העבודה במעבדה Duennwald נתמך על ידי תרומות של הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות (מרחוק), קרן מחלה תורשתית (HDF) ואת עץ ויליאם קרן.

1. ביטוי PolyQ-הרחבה חלבונים רעילים שמרים ניתוח שיטתי הקימה את רצף חומצות האמינו המדויק של חלבון polyQ-הרחבת שנדרש כדי לייצר רעילות בשמרים 7. זה חלבון רעיל polyQ-הרחבה מכילה אמינו מסוף הדגל תג ואחריו 17 חומצות האמינו הרצף המקורי של חלבון huntingtin, אזור polyQ, ו-Fusion carboxy מסוף חלבון פלואורסצנטי (או GFP או CFP, ראה תרשים 1). ביטוי של חלבונים עם הרחבות polyQ של 46 glutamines או יותר (למשל 72 ו 103 glutamines) מייצרת רעילות בשמרים כאשר הביע בשליטת מושרה ויחסי האמרגן חזקה GAL1 7, 9. כפי שתואר קודם לכן, רעילות polyQ בשמרים ניכר רק בתאים הנושאים את Rnq1p חלבון קונפורמציה הפריון שלה, [RNQ +], למשל זן שמרים W303 9. חלבון רעיל polyQ-הרחבת Recapitulates ההיבטים המרכזיים של הביולוגיה, polyQ בשמרים, כגון רעילות אורך תלוי polyQ (ראה להלן) צבירה (איור 1 ב). יש לציין, רעילים polyQ-הרחבה חלבונים לא להרוג תאים שמרים באופן מיידי, הם ולא לפגוע או לעצור את מחזור התא במטריקס התא, ובכך מאט או מעכב את הצמיחה של מושבות שמרים על צלחות או תרבויות נוזלי (נתונים שלא פורסמו שלנו). 2. בעיות אפשריות עם תאים שמרים הבעת רעילים PolyQ-הרחבה חלבונים בתאי שמרים המבטאים את החלבונים הרעילים אחרת polyQ הרחבה לא יכול להראות כל פגם הצמיחה 9. הטבע הגנטי של אלה מדכאי של polyQ-רעילות לא נראה להתבסס על מוטציות מנדל פשוטים ולכן יכול להתרחש בתדירות גבוהה יחסית (שלא פורסמו התוצאות שלנו). אנו משערים כי אלה מדכאי ספונטניות נגרמות על ידי ריפוי של פריונים בלתי מזוהים אשר פועלות באופן דומה [RNQ +] בקביעת toxicity.Thes polyQמדכאי ספונטניות אלקטרוני של רעילות polyQ יכול לסכן את התוצאה המוצלחת של הניסוי כל שמטרתו לאפיין רעילות polyQ או לזהות ולאפיין מכפילי של רעילות polyQ. כדי למנוע תופעה מתמשכת של אלה מדכאי ספונטניות, בצע באמצעי הזהירות המפורטים להלן, אשר הוכח כיעיל ביותר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתאי שמרים טריים לניסויים רעילות. אין לאחסן השמרים במשך פרקי זמן ארוכים. לעתים קרובות להחזיר מושבות שמרים טריים ממניות קפואים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות לפקח על הביטוי צבירה של polyQ-הרחבה חלבונים רעילים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים שמרים בתקשורת כי לדכא את הביטוי של רעילות polyQ רעילים בכל עת (כלומר בתקשורת סלקטיביים המכילים גלוקוז כמקור פחמן יחיד) לפני תחילת כל המידות רעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לפחות שלוש transformants עצמאיים לניסוי polyQ-רעילות זה. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. הצמיחה מבחני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תנאי הניסוי, ולחסן 1 כל המושבה משלושה transformants עצמאיים של תאים שמרים מחסה חלבון רעיל polyQ-התרחבות מ&quot;ל 3 של התקשורת שמרים סלקטיבית עם גלוקוז כמקור פחמן יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אלה תרבויות לילה ב 30 ° C. בתנאים אלה, התאים לא מבטאים את החלבון polyQ-הרחבת בגלל הגלוקוז בינוני מדכא הביטוי שלהם. אל תתנו אלה לגדול יותר תרבויות, לשמור על OD 600 (ספיגת אור באורך גל 600 ננומטר) של תרבויות לילה מתחת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים באופן שגרתי שלושה מבחני שונות כדי לעקוב אחר ליקויים הצמיחה של תאים שמרים המבטאים את חלבון רעיל polyQ-הרחבה: </li></ol> 3.1 גידול על צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבויות שמרים לילה (גדל עם הרעידות 220 סל&quot;ד) ל OD 600 של 0.0005 (כלומר דילול של 1:1000 תרבות OD600 = 0.5) ב סלקטיבית ליקוטר 7 המכילה גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתפשט באופן שווה 50 μl (וכתוצאה מכך CA. 700 מושבות בכל צלחת) של כל תרבות בדילול מלא על צלחת 1 (10 ס&quot;מ קוטר) עם בינוני סלקטיבית המכילה גלוקוז כמקור פחמן יחיד ואחד בינוני עם צלחת סלקטיבית המכיל גלקטוז כמקור פחמן יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות במשך שלושה עד ארבעה ימים על 30 ° C. לאחר הדגירה, לצלם כל צלחת ולספור את מספר המושבות על רמת הסוכר ואת מספר מושבות על צלחות גלקטוז. בתנאים אידיאליים, לא אמורה להיות מושבות מעט מאוד או לא רק על הצלחת גלקטוז בעת שימוש בתאי שמרים להביע רעיל מאוד polyQ-הרחבה חלבון (103Q, איור 2 א). </li></ol> 3.2 מבחני הבחינה Assay זה כמותי יותר assay ציפוי המתואר לעיל ולכן יכול לחשוף שאפילו הבדלים דקים רעילות polyQ עם הניסוי אותו על אותה צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את overnתרבויות ight גדל בינוני עם סוכר כדי OD של 600 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של תרבויות אלו המדולל לתוך 96-גם צלחות סטריליות ולהכין חמש דילולים סדרתי פי חמישה בתוך מים סטריליים באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Frogger, (המכונה גם הצופה, עם 8 x 6 פינים להעברת השעיות סלולריים) להעביר את המתלים סלולריים על צלחות המכילות מדיה סלקטיבית עם גלוקוז כמקור פחמן הבלעדית צלחות המכילות מדיה סלקטיבית עם גלקטוז כמקור פחמן יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הצלחות להתייבש לפני דוגרים אותם 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לצלם כל צלחת (איור 2b). </li></ol> 3.3. מעקב אחר רעילות polyQ בשמרים על ידי צמיחה של תרבויות נוזלי פרוטוקול זה הוא כמותי ביותר (OD600 מספרים) של שלושת מבחני המתוארים כאן והוא יכול גם לזהות הבדלים דקים מאוד רעילות polyQ. הנ&quot;ל OCcurrence של מדכאי ספונטניות, לעומת זאת, עלולה להביא לתוצאות מטעות. לכן אני ממליץ שילוב זה assay עם לפחות אחד משני מבחני ציפוי שתוארו לעיל. אנו מציעים להשתמש