אנו מודים לצוות על מעבדות פתולוגיה אנטומית של הנסיך המלכותי אלפרד חולים קונקורד והרפטריאציה לאיסוף דגימות טריים של CRC ו רירית מעיים רגילה. העבודה מומן על ידי מענק מכון הסרטן בניו דרום ויילס תוכנית Translational.

<img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. תרשים זרימה עבודה להכנת השעיה של תאים חיים ממדגם כירורגית של CRC. 1. מדגם קלינית disaggregation כל הדגימות נאספו הנסיך המלכותי אלפרד החולים (קמפרדאון, NSW, אוסטרליה) ובית החולים והרפטריאציה קונקורד (Concord המערבית, NSW, אוסטרליה) עם הסכמה מדעת לפי פרוטוקול מס &#39;164-X08. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף סרטן המעי הגס טרי (CRC) או דגימות אדנומה, ואת רירית המעי נורמלי לפחות 10 ס&quot;מ מן הגידול. חנות דגימות ה-pH מאוזן של האנק מלח פתרון 7.3 (HBSS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך שעות עד 12 לאחר כריתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר תקנות הבטיחות עבור פתוגנים אנושיים, כל תהליך דוגמאות קליניות בארון ביולוגי בטיחות בכיתה השנייה. מנתחים את הדגימות לתוך 2 קוביות מ&quot;מ בצלחת פטרי באמצעות שני להבי אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הגידול לבין הרקמות הבריאות של צינורות נפרדים Eppendorf עם ערבוב עדין מדי פעם במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם נפח שווה של המדיום 1640 RPMI המכיל 2% (v / v) סוג collagenase 4 (וורטינגטון, לייקווד, ניו ג&#39;רסי, ארה&quot;ב) ו - 0.1 (w / v)% deoxyribonuclease אני מ pancrease שור (DNAse אני; סיגמא אולדריץ &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיל מעוכל למחצה רקמה דרך מסננת רשת תיל דק באמצעות הבוכנה של מזרק 10 מ&quot;ל; תאים דרך לשטוף עם HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pass כתוצאה ההשעיה התא דרך 200 מיקרומטר ו 50 פילטרים Filcon מיקרומטר (BD Biosciences) כדי להסיר אגרגטים התא. רוב אגרגטים, DNA ריר תא יוסרו בסדרה זו של filtrations. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיות התא XG ב 400 ° 20 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא Resuspend בחום FCS-מומת המכיל sulphoxide דימתיל 10% (DMSO), להקפיא לאט cryovials ולאחסן ב -80 מעלות. תהליך הקפאה נוטה להפחית ליחה המדגם lyses כדוריות דם אדומות. </li></ol> 2. לדוגמא כהכנה ללכוד תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר דגימות במהירות באמבט 37 מעלות מים ותאי resuspend ב 10 מ&quot;ל של HBSS לשטוף את DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיות התא XG ב 410 ° 20 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 μL של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את המדגם עם 0.1% (w / v) DNAse אני עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 μL ההשעיה כל תא עם נפח שווה של trypan כחול לטעון 10 μL של התערובת לתוך hemocytometer. שימוש במיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 100, לספור תאים קיימא, אשר מופיעים ברור עקב הרחקה trypan כחול, בעוד תאים מתים לקחת את צבען. מינימום 4 x 10 6 תאים קיימא נדרש ללכוד תאים על microarray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טיפול DNAse, resuspend ההשעיה תא HBSS 10 מ&quot;ל ו 410 צנטריפוגות ב XG ב ° 20 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatants וכדוריות תא resuspend ב RPMI 1640 עד נפח סופי של 200 μL. </li></ol> 3. Microarray נוגדן תא ללכוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלח microarray נוגדן DotScan על ידי טבילה בסעיף nitrocellulose לתוך בופר פוספט (PBS) למשך כ 20 שניות לנגב בזהירות את שולי כוס microarray עם Kimwipes מקופל, הימנעות נוגע בסעיף nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים למגש הדגירה microarray לספק קאמרית לח. מניחים את microarray החדרה ו פיפטה ההשעיה תא RPMI 1640 על החלק nitrocellulose לח. פיפטה טיפות בכל פינה של nitrocellulose כדי להבטיח להתפשט גם של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה microarrays ב 37 ° C עבור 1 ח הדגירה מאפשר לתאים להתיישב לבוא במגע עם נוגדנים על microarray. תאים להביע את פני השטח אנטיגנים המתאימים את הנוגדנים הם קרקע יהיה בשבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לטבול את microarrays בעדינות אנכית לשלושה שקתות המכיל לפחות 15 מ&quot;ל PBS כדי לשטוף את התאים מאוגד (20 s לכל לשטוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3.7% (w / v) הפורמלין PBS לתקן את התאים נוגדנים על ידי cross-linking. בעדינות פיפטה כ 1 מ&quot;ל על מנת לכסות את סעיף nitrocellulose של microarray. דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא לטבול microarrays לתוך 3 שינויים של PBS (15 מ&quot;ל, 30 של כל אחד) כדי לשטוף את עודפי פורמלדהיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הקצוות האחוריים של שקופיות הזכוכית עם Kimwipes ולסרוק את microarray באמצעות סורק תוך DotScan, בסעיף nitrocellulose לח. סריקה אופטית מספק את הביטוי אנטיגן דפוס של אוכלוסיה מעורבת תאים תאים למשל CRC, לויקוציטים ותאי סטרומה אחרים של הגידול. </li></ol> 4. Fluorescence ריבוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את microarray מהסורק וליישם 200 μL של חיץ חסימה (2% w / v BSA, 2% חום אנושי מומת א.ב. בסרום, PBS, pH 7.3). דגירה זה במגש microarray בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את multiplexing פתרון בצינור Eppendorf מכוסה בנייר אלומיניום: 20 μL Phycoerythrin-אנטי CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, אוסטרליה, # IM12824: 1/7.5 הדילול הסופי), 10 μL אלקסה פלואוריד 647-אנטי EpCAM (Biolegend, בסן דייגו, קליפורניה, ארה&quot;ב; 1 / 15 דילול), 2 μL של חום אנושי מומת א.ב. בסרום (סיגמא אולדריץ, Castle Hill, NSW, אוסטרליה) ו 118 μL של חיץ חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את החיץ חסימת עודף מ microarray ו פיפטה פתרון רבוב על הקטע nitrocellulose, מתפשט באופן אחיד. דגירה למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את microarray אנכית לשלושה שקתות של 15 מ&quot;ל PBS טרי; (30 של כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו microarrays היבש בחושך חנות ב 4 ° C בתיבת שקופיות. Microarray ניתן לאחסן בחושך עד 3 חודשים ללא הפסד של הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את microarray יבש באמצעות FLA טייפון 9000 סורק (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, אוסטרליה) עם רזולוציה להגדיר עד 50 (532 ננומטר לייזר, 580 BP30 פליטת לסנן PE. הלייזר 633 nm ו 670 BP30 פליטת סינון עבור Alexa 647). Microarrays נסרקים עם הצד nitrocellulose פונה כלפי מטה על מגש זכוכית הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונות פלורסנט כקובצי TIFF באמצעות תמונת Photoshop גודל מוגדר 17 x 25 ס&quot;מ ורזולוציה עד 72 פיקסלים / ס&quot;מ. ייבוא ​​התמונה אל התוכנה ניתוח DotScan לנתח את העוצמה של נקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DotReader לוכדת תמונה דיגיטלית של הדפוס מחייבת נקודה מכמת את צפיפות התאים מחייב על כל נקודה נוגדן בקנה מידה האפרוריות 8 סיביות (1-256 U). השליטה מזדמנים שאינם ספציפיים מחייב אלוטיפ היה מופחתים הערכים מחייב נוגדנים עם isotypes אימונוגלובולינים המקביל. עוצמות