ويدعم العمل في المختبر Duennwald من المنح المقدمة من الاتحاد الأميركي للبحوث الشيخوخة (عفر)، ومؤسسة مرض وراثي (اتش دي اف) ومؤسسة وليام وود.

1. التعبير عن البروتينات PolyQ التوسع السمية في الخميرة وقد أنشأت إجراء تحليل منهجي دقيق لتسلسل الأحماض الأمينية للبروتين polyQ التوسع المطلوب لإنتاج سمية في خميرة 7. هذا السامة polyQ التوسع يحتوي على بروتين الأميني محطة العلم العلامة تليها 17 من الأحماض الأمينية تسلسل الأصلي للبروتين huntingtin، وهي منطقة polyQ، والانصهار كربوكسي لمحطة لبروتين فلوري (إما GFP أو الحراجية المعتمدة، انظر الشكل 1 أ). التعبير عن البروتينات مع التوسعات polyQ من 46 glutamines أو أكثر (على سبيل المثال 72 و 103 glutamines) وتنتج سمية في الخميرة عندما أعرب تحت سيطرة محرض والنسبية قوي GAL1 المروج 7 و 9. كما هو موضح سابقا، polyQ سمية في الخميرة واضح فقط في الخلايا التي تحمل Rnq1p بروتين بريون في التشكل لها، [RNQ +]، على سبيل المثال السلالة خميرة W303 9. والسامة ص بروتين polyQ التوسعecapitulates الجوانب المركزية للpolyQ البيولوجيا في الخميرة، مثل سمية التي تعتمد على طول polyQ (انظر أدناه)، وتجميع (الشكل 1 ب). والجدير بالذكر أن سمية polyQ التوسع البروتينات لا تقتل خلايا الخميرة على الفور، بل يضعف أو بالأحرى إلقاء القبض على دورة الخلية وdevision الخلية، وبالتالي تباطؤ أسفل أو تثبيط نمو مستعمرات الخميرة على لوحات أو الثقافات السائل (البيانات المتوفرة لدينا غير منشورة). 2. المشاكل المحتملة مع خلايا الخميرة تعرب عن السامة PolyQ التوسع البروتينات قد خلايا الخميرة معربا عن توسيع غير ذلك من البروتينات السامة polyQ لا تظهر أي عيب نمو 9. الطبيعة الجينية لهذه المكثفات من polyQ سمية لا يبدو أن يستند إلى الطفرات مندلية بسيطة، وبالتالي يمكن أن تحدث مع وتيرة عالية نسبيا (نتائجنا غير منشورة). ونحن التكهن التي هي سبب هذه المكثفات عفوية من قبل مجهولين علاج من البريونات التي تعمل على غرار [RNQ +] في تحديد toxicity.Thes polyQيمكن المكثفات عفوية (ه) من سمية polyQ يعرض للخطر نجاح أي تجربة والتي تهدف إلى تميز polyQ سمية أو لتحديد وتوصيف معدلات السمية polyQ. من أجل تجنب تكرار وقوع هذه المكثفات عفوية، اتباع التدابير الوقائية المبينة أدناه، والتي ثبت أنها فعالة للغاية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خلايا الخميرة الطازجة للتجارب سمية. لا تقم بتخزين خميرة لفترات طويلة من الزمن. استرداد كثيرا مستعمرات الخميرة الطازجة من المخزونات المجمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد في كثير من الأحيان التعبير وتجميع البروتينات polyQ التوسع السامة عن طريق الفحص المجهري مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا الخميرة في وسائل الإعلام التي تقمع التعبير عن سمية polyQ السامة في جميع الأوقات (أي في وسائل الإعلام التي تحتوي على انتقائية الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون) قبل البدء في أي قياسات سمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستخدم ثلاثة على الأقل transformants مستقل لكل تجربة polyQ سمية. &lt;/ لى&gt; </ol> 3. نمو فحوصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل حالة تجريبية، تطعيم كل مستعمرة واحدة من ثلاث transformants مستقل من خلايا الخميرة إيواء السامة polyQ التوسع بروتين في 3 مل من وسائل الاعلام خميرة انتقائي مع الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في ظل هذه الظروف، فإن الخلايا لا يتم التعبير عن بروتين polyQ التوسع لأن الجلوكوز في المتوسط ​​يقمع التعبير عنها. لا تدع هذه اكتسى الثقافات؛ الحفاظ على OD 600 (امتصاص الضوء من طول موجي نانومتر 600) من الثقافات بين عشية وضحاها إلى أقل من 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم بشكل روتيني 3 فحوصات مختلفة لرصد عيوب نمو خلايا الخميرة معربا عن السامة polyQ التوسع بروتين: </li></ol> 3.1 نمو على لوحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافات خميرة بين عشية وضحاها (نمت مع الهز دورة في الدقيقة 220) إلى OD 600 من 0.0005 (أي تخفيف 1:1000 ثقافة OD600 0.5 =) في انتقائية ليديا 7 تحتوي على جلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موزعة بالتساوي 50 ميكروليتر (الناتجة في كاليفورنيا. 700 المستعمرات في لوحة) من كل ثقافة المخفف على واحد لوحة (10 قطرها سم) مع متوسط ​​الانتقائية التي تحتوي على الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون واحدة مع لوحة متوسطة الانتقائية التي تحتوي على اللبن كمصدر وحيد للكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 30 درجة مئوية. بعد الحضانة، والتقاط صور فوتوغرافية من كل لوحة، وحساب عدد المستعمرات على جلوكوز وعدد من المستعمرات على لوحات الجالاكتوز. في ظل الظروف المثالية، ينبغي أن يكون هناك مستعمرات أو فقط عدد قليل جدا على لوحة الجالاكتوز عند استخدام خلايا الخميرة تعبر عن شديد السمية polyQ التوسع البروتين (103Q، الشكل 2A). </li></ol> 3.2 المقايسات الإكتشاف هذا الفحص هو أكثر كمية من فحص الطلاء المذكورة أعلاه، وبالتالي يمكن أن تكشف عن خلافات خفية حتى في سمية polyQ مع نفس التجربة على نفس الصفيحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع overnالثقافات ight نمت في المتوسط ​​مع الجلوكوز إلى OD 600 من 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 200 ميكرولتر من هذه الثقافات المخفف إلى لوحات 96-جيدا العقيمة، وإعداد 5 التخفيفات المسلسل أكثر من خمس مرات في الماء المعقم باستخدام ماصة متعدد القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام FROGGER، (وتسمى أيضا نصاب، وامتناع 8 دبابيس 6 × لنقل تعليق خلية) نقل تعليق الخلية التي تحتوي على لوحات وسائل الإعلام الانتقائي مع الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون واللوحات التي تحتوي على وسائل الإعلام الانتقائي مع اللبن كمصدر وحيد للكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوحات لتجف قبل تفرخ لهم في 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أو أربعة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، والتقاط صور فوتوغرