אנו מודים למרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, במימון המרכז הלאומי למשאבי מחקר של NIH (NCRR), על חלק מזני הנמטודה. נוגדנים חד שבטיים שפותחו על ידי ה.פ. אפשטיין התקבלו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה- NICHD ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת איווה. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הישראלית למדע (מענק מס' 278/18) ובמענק ממשרד המדע והטכנולוגיה ומשרד החוץ ושיתוף הפעולה הבינלאומי, המנהל הכללי לקידום המדינה, הרפובליקה האיטלקית (מענק מס' 14337). אנו מודים לחברי מעבדת בן צבי על העזרה בהכנת כתב יד זה.

1. הכנת לוחות מדיה צמיחה נמטודה עבור RNAi
<ol><li>לבקבוק 1 L, הוסיפו 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של Bacto-Peptone, 17 גרם אגר ומים מזוקקים עד 1 L ו autoclave.</li>
	<li>בקבוק מגניב ל 55 °C (55 °F).</li>
	<li>הוסף 25 מ"ל של 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO4, ו 1 מ"ל של פתרוןכולסטרול (טבלה 1) כדי להפוך את מדיה צמיחה נמטודה (NGM).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 0.5 מ"ל של 1 M IPTG(טבלה 1) כדי להפוך פתרון NGM-RNAi. הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli הנפוצים מכילים פולימראז DNA T7 שאינו ניתן לתמיכת IPTG המשמש להבעת פלסמידים קידוד dsRNA. פלסמידים אלה מקודדים גם עמידות באמפיצ'ילין.</li>
	<li>מערבבים את התמיסה החמה על ידי מערבולת הבקבוק.</li>
	<li>בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, יוצקים את תמיסת ה- NGM לצלחות או באמצעות משאבה פריסלטית, מחלקים את הפתרון לצלחות. השתמש 6-טוב, 12-טוב, 40 מ"מ או 60 מ"מ לוחות עבור מסך זה. אגר צריך למלא בערך 2/3 מעומק הצלחת.</li>
	<li>תן את הצלחות להתייבש לילה על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות. לוחות NGM עבור RNAi ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.</li>
</ol>2. גידול חיידקי RNAi וזריעת הצלחות
<ol><li>בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 2.5 מ"ל של טטרציקלין (5 מ"ג / מ"ל) (טבלה 1) לפתרון 1 ליטר אוטומטי מראש של פתרון LB ומערבב. הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli נפוצים עמידים לטטרציקלין.</li>
	<li>בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 600 μL של פתרון LB לכל באר 2 מ"ל עמוק 96-צלחות סטריליות. עדיף להשתמש בצנרת רב ערוצית לחלוקת המדיה.</li>
	<li>באמצעות הליכים סטריליים, לחסן בארות עם חיידקי HT115(DE3) E. coli השתנה עם פלסמיד קידוד dsRNA מיקוד גן של עניין או plasmid ריק, כמו שליטה. מכסים את הצלחות ודגר ב 37 °C (50 °F) לילה. ספריות המורכבות משיבוטים חיידקיים המבטאים dsRNA, המקביל לכ -94% מהגנים החזויים C. elegans נבנו בעבר22,23 והם זמינים מסחרית. ספריית המלווה ששימשה כאן נבנתה על ידי מעבדת ד"ר ריצ'רד מורימוטו26.</li>
	<li>באמצעות הליכים סטריליים, זרע 75, 150 או 250 μL של חיידקים על 12-well, 40 מ"מ ו 6-טוב או 60 מ"מ NGM RNAi לוחות, בהתאמה. סמן בבירור את שם גן המטרה על הלוח. חיידקים צריכים לכסות 30-50% משטח אגר ולא צריך לגעת בשולי הצלחת.</li>
	<li>אפשר צלחות להתייבש לפחות 2 ימים על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות. הערה: ניתן לדגור צלחות ב 37 °C (50 °F) לילה. ודאו שהבארות הפנימיות יבשות לפני השימוש או אחסון הצלחות. לכל המטרות לטווח ארוך (כלומר, ייבוש או אחסון) שמור את הצלחות בחושך. צלחות מיובשות, זרעים ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.</li>
</ol>3. סנכרון לא מלחיץ של עוברים
<ol><li>השתמש בבחירת תולעים כדי להעביר כ-100 ביצים מצלחת תולעת לא מסונכרנת ללוח גז טבעי נוזלי שזה עתה נזרע.</li>
	<li>לטפח בעלי חיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בעלי חיים צריכים להגיע ליום הראשון של הטלת ביצים. הערה: תולעים מעובדות בדרך כלל ב 20 °C (50 °F). עם זאת, זנים מוטנטיים מלווים שונים עשויים לדרוש טמפרטורות טיפוח ספציפיות. לדוגמה, זנים רגישים לטמפרטורה רבים מעובדים ב 15 °C (5 °F) אבל עבר 25 °C (5 °F) כדי לחשוף פנוטיפ שלהם.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9(טבלה 1)לאט והרחק מהמדשאה החיידקית. סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת. הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.</li>
	<li>חזור על שלב 3.3 שלוש פעמים או עד שכל החיות נשטפות מהצלחת.</li>
	<li>בעזרת קצה פלסטיק סטנדרטי, חותכים ריבוע אגר מהצלחת השטופה שבה מרוכזות הביצים ומניחים את חתיכת אגר על צלחת NGM חדשה. הערה: ~ 200 ביצים נדרשים לייצר מספיק בעלי חיים מטילי ביצים; יותר מדי בעלי חיים צורכים את החיידקים מהר מדי. רמות מזון נמוכות יכולות להשפיע על פרוטאוסטזיס27.</li>
	<li>לטפח את בעלי החיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בשלב זה, הצלחות צריכות להיות מכוסות בביצים מסונכרנות. הערה: ניתן להעביר בעלי חיים לצלחת חדשה למשך זמן קצר לסנכרון מחמיר יותר. עם זאת, חשוב להשתמש רק במבוגרים בשלבים המוקדמים של הטלת ביצים כמו בעלי חיים יכולים לשמור ביצים ברחם שלהם המשפיעים על סנכרון.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 לאט הרחק הדשא החיידקי.</li>
	<li>סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת.</li>
	<li>חזור על שלב 3.7 שלוש פעמים או עד שכל בעלי החיים נשטפים מהצלחת.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 והשתמש מגרד תא כדי לשחרר את הביצים מהצלחת.</li>
	<li>לאסוף את מאגר M9 המכיל את הביצים מהצלחות.</li>
	<li>צנטריפוגה חוצץ M9 המכיל את הביצים ב 3,000 x גרם במשך 2 דקות.</li>
	<li>הסר את supernatant ולהוסיף מאגר M9 כדי להגיע לאמצעי אחסון של 1 מ"ל.</li>
	<li>resuspend הביצים כדי לשבש כל גושים של ביצים וחיידקים.</li>
	<li>חזור על הליך הכביסה המתואר בשלבים 3.11-3.13 חמש פעמים. גלולה ביצה צריך להיראות לבן. אם הוא עדיין צהוב/חום, חזור על הכביסה עד להשגת גלולה לבנה. הערה: חיידקים שנותרו על הביצים יכולים לזהם את החיידקים המביעים dsRNA.</li>
	<li>הסר את רוב supernatant, משאיר על 200 μL. ביצים מסונכרנות ניתן להשתמש עבור מסכי RNAi.</li>
</ol>4. מבדים פנוטיפיים נפוצים
<ol><li>טיפוח בעלי חיים במהלך ניסויים<ol>
<li>מניחים טיפה של ~ 30 ביצים קרוב למדשאה החיידקית בכל צלחת זרעים RNAi. לעיון, יש גם להניח ~30 ביצים על צלחות זרעים עם חיידקים ריקים המכילים וקטור (L4440).</li>
		<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים לגיל על לוחות זרעי RNAi NGM. משך הניסוי יהיה תלוי בשלב שבו יש לעקוב אחר בעלי החיים וטמפרטורת הטיפוח. התאם את טמפרטורת הטיפוח בעת שימוש בחיות מוטנטיות רגישות לטמפרטורה. התאם את משך הטיפוח בעת שימוש בבעלי חיים מוטנטיים המתעכבים התפתחותית. הערה: בעוד התזמון יכול להשתנות, ברגע שבעלי חיים מגיעים לבגרות, הטלת ביצים (וצריכת המזון המהירה הנובעת מכך), כמו גם קריסת פרוטאוסטזיס תלוית גיל28, עלולה להשפיע על התוצאות. לכן מומלץ להבקיע בעלי חיים לפני תחילת הטלת הביצים (יום 1 לבגרות). חיות מסוג בר להגיע לשלב זה לאחר 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).</li>