הקרינה עבור דוט microarray כל היו מנורמל נגד נקודה הבהיר סט בעוצמה של 100%. האות / נקודה כוח נרשם בקובץ XML. (נתונים גולמיים) או כפי שהוא מיוצג בתרשים בר. קובץ PDF (הדו&quot;ח הסופי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microarray heatsmaps ו באשכולות היררכי נערכו באמצעות MultiExperiment Viewer (MeV) גרסה 4.4 של TM4 microarray Software Suite ( <a href="http://www.tm4.org/mev.html">http://www.tm4.org/mev.html</a> ). אשכולות היררכי בוצעה על רקע נתונים מנוכי באמצעות MeV עם ניתוח הצמדה מלאה. המרחק האוקלידית שימש למדידת הדמיון. סטודנט 2 זנב של t-מבחן עם שונות שווה שימש כדי לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות. </li></ol> 5. נציג תוצאות: תוצאות מ microarray DotScan צריך להראות דפוסים תא עקבי מחייב בין מערכים כפולים. נקודה חזקה יישור מחייב (CD44/CD29) מאפשרת לרשת להציב על שטח המערך. תרשים 2 מציג דוגמה ללכוד תאים ריבוב אופטימלית. איור 3 מראה כמה בעיות נפוצות נתקל במהלך ללכוד תאים ועל הפתרונות האפשריים. התוצאות תא microarray מחייב ניתן לכמת על ידי מדידת עוצמות נקודה הביע בקנה מידה האפרוריות בטווח שבין 1 ל 256. איור 4 מראה נתונים מספריים מתוך 58 דגימות כירורגית CRC, מוכתם נוגדן 647 EpCAM-Alexa, כמו Heatmap עם אשכולות היררכי. למרות מספר דגימות מוגבל, CRCs הבמה באותו נוטים אשכול באותה קבוצה. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Cell דפוס מחייב קלינית של הגידול בסרטן המעי הגס (Staging האוסטרלי Clinic-פתולוגי, ACP הבמה B1). (א) DotScan מפתח נוגדנים מראה מקומות של נוגדנים לחצי השמאלי של microarray כפולות (בקווים כלליים). המקטע העליון מכיל את 82 המקורי נוגדנים של microarray הלוקמיה DotScan. נוסף 40 נוגדנים, המתאים אנטיגנים ספציפיים השטח נמצא למעלה מוסדר בספרות, נוספו כמו microarray &quot;לווין&quot; CRC. המקטע התחתון מכיל נוגדנים לשלוט אלוטיפ (ב) תמונה אופטי של תאים CRC מחייב microarray. (ג) CD3 תמונה הקרינה מראה מתאי T. (ד) EpCAM הקרינה תמונת מראה תאים CRC. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. דוגמאות של תוצאות DotScan עניים פתרונות אפשריים. (א) תא נמוכה מחייב; פתרון: לוודא לפחות 4x106 קיימא הם תאים במערך (ב) תא אלוטיפ לשלוט מחייב הלא ספציפית מחייב; פתרון: להוסיף החום האנושי מומת א.ב. בסרום לטעום לפני הדגירה על microarray כדי למזער אלוטיפ לשלוט מחייב. מדי פעם, כמות קטנה של הכריכה הלא ספציפית של תאים nitrocellulose מתרחשת עם דגימות CRC ואינו להשפיע באופן משמעותי על התוצאות. (ג) Nitrocellulose להתייבש במהלך הדגירה; הפיתרון: להבטיח מדגם מכסה את סעיף nitrocellulose שלם microarray הוא מודגרות על משטח שטוח. (ד) ממצאים רקע גבוהה; הפיתרון: להבטיח אתmicroarray הוא שטף ביסודיות הדגירה הבאה. <img src="/files/ftp_upload/3322/3322fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. DotScan תוכנה לניתוח שנוצר תרשימים בר המייצגים צפיפות תא מחייב בקנה מידה האפרוריות בטווח שבין 1 ל 256. מספרים על ציר מתייחסים אנטיגנים CD. קיצורים אחרים TCR, T-cell receptor, κ, λ, אור אימונוגלובולינים שרשראות, SIG, אימונוגלובולינים פני השטח; DCC, שנמחקו חלבון סרטן המעי הגס; EGFR, אפידרמיס קולטן גורם גדילה, FAP, הפעלת חלבון פיברובלסטים, HLA-A, B, C-HLA-DR, אנטיגנים לויקוציטים אנושיים DR ו A, B, C בהתאמה, מיקה, MHC בכיתה אני שרשרת הקשורות חלבון, MMP-14, metallopeptidase מטריקס 14; PIGR, קולטן אימונוגלובולינים פולימריות, כפית-1, thrombospondin-1; Mabthera, humanised אנטי CD20. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3322/3322fig4large.jpg">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a> .

