המוצגת על המסך כדי לחשב את הריכוז של הכנה ויראלית המושרה. כאן X הוא מספר עותקי הגנום של EBV הנגזרים מהעקומה הסטנדרטית, ו-F הוא גורם הדילול המשמש להגדרת הדנ"א לתגובת PCR. ספירת תאים באמצעות תא המוציטומטר מוצגת כאן.
ארבעה רבעים נספרים באמצעות מיקרוסקופ אור. כאן יש לספור תאים המסומנים בכחול, בעוד שאין לספור תאים באדום, מכיוון שהם נוגעים בגבולות העליונים, הימניים, התחתונים או השמאליים של הרבע. ניסוי אופטימיזציה בוצע כדי לקבוע את הריכוזים של PMA ודימתיל סולפוקסיד שיניבו את המספר הגבוה ביותר של חלקיקי EBV.
ריכוז DMSO של 0.8% וריכוז PMA של 35 ננוגרם למיקרוליטר היו אופטימליים והביאו לריכוזי EBV גבוהים. המעבדה שלנו השתמשה בחלקיקים החיוניים המיוצרים בטכניקה זו כדי לבחון תגובות אוטואימוניות או דלקתיות פרו-דלקתיות לנגיף זה. כמו גם לפתח סוכני אנטי EBV חדשים.