		<li>מספר החזרות בהן נעשה שימוש יהיה תלוי בגודל ערכת הגנים שנבדקה. בספריית המלווה (97 גנים), ניסויים חוזרים לפחות ארבע פעמים. גודל האוכלוסייה תלוי באיזו נעשה שימוש. בהתקפות ההתנהגותיות שנדונו כאן, ציון >15 בעלי חיים לכל מצב ניסיוני בכל חזרה. נתונים ניתוחים סטטיסטיים גם תלויים מאוד בסוג של מבדק בשימוש. נתונים בבדקים שנדונו כאן יכולים להיות מוצגים כאמצעי ± SEM.</li>
		<li>השווה את בעלי החיים RNAi- וריק בקרה וקטורית התייחסו לאוכלוסיות עצמאיות. ניתן לחשב ערכי P באמצעות ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני, בהתאם לשינויים שנבדקו, כלומר מחמירים או מקלים לבד או שניהם. בעת בחינת טיפול RNAi יחיד לעומת בקרה, ערכי P ניתן לחשב באמצעות חד כיווני או דו כיווני מאן-ויטני דירוג סכום הבדיקה. מלבד מובהקות סטטיסטית, שקול סף להיטים בהתבסס על מידת ההשפעה על הפנוטיפ.</li>
	</ol></li>
	<li>מעצר/עיכוב התפתחותי<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי חיים גדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטור להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.</li>
		<li>נטר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקרוסקופ וספור את מספר הזחלים והמבוגרים כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים בהתפתחות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטורים. hsp-1 או hsp-90 RNAi טיפול תוצאות מעצר התפתחותי של חיות סוג בר והוא יכול לשמש שליטה חיובית.</li>
		<li>כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לאורך זמן, חזור על שלב 4.2.2. הערה: אם יש מבוגרים מטילי ביצים על הצלחת, להעביר את בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לצלחת חדשה NGM-RNAi שכותרתו לאותו גן יעד כדי למנוע בלבול עם צאצאים.</li>
	</ol></li>
	<li>סטריליות או הטלת ביצים פגמים<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להתחיל להטיל ביצים.</li>
		<li>לעקוב אחר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקוסקופ ולהשיג את אחוז בעלי החיים ללא ביצים גלויות ברחם שלהם. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית.</li>
		<li>לחלופין, לפקח על בעלי חיים באמצעות סטריאוטיקרוסקופ ולהבקיע את אחוז בעלי החיים עם רחם מלא ביצים, המוגדר EGg מטיל פגום (Egl-d) פנוטיפ29.</li>
	</ol></li>
	<li>קטלניות עוברית<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי החיים מתחילים להטיל ביצים.</li>
		<li>מעבירים ~ 100 ביצים לצלחת ריקה. מורחים את הביצים בשורות כדי לפשט את הספירה.</li>
		<li>ציון האחוז של ביצים unhatched על הצלחת לאחר 24-48 שעות. לעיון, השווה לביצים של בעלי חיים שטופלו בחיידקים ריקים לשליטה וקטורית.</li>
	</ol></li>
	<li>שיתוק אסאי<ol>
<li>עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים שליטה וקטורית להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.</li>
		<li>צייר קו על הגב של צלחת אגר NGM רגילה באמצעות סמן דק.</li>
		<li>מניחים 5-10 בעלי חיים על הקו המסומן.</li>
		<li>הגדר שעון זמן והמתן 10 דקות.</li>
		<li>ציון אחוז החיות שנותרו על הקו כמו תולעים משותקות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית. חיות מסוג בר שטופלו עם unc-45 RNAi להראות פנוטיפ שיתוק חמור והוא יכול לשמש שליטה חיובית. הערה: מעש זה מדגיש בעלי חיים המציגים שיתוק בינוני עד חמור. בעלי חיים כאלה בדרך כלל שוכבים ישר על הצלחת, במקום להציג את הצורה המעוקלת הנפוצה. יתר על כן, תיקון נקי מחיידקים נראה סביב ראשיהם של תולעים משותקות.</li>