במכשיר BioscreenC לניסויים אלה. BioscreenC הוא מכשיר אוטומטי מודד את צפיפות אופטית של תרבויות השמרים 100-גם צלחות תוך מודגרות בטמפרטורות מוגדרים בהתרגשות מוגדר. שיטות אחרות לגידול תאים שמרים ומדידת צפיפות אופטית שלהם עשוי לחול גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שמרים מהתקשורת מינימלי המכילים גלוקוז כמקור פחמן יחיד שלוש פעמים במים 3 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבויות לילה שגודלו בינוני עם גלקטוז כדי OD של 600 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל טוב צלחת 100-גם BioscreenC עם 300 μl של תרבויות שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית Easy ניסוי Bioscreen. לקבוע את מספר דגימות ברצונך לעקוב אחר (כולל החסר ובינוניים בלבדשולטת), להגדיר את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס, להגדיר את משך הניסויים עד 3 ימים, לקבוע את המרווחים המדידה 15 דקות, קבע את המסנן 600 ננומטר / בראון, להגדיר את מצב רעד של 15 שניות לפני כל מדידה ב בינוני כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר BioscreenC והתוכנה המצורפת יפיק Excel גיליונות אלקטרוניים של נקודת נתונים כל נלקח במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין עקומות גדילה עם Excel עבור מדגם זה והשווה הצמיחה של מדגמים שונים (איור 2 ג). תיאור מפורט של ניתוח נתונים המיוצרים על ידי ניסויים BioscreenC סופק לפני 10. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" /> באיור 1. שמרים polyQ המודל. א) ייצוג סכמטי של חלבון רעיל polyQ ב-הרחבה.) מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה בתאי שמרים המבטאים קצר, רעיל polyQתאים חלבון הרחבה (25Q, פאנל משמאל) שמרים ביטוי רב, חלבון רעיל polyQ-הרחבה (לוח 103Q, נכון). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות נציג של מבחני הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. א) ציפוי assay. כ 700 תאים שמרים פוזרו על צלחות מודגרות במשך שלושה ימים ב 30 ° C. הפאנל העליון מציג את צלחת ובה בינוני הגלוקוז, כלומר את הביטוי של החלבון polyQ-הרחבת רעילים (103Q) לא מושרה. הפאנל התחתון מציג את צלחת השמרים המכיל בינוני גלקטוז, כלומר את הביטוי של החלבון polyQ-הרחבת רעילים מושרה. שימו לב בניסוי המוצג כאן, לא מדכא ספונטנית התרחשה. ב) הבחינה assay. חמש סדרתי פי חמישה דילולים של תאים שמרים מחסה או חלבון רעיל polyQ (25Q) או רעילים polyQ-הרחבת protein (103Q) נראו על צלחות גלוקוז כי לדכא את הביטוי של חלבונים (פאנל משמאל) או על צלחות גלקטוז כי להשרות הביטוי שלהם. הצלחות היו מודגרות מכן במשך שלושה ימים ב 30 ° C. ג) ניסוי BioscreenC. צמיחה של תרבויות של תאים המבטאים שמרים או חלבון רעיל polyQ (25Q) או חלבון רעיל polyQ-הרחבה (103Q) נוטרו על ידי BioscreenC המכשיר. תנאי הניסוי וניתוח של ניסויים BioscreenC מתוארים בטקסט הראשי.

