פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון אופטימיזציה פיתוח והעברה של פרוטוקולי immunofluorescence מולטיפלקס הוא מורכב ומאתגר. עבור מעבדות רבות אחיזת בוהן של פרוטוקול ממוטב הוא לא יסולא בפז. שפעת חיסונית רב-ספקטרלית מאפשרת לנו להעריך הן את המיקום והן את זהותם של סוגי תאים מרובים בגידול וברחביו.
זהו שילוב רב עוצמה של מידע במחקרים אונקולוגיים חיסוניים. השימוש המשכנע ביותר עבור immunofluorescence מולטיפלקס הוא אונקולוגיה חיסונית. אבל היכולת לסקר סוגי תאים חיסוניים מרובים ב setu ניתן למנף על פני כל טיפולים אוטואימוניים ודלקתיים.
לדעת את המיקום ואת פנוטיפ של תאים חיסוניים בתאים מוצקים סביב הוא גם פרוגנוסטי וצפוי תגובות אימונותרפיה ספציפית לגידול. המיטוב וה האימות של הפרוטוקול הם שלבי מפתח שלא יש למהר. מפתחים חדשים צריכים להכיר את הסוגים החדשים של חפצים הקשורים הדמיה רב ספקטרלית.
כדי לאתר את פרוטוקול multi-plex הבסיסי לטעון אותו מראש על התכתם האוטומטי. סנן עבור הכל'במקום 'מועדף' במסך הפרוטוקול. לפני ביצוע שינויים שמור את הפרוטוקול המקורי ולחץ על הכרטיסיה פרוטוקולים, ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אופל 6 Multiplex כדי לבחור עותק.
שנה את השם ל- 7 Multiplex Protocol 1'in החלון החדש ובחר את הכרטיסיה המשויכת להתקן הנכון. להתאים את הפרוטוקול בטבלה משלימה S1'ולחץ להוסיף reagent להוסיף צעד עיכוב paroxidies עשר דקות, בחירת מעכב peroxidase כמו reagent. אשר כי שלבי החסימה משתמשים במאגר חסימת מעכבי חלבון קינאז, שכל אנטי-גוף ראשי מתייחס לריג'נט המתאים, שהצעדים המשניים נגד הגוף משתמשים בפולימר חזרת פרוקסידאז ושכיתת האוטומציה הספקטרלית המסופקת עם ערכת האוטומציה הרב-ספקטרלית מנוצלת.
ודא כי הפרוטוקול מכיל את מעכב peroxidase, ואחריו שישה כתמים רציפים פועל כל המכיל צעד חסימת חלבון, אנטי גוף ראשוני, אנטי גוף משני, רצפת Tyramide, ולאחר מכן אחזור אנטיגן כדי להסיר את האנטי גופים. כדי להוסיף את פקדי השחרור, העתק את השם 7 פרוטוקול מולטיפלקס 1', ושנה אותו ל- 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. שנה את ה- CD68 נגד גוף ה- reagent לעכבר IgG ושמור את הפרוטוקול.
לאחר מכן, צור שישה פרוטוקולים חדשים נוספים, אחד עבור כל פקד שחרור ואחד עבור פקד iso-type המלא באותו אופן. הפוך פרוטוקול בקרת שחרור לכל יעד באותו אופן כמו שהראיתי לך כאן. כדי להכין ערכת זיהוי מחקר, מלא את המיכל הפתוח באורך 30 מיליליטר המסומן עבור מלוחים עם חיץ טריס 1X עם תמיסת מלח עם חיץ טריס 1X, והצב את המיכל במיקום הרחוק ביותר מהידית בערכת המחקר Multiplex 1.
סמן שתי מכולות פתוחות של 30 מיליליטר, בלוק מולי-ספקטרלי ומשני רב-ספקטרלי, ומלא את מיכל הבלוקים המוטלי-ספקטרלי ב-30 מיליליטר של שקע נוגדן חיץ חוסם מערכת הכתמים הרב-ספקטרלית. מלאו את המיכל המשני הרב-ספקטרלי ב-30 מיליליטר של פולימר נוגדנים משני נגד כלבת נגד עכברים מערכת הכתמים הרב-ספקטרלית והוסיפו 600 מיקרוליטרים של דילואנט נוגדנים לכל אחד מעשרה מיכלים פתוחים 7 מיליליטר. לאחר מכן, מוסיפים את הנוגדן העיקרי המרוכז לצינורות המתאימים בנפחים המצוינים בטבלה, ומערבבים על ידי צינורות עדינים.
הוסף 3 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים, בתוספת 12 טיפות של dapi ספקטרלי לתוך אחד 7 מיליליטר מיכל פתוח, ו 3 מיליליטר של בלוק peroxidase לתוך מיכל פתוח 7 מיליליטר השני. להשעות מחדש כל רצפה liathalized עם 75 microliters של דימתיל סולפוקסיד ומערבבים על ידי צינורות. לאחר מכן, לאחסן את מניות רצפת הגברה אות Tyramide ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן.
בעת הכנת דילול הרצפה TSA בודדים. רשום את כל חברי ההנהלה על הכתם האוטומטי, ולאחר מכן מקם כל מיכל בארון תקשורת של רייגנט וטען את כל חברי ההנהלה על הכתם האוטומטי. הכתם יזהה את הנוכחות ויאשר את עוצמת הקול של כל רהגנט.
לאחר שכל חברי ההנהלה נטענו, הפעל את הפרוטוקול כדי לפעול במשך הלילה. בסוף הליך הכתמים, טען את הדגימות עם תלושי כיסוי וטען את הדגימות לסורק פלטפורמת ההדמיה הרב-ספקטרלית לסריקה. לאחר שכל הדגימות נסרקו, התמונות יעונו כקבצי qptiff.
פתח תוכנה מתאימה לניתוח qptiff ולחץ על טען שקופית'כדי לפתוח סריקת שקופיות שלמה של חמישה מסננים של שקופית העניין. התחברו בכלי הבולים ולהשתמש בו לבחירת חמישה אזורים להדמיה רב-ספקטרלית. תחת בחר עבור:בחר רכישה'תחת גודל בשדות:בחר 1x1 ותחת רזולוציית שדה'בחר 0.5 מיקרומטר 20x.
בהתבסס על זה כתם cytokeratin לבחור מספר אזורים עם רקמת גידול חיובית cytokeratin, ו cytokeratin רקמת סטרומה שלילית להיות בתמונה מן הסריקה הכוללת. לאחר שכל התמונות הרב-ספקטרליות נבחרו, עבור לתוכנת Vectra ושנה את המשימה מסריקה להדמיה רב-ספקטרלית עבור כל שקופית. לאחר מכן, לחץ על סריקה כדי לבצע את איסוף ההדמיה הרב-ספקטרלי.
לאחר השלמת רכישת התמונה הרב-ספקטרלית, השתמש בתוכנת ביטול הערבוב הספקטרלית כדי לפתוח קבצים בתוך תיקיית התמונות הרב-ספקטרלית. תחת תבנית תמונה'בחר רב-ספקטרלי'תחת תבנית לדוגמה'בחר פלואורסצנטיות'ות ותחת מקור ספרייה ספקטרלי'בחר ב-Form'כדי לבחור את הרצפות, בחר וטען את כל שש הקומות, ו-dapi משקופיות הספריה לדוגמה ולחץ על הכן הכל. התוכנה הספקטרלית ללא ערבוב תבצע unmixing ספקטרלי על כל התמונות הפתוחות באמצעות פרופילים ספקטרליים שסופקו.
זהה ובאר את הפרופיל הספקטרלי הפלורסנטי האוטומטי. הקפד לבדוק את התכונה פלואורסצנטי אוטומטי כדי לבטח כי הוא נתפס לחלוטין בערוץ פלואורסצנטי אוטומטי לאחר ביטול ערבוב ולבדוק דגימות שונות עד שהוא מוסר מקובל. לאחר מכן להעריך את דפוס הכתמים נגד כתמים בודדים כרומוגניים של אותה מטרה בשקופיות רציפות של אותה רקמה עם פתולוג.
כדי להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל ערוץ, השתמש בכלי ספירות כדי לסקר את התמונות הפתוחות. לאחר מכן, חזור לפרוטוקול הכתמים והתאם את ריכוז ה- TSA כדי לטפל בספירות מנורמלות החורגות או אינן מצליחות להגיע לטווח המקובל. בניתוח מייצג זה רקמת השקדים הדגימה כתם ציטוקרטין מוגדר בבירור בתוך פני השקדים, אפיתל קש קשתי ללא רקע ברקמת הלימפה עם ציטוקראטין וכתמים PDL-1 ניכרים באפיתל המרושת של הקריפטות.
המרכזים הנבטיים הזקיקיים היו קלים לזיהוי ועשירים בלימפוציטים חיוביים Ki-67. המקרופאגים הקיימים במרכזים הנבטיים זוהו על ידי ביטוי CD-68 שלהם עם מקרופאגים מסוימים שנצפו גם מחוץ למרכז הנביטה. לימפוציטים מוכתמים CD-8 עם התפלגות תאי T וביטוי PD-1 מוכתמים בחוזקה לימפוציטים קטנים מקובצים בשולי המרכז הנביטתי, כמו גם מפוזרים ברחבי האזור הבין-פלגי.
לאחר דפוס הכתמים הצפוי אושר בבקרת רקמת השקדים, ניתן היה להעריך את אותו כתמים בדגימה לסרטן ריאות. יש להעריך גם פקדים שליליים ופקדי טיפה של Isotype;לא רק לגילוי רקע ו פלואורסצנטיות אוטומטית, אלא גם לאפקטי מטריה ודימום ספקטרלי. פקדי טיפה חשובים להערכת ממצאים פוטנציאליים בכתמים עקב שיטת immunofluorescence multi-plex במהלך אופטימיזציה של לוח multi-plex חדש.
כל בקרת ירידה צריכה להראות את אותה תבנית כתמים כמו הלוח מרובה ה-plex המלא, למעט הנוגדן העיקרי היחיד שיש להסיר בכל פקד ספציפי. פרופיל חיסוני עם immunofluorescence רב ספקטרלי מאפשר ריבוד של גידולים ואזורים על ידי קריטריונים חיסוניים אשר לאחר מכן ניתן לחקור על ידי מחקרים גנומיים מולטיפלקס מסיבי, transcriptomic, ו proteomic. השתמשתי בכשל חיסוני רב-plex כדי לחקור מנגנוני פעולה באונקולוגיה ובהפרעות אוטואימוניות המאפשרות זיהוי ואפיון של תאים חיסוניים ופתוגניים בחלק אחד בקבוצה.
אמצעי זהירות כלליים יש לנקוט בעת עבודה עם אנטי גופים נגד חלבונים אנושיים, Tyramide ו dapi, אבל שום reagent או חומר בפרוטוקול זה ידוע להיות מסוכן במיוחד.