	</ol></li>
	<li>חבטות אסאי<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.</li>
		<li>צינור 100 μL של חוצץ M9 בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים לתוך צלחת 96 באר.</li>
		<li>מניחים ~ 15 תולעים, אחת לבאר, לתוך בארות המכילות מאגר M9.</li>
		<li>תן לבעלי החיים להסתגל במשך 5 דקות.</li>
		<li>בדקו כל חיה מתחת לסטריאוטיקרוסקופ, התחל שעון זמן בספירה לאחור של 15 s וספור את מספר כיפופי הגוף שכל חיה מבצעת באותה תוחלת זמן. ניתן לנרמל את הערכים שנספרו לכיפופי גוף לדקה. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית. הערה: זה תנועתיות assay הוא רגיש מאוד והוא יכול לזהות הבדלים קלים מאוד בין טיפולים. עם זאת, תנועתיות בנוזל ותנועתיות על אגר יכול להיות שונה.</li>
	</ol></li>
</ol>5. אימות של נוקאאוט חלבון
<ol><li>הניחו 250-300 ביצים מסונכרנות על צלחת NGM-RNAi 60 מ"מ עם החיידקים הרלוונטיים המביעים dsRNA או ריקים המכילים וקטור (L4440). הערה: RNAi נוקאאוט עלול לגרום הצטברות חריגה של עוברים, בהיעדר עוברים או במעצר התפתחותי שעלול להשפיע על ביטוי הגנים. יש לקחת זאת בחשבון בעת קביעת גיל בעלי החיים שיש לבחון.</li>
	<li>עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים במשך 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (55 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).</li>
	<li>בחר והעבר בסך הכל 200 בעלי חיים צעירים למבוגרים לתוך מכסה של צינור 1.5 מ"ל מלא עם 200 μL של PBS-T. הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.</li>
	<li>סגרו את המכסה בזהירות וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.</li>
	<li>הוסף 800 μL של PBS-T(טבלה 1)וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.</li>
	<li>הסר בזהירות את 900 μL העליון.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.4-5.6 שלוש פעמים.</li>
	<li>הסר 900 μL, משאיר 100 μL של פתרון המכיל את 200 תולעים.</li>
	<li>הוסף 25 μL של 5x מאגר מדגם(טבלה 1).</li>
	<li>מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 92°C תוך רועד ב 1000 סל"ד. לאחר מכן ניתן להקפיא את הדגימות ושמר על -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>טען 20 μL של כל דגימה ולהפעיל על ג'ל SDS-PAGE.</li>
	<li>בצע ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון.</li>
	<li>קבע את עוצמת הרצועות באמצעות תוכנה צפיפות, כגון מודול ג'ל ImageJ זמין באופן חופשי. נרמל את כל הערכים לאלה שנמדדו בדגימות הבקרה. הערה: המטרה של RNAi נוקאאוט במסכים שלנו היא להוריד את רמות החלבון של מלווה מסוים / מלווה שותף. לכן, הדרך הטובה ביותר להעריך את היעילות של RNAi נוקאאוט היא על ידי ניתוח כתם מערבי. זה דורש נוגדנים ספציפיים. לחלופין, ניתן להשתמש ב- qPCR כדי לכמת את רמות ה- mRNA.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תמונה משולבת של רשת הפרוטאוסטזיס המשקפת כיצד היא מאורגנת ומתפקדת בתאים ורקמות מטזואניים שונים נותרה חסרה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, נדרש מידע ספציפי על האינטראקציות של רכיבים שונים של רשת זו, כגון מלווים מולקולריים, ברקמות ספציפיות במהלך ההתפתחות וההזדקנות. כאן, הראינו כיצד השימוש בהתע...

תאים להתמודד עם נזק חלבון על ידי שימוש במכונות בקרת איכות לתקן, לבודד או להסיר חלבונים פגומים1,2. קיפול והרכבה של מתחמי חלבון נתמכים על ידי מלווים מולקולריים, קבוצה מגוונת של חלבונים שמורים מאוד שיכולים לתקן או לבודד חלבונים פגומים3,4,5,6,7. הסרת חלבונים פגומים בתיווך מערכת ubiquitin-proteasome (UPS)8 או על ידי מכונות autophagy9 בשיתוף עםמלווים 10,11,12. הומיוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) הוא, אם כן, מתוחזק על ידי רשתות בקרת איכות המורכבות ממכונות קיפול והשפלה3,13. עם זאת, הבנת האינטראקציות בין המרכיבים השונים של רשת הפרוטאוסטזיס ב- vivo היא אתגר גדול. בעוד שמסכי אינטראקציה בין חלבון חלבון תורמים מידע חשוב על אינטראקציות פיזיות ומתחמי ליווי14,15, הבנת הארגון ומנגנוני פיצוי בתוך רשתות ליווי ספציפיות לרקמות ב- vivo חסרה.
אינטראקציות גנטיות משמשות לעתים קרובות ככלי רב עוצמה לבחינת קשר בין זוגות גנים המעורבים במסלולים ביולוגיים נפוצים או מפצים16,17,18. יחסים כאלה יכולים להימדד על ידי שילוב זוגות של מוטציות וכימות ההשפעה של מוטציה בגן אחד על החומרה הפנוטיפית הנגרמת על ידי מוטציה בגן השני16. בעוד שרוב השילובים כאלה אינם מראים כל השפעה במונחים של פנוטיפ, כמה אינטראקציות גנטיות יכול גם להחמיר או להקל על חומרת הפנוטיפ הנמדד. מוטציות מחמירות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה חמור יותר מהפנוטיפ הצפוי שנראה בשילוב מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים מתפקדים במסלולים מקבילים, יחד המשפיעים על תפקוד נתון. לעומת זאת, מוטציות מקלות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה הוא פחות חמור מהפנוטיפ שנראה עם מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים פועלים יחד כמורכב או משתתפים באותו מסלול16,18. בהתאם לכך, פנוטיפים מגוונים שניתן לכמת, כולל פנוטיפים רחבים, כגון קטלניות, שיעורי צמיחה וגודל הגוזל, כמו גם פנוטיפים ספציפיים, כגון כתבים תמלול, שימשו לזיהוי אינטראקציות גנטיות. לדוגמה, Jonikas ואח ' הסתמכו על כתב מתח ER לבחון אינטראקציות של Saccharomyces cerevisiae ER פתחה רשת פרוטאוסטזיס תגובת חלבון באמצעות ניתוחי מחיקת גנים זוגגנים 19.