<ol>
	<li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+and+neurodegeneration.">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li><li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment.">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li><li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+repeats+and+neurodegeneration.">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains.">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li><li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease.">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li><li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity.">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li><li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells.">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+and+bread+to+brains+and+beyond:+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease.">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li><li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast.">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li><li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+(-)-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

כתב יד זה מתאר שלוש גישות ניסיוניות משלימות כדי למדוד polyQ-רעילות בשמרים אורגניזם מודל המבוסס על צמיחה מופחתת של תאים שמרים המבטאים רעילים polyQ-הרחבה חלבונים. עבודה שמרים הציעה תובנות עמוקות לתוך המנגנונים תאית ומולקולרית הבסיסיים של misfolding חלבון ו רעילות שהתפתח שלה, כ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם של מכשיר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 פינים) </td><td> V &amp; P מדעי, סן דייגו </td><td> סמנכ&quot;ל 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves ארה&quot;ב </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100 היטב צלחות חלת דבש </td><td> Growthcurves ארה&quot;ב </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast

Misfolding חלבון קשורה עם מחלות אנושיות רבות, במיוחד מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון 1. מחלת הנטינגטון (HD) נגרמת על ידי התרחבות חריגה של האזור polyglutamine (polyQ) בתוך huntingtin חלבון. חלבון polyQ-מורחבת huntingtin משיגה קונפורמציה סוטה (כלומר misfolds) וגורם רעילות הסלולר 2. לפחות שמונה מחלות ניווניות נוספות נגרמות על ידי polyQ למוצרי הרחבות, כולל Ataxias Spinocerebellar ומחלת קנדי 3. שמרים אורגניזם מודל יש להקל תובנות משמעותיות על בסיס תאית ומולקולרית של רעילות-polyQ, כולל ההשפעה של הגורמים התוך והבין המולקולרי של polyQ-רעילות, וכן זיהוי של מסלולים תאיים כי לקויי בתאים לבטא polyQ-הרחבה חלבונים 3-8. חשובלי, היבטים רבים של רעילות-polyQ שנמצאו השמרים היו לשכפל מערכות ניסיוניות אחרות ובמידה מסוימת בדגימות מחולים HD, ובכך מפגין את המשמעות של המודל שמרים על גילוי מנגנונים בסיסיים בבסיס polyQ-רעילות. בדרך ישירה ופשוטה יחסית כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים היא למדוד פגמים הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. כתב יד זה מתאר שלוש גישות משלימות הניסוי כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים על ידי מדידת הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. הראשון שתי גישות ניסיוניות לעקוב אחר הצמיחה השמרים על צלחות, הגישה 3 מנטרת את הצמיחה של תרבויות שמרים נוזליים באמצעות מכשיר BioscreenC. יתר על כן, כתב היד הזה מתאר קשיים ניסויים שיכולים להתרחש בעת טיפול polyQ מודלים שמרים מתאר אסטרטגיות שיעזרו למנוע אולמזער את הקשיים הללו. פרוטוקולים המתוארים כאן יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין מסלולים גנטיים ומולקולות קטנות לווסת polyQ-רעילות. יתר על כן, מבחני המתוארים יכולים לשמש תבניות עבור ניתוחים מדויקים של רעילות הנגרמת על ידי מחלה הקשורים חלבונים אחרים misfolded במודלים של שמרים.

Watch this Scientific Journal Video about Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast at JoVE.com

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים בשמרים<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. פרוטוקולים אלה יכולים בקלות להיות שונה כדי לפקח על רעילות של חלבונים misfolded אחרים שמרים.

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

growth-assays-to-assess-polyglutamine-toxicity-in-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  Boston Biomedical Research Institute. כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים בשמרים Saccharomyces cerevisiae. פרוטוקולים אלה יכולים בקלות להיות שונה כדי לפקח על רעילות של חלבונים misfolded אחרים שמרים.

Video: Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

ניתוח השוואתי של הורמון גדילה האנושית בסרום שימוש SPRi, ננו-SPRi ומבחני ELISA

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca2 +תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the plant. Many sophisticated techniques have been developed to measure these properties; however, atomic force microscopy (AFM) remains the most convenient for studying cell wall elasticity at the cellular level. One of the most important limitations of this technique has been that only superficial or isolated living cells can be studied. Here, the use of atomic force microscopy to investigate the mechanical properties of primary cell walls belonging to the internal tissues of a plant body is presented. This protocol describes measurements of the apparent Young&#39;s modulus of cell walls in roots, but the method can also be applied to other plant organs. The measurements are performed on vibratome-derived sections of plant material in a liquid cell, which allows (i) avoiding the use of plasmolyzing solutions or sample impregnation with wax or resin, (ii) making the experiments fast, and (iii) preventing dehydration of the sample. Both anticlinal and periclinal cell walls can be studied, depending on how the specimen was sectioned. Differences in the mechanical properties of different tissues can be investigated in a single section. The protocol describes the principles of study planning, issues with specimen preparation and measurements, as well as the method of selecting force-deformation curves to avoid the influence of topography on the obtained values of elastic modulus. The method is not limited by sample size but is sensitive to cell size (i.e., cells with a large lumen are difficult to examine).

Studies of cell wall biomechanics are essential for understanding plant growth and morphogenesis. The following protocol is proposed to investigate thin primary cell walls in the internal tissues of young plant organs using atomic force microscopy.

אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...