<ol>
	<li>Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+proteomics+in+the+diagnosis+and+outcome+prediction+in+colorectal+cancer.">The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer.</a> Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).</li><li>Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Institutes+of+Health+Consensus+Development+Conference+Statement:+adjuvant+therapy+for+breast+cancer.">National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer.</a> J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).</li><li>Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+classification+of+tumour+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues.">WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues.</a> IARC WHO Classification of Tumours. 2, (2008).</li><li>Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+proteomics+and+cancer+biomarker+discovery.">Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery.</a> Clin. Med. Oncol. , (2008).</li><li>Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+leukaemias+and+lymphomas+using+extensive+immunophenotypes+from+an+antibody+microarray.">Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray.</a> Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).</li><li>Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+repertories+of+surface+antigens+on+leukemias+using+an+antibody+microarray.">Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray.</a> Proteomics. 3, 2147 (2003).</li><li>Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+antigen+profiling+of+colorectal+cancer+using+antibody+microarrays+with+fluorescence+multiplexing.">Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).</li><li>Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+surface+molecules+on+colorectal+cancers.">Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers.</a> Proteomics. 6, 1791 (2006).</li><li>Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+mucin.">Rheology of mucin.</a> Methods Mol. Biol. 125, 99 (2000).</li><li>Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+for+cDNA+microarray+data:+a+robust+composite+method+addressing+single+and+multiple+slide+systematic+variation.">Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation.</a> Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).</li><li>Al Saeed, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMA:+A+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> BioTechniques. 34, 374-378 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך microarray נוגדן DotScan ניתן להשתמש דרך פשוטה וכמותיות, ללמוד אנטיגן פרופילים השטח עבור אוכלוסיות תאים מרקמות CRC. קבלת השעיה בת קיימא תא בודד מרקמת הוא קריטי להצלחה של הניסוי, כי האנרגיה תלויה בתהליכים (למשל, ...