מסכי אינטראקציה גנטית כרוכים בחצייה שיטתית של מוטציות מחיקה זוגיות כדי ליצור קבוצה מקיפה של מוטציות כפולות20. עם זאת, במודלים של בעלי חיים, ובמיוחד ב- C. elegans, גישה רחבת היקף זו אינה ריאלית. במקום זאת, זנים מוטנטיים יכולים להיבדק לדפוסי האינטראקציה הגנטית שלהם על ידי זיהוי גנים מווסת באמצעות הפרעות RNA (RNAi)21. ג. אלגנס היא מערכת רבת עוצמה למסכים המבוססת על RNAi22,23. ב C. elegans, משלוח RNA כפול גדילים (dsRNA) מושגת על ידי האכלה חיידקית, מה שמוביל להתפשטות של מולקולות dsRNA לרקמות רבות. באופן זה, מולקולות dsRNA הציג להשפיע על החיה באמצעות הליך מהיר ופשוט21. מסך אינטראקציה גנטית באמצעות RNAi יכול, אם כן, לחשוף את ההשפעה של ויסות מטה קבוצה של גנים או רוב C. elegans קידוד גנים באמצעות ספריות RNAi24. במסך כזה, להיטים המשפיעים על ההתנהגות של מוטציה של עניין אבל לא זן סוג פראי הם מכפילים פוטנציאליים של פנוטיפ להיות במעקב25. כאן, אנו מיישמים שילוב של מוטציות והקרנת RNAi כדי למפות באופן שיטתי אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות ב- C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

קיפול והרכבה נכונים של חלבונים ומתחמי חלבון חיוניים לתפקוד התא. תאים משתמשים במסלולי בקרת איכות המתקנים, מבודדים או מבטלים חלבונים פגומים כדי לשמור על פרוטאום בריא, ובכך מבטיחים פרוטאוסטזיס תאי ומונעים נזק נוסף לחלבון. בגלל פונקציות יתירות בתוך רשת proteostasis, הקרנה עבור פנוטיפים לגילוי באמצעות נוקאאוט או מוטציות בגנים קידוד מלווה באורגניזם הרב תאי Caenorhabditis elegans תוצאות גילוי של פנוטיפים קלים או ללא ברוב המקרים. פיתחנו אסטרטגיית סינון ממוקדת לזיהוי מלווים הנדרשים לפונקציה מסוימת ובכך לגשר על הפער בין פנוטיפ לתפקוד. באופן ספציפי, אנו עוקבים אחר אינטראקציות מלווה חדשניות באמצעות מסכי אינטראקציה סינתטית RNAi, הבעת ביטוי מלווה, מלווה אחד בכל פעם, בבעלי חיים הנושאים מוטציה בגן קידוד מלווה או הבעת יתר של מלווה של עניין. על ידי שיבוש שני מלווים כי בנפרד להציג פנוטיפ ברוטו, אנו יכולים לזהות מלווים להחמיר או לחשוף פנוטיפ מסוים כאשר שניהם מוטרדים. אנו מדגימים כי גישה זו יכולה לזהות קבוצות ספציפיות של מלווים הפועלים יחד כדי לווסת את הקיפול של קומפלקס חלבון או חלבון הקשורים פנוטיפ נתון.

שימוש במוטציות רגישות לטמפרטורה ב-UNC-45 כדי לסנן להחמיר או להקל על אינטראקציות בתנאים מתירניים או מגבילים, בהתאמה הרכבה ותחזוקת שרירים מציעים מערכת יעילה לחקר אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות. היחידה התפקודית של שרירים מתכווצים, הסרקומר, מציגה סידור דמוי גבישי של חלבונים מבני?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions at JoVE.com

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K Views.  Ben-Gurion University of the Negev. כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

Video: Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Screenable<em&gt; In vivo</em&gt; Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...