The author's email has been corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/3322">Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing</a>. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au

Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> הנקס &quot;פתרון מאוזן מלח </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> H6136-10X1L </td><td> שנאגרו עם 25 Hepes מ&quot;מ (Sigma # H3375) </td></tr><tr><td> Airpure בטיחות ביולוגית ארון מעמד II </td><td> Westinghouse </td><td> 1687-2340/612 </td><td></td></tr><tr><td> כירורגי להבי </td><td> ליווינגסטון </td><td> 090609 </td><td> חבילת של 100 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 עם 2 mM Hepes </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> R4130-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase סוג 4 </td><td> וורטינגטון </td><td> 4188 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease 1 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> DN25-1G </td><td></td></tr><tr><td> Terumo מזרק (10 מ&quot;ל) </td><td> Terumo </td><td> אס 10 L </td><td> קופסא של 100 </td></tr><tr><td> Filcon מסנן (200 מיקרומטר) </td><td> BD Biosciences </td><td> 340615 </td><td></td></tr><tr><td> Filcon מסנן (50 מיקרומטר) </td><td> Filcon מסנן (50 מיקרומטר) </td><td> Filcon מסנן (50 מיקרומטר) Filcon מסנן (50 מיקרומטר) 340,603 </td><td></td></tr><tr><td> עגל עוברית בסרום </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה 5810 R </td><td> Eppendorf </td><td> 7017 </td><td></td></tr><tr><td> דימתיל sulphoxide </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocymeter Technocolor Neubar </td><td> הירשמן </td><td> לא זמין </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ אור </td><td> ניקון </td><td> Nikon TMS </td><td></td></tr><tr><td> Cyrovial צינורות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 121278 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo contrainer הקפאת </td><td> Nalgene </td><td> 5100-0001 </td><td></td></tr><tr><td> DotScan נוגדן microarray ערכת </td><td> Medsaic </td><td> לא זמין </td><td></td></tr><tr><td> DotScan microarray מגש לשטוף </td><td> Medsaic </td><td> לא זמין </td><td></td></tr><tr><td> KimWipes </td><td> קימברלי קלארק </td><td> 4103 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלדהיד 37% </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F1635-500ml </td><td></td></tr><tr><td> DotReaderTM </td><td> Medsaic </td><td> לא זמין </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A9418-10G </td><td></td></tr><tr><td> חום מומת א.ב. בסרום 2% </td><td> Invitrogen </td><td> 34005100 </td><td></td></tr><tr><td> Phycoerythrin מצומדות-CD3 </td><td> Beckman Coulter </td><td> ET386 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor647-מצומדות EpCAM </td><td> BioLegend </td><td> 324212 </td><td></td></tr><tr><td> טייפון FLA 9000 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9558-08 </td><td> לייזר 532 ננומטר, 580 BP30 פליטת לסנן PE. 633 ננומטר לייזר 670 BP30 פליטת לסנן Alexa647 </td></tr><tr><td> MultiExperiment Viewer v4.4 </td><td> TM4 microarray חבילת תוכנה </td><td> פתח - תוכנת קוד (אסמכתא 11) </td><td></td></tr></tbody></table>

colorectal cancer cell surface protein profiling using an antibody microarray and fluorescence multiplexing

הפרוגנוזה הסיווג הנוכחי של CRC מסתמך על היערכות מערכות המשלבים היסטופתולוגיות ממצאים קליניים. עם זאת, ברוב המקרים CRC, תפקוד לקוי של התא היא תוצאה של מוטציות רבים לשנות ביטוי חלבון ופוסט translational שינוי 1. מספר פני השטח אנטיגנים התא, כולל מקבץ של (CD) אנטיגנים בידול, זוהו סמנים פרוגנוסטיים פוטנציאליים או גרורתי CRC. אנטיגנים אלה הופכים סמנים אידיאלי כביטוי שלהם לעתים קרובות שינויים עם התקדמות הגידול או אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, כגון גידולים הסתננות לימפוציטים (TILs) לבין גידולים הקשורים מקרופאגים (TAMs). השימוש אימונוהיסטוכימיה (IHC) לטיפול בסרטן תת סיווג התחזית מבוססת היטב של כמה סוגי גידולים 2,3. עם זאת, לא &quot;סמן&quot; יחיד הוכיח משמעות פרוגנוסטית יותר מאשר הזמני המרפאה-פתולוגי או צבר הסכמה רחבה לשימוש דיווח הפתולוגיה שגרתי בכל המקרים CRC. גישה האחרונות יותר ריבוד פרוגנוסטיים של המחלה פנוטיפים מסתמך על פני השטח באמצעות חלבון פרופילים מרובים &quot;סמנים&quot;. בעוד פרופיל הביטוי של גידולים תוך שימוש בטכניקות proteomic כגון iTRAQ הוא כלי רב עוצמה על גילוי biomarkers4, זה לא אופטימלי לשימוש שגרתי במעבדות אבחון אינה יכולה להבחין סוגי תאים שונים באוכלוסייה מעורבת. בנוסף, כמויות גדולות של רקמת הגידול נדרשים עבור פרופיל של קרום גליקופרוטאינים מטוהרים פלזמה בשיטות אלה. בסרטון הזה תיארנו שיטה פשוטה אפיון פני השטח של תאים proteome קיימא מן disaggregated דגימות CRC באמצעות microarray CRC DotScan נוגדן. Microarray 122-נוגדן מורכב באזור 82-נוגדן תקן להכיר מגוון של השושלת הסמנים הספציפיים ליקוציט, מולקולות הדבקה, קולטנים סמנים של דלקת התגובה החיסונית 5, יחד עם האזור לווין לגילוי של 40 סמנים פרוגנוסטיים פוטנציאלי עבור CRC . תאים הם כבשו רק על נוגדנים שהם מבטאים את האנטיגן המתאים. צפיפות התאים לכל נקודה, נקבע על ידי סורק אופטי, משקף את חלקם של התאים לבטא כי אנטיגן, רמת הביטוי של אנטיגן ואת הזיקה של הנוגדן 6. עבור רקמת רירית המעי CRC או רגיל, סורק אופטי לשקף את immunophenotype של אוכלוסיות מעורבות של תאים. ריבוב Fluorescence לאחר מכן ניתן להשתמש בפרופיל הנבחר תת אוכלוסיות של תאים בעלי עניין שנתפסו על המערך. לדוגמה, 647-Alexa אנטי אפיתל הידבקות התא מולקולות (EpCAM; CD326), הוא אנטיגן הפאן אפיתל בידול ששימש לזהות תאים CRC גם לתאי האפיתל של רירית המעי נורמלי, בעוד Phycoerythrin אנטי-CD3, שימש כדי לזהות חדירה לתאי T-7. CRC DotScan microarray צריך להיות טיפוס אחר חלופה אבחון למערכת CRC אנטומית מבוססי הזמני.

Watch this Scientific Journal Video about Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing at JoVE.com

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

colorectal-cancer-cell-surface-protein-profiling-using-an-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Views.  University of Sydney. אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.

Video: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular localization can provide insights into the functional role of bacterial proteins. Surface localization of bacterial proteins is a key step towards identification of virulence factors involved in mechanisms of pathogenicity. 
Methods for fractionating leptospiral membranes 2-5 may be selective for a certain class of outer-membrane proteins (OMPs), such as lipoproteins vs. transmembrane OMPs, and therefore lead to misclassification. This likely is due to structural differences and how they are associated to the outer membrane. Lipoproteins are associated with membranes via a hydrophobic interaction between the N-terminal lipid moiety (three fatty acids) and the lipid bilayer phospholipids 6, 7. In contrast, transmembrane OMPs are typically integrated into the lipid bilayer by amphipathic &beta;-sheets arranged in a barrel-like structure 8, 9. In addition, presence of a protein in the outer-membrane does not necessarily guarantee that the protein or its domains are exposed on the surface. Spirochetal outer membranes are known to be fragile and therefore necessitate methods involving gentle manipulation of cells and inclusion of sub-surface protein controls to assess the integrity of the outer membrane.
Here, we present an immunofluorescence assay (IFA) method to directly assess surface exposure of proteins on intact leptospires. This method is based on recognition of leptospiral surface proteins by antigen-specific antibodies. Herein, antibodies specific for OmpL5410 are detetcted aftero binding to native, surface exposed epitopes. Comparison of antibody reactivity to intact versus permeabilized cells enables evaluation of cellular distribution and whether or not a protein is selectively present on leptospiral surface. The integrity of outer membrane should be assessed using antibody to one or more subsurface proteins, preferably located in the periplasm.
The surface IFA method can be used to analyze surface exposure of any leptospiral protein to which specific antibodies are available. Both the usefulness and limitation of the method depends on whether the antibodies employed are able to bind to native epitopes. Since antibodies often are raised against recombinant proteins, epitopes of native, surface-exposed proteins may not be recognized. Nevertheless, the surface IFA method is a valuable tool for studying components of intact bacterial surfaces. This method can be applied not only for leptospires but also other spirochetes and gram-negative bacteria. For stronger conclusions regarding surface-exposure of OMPs, a comprehensive approach involving several cell localization methods is recommended 10.

An efficient method to assess surface-exposure of leptospiral proteins is described. The method is specifically designed to avoid disruption of the fragile outer membrane of leptospiral cells. This technique requires employment of several negative controls to assess the integrity of the outer membrane and specificity of antibody reaction.

חיסונית פלואורסצנציה Assay של משטח חשוף חלבונים Leptospiral

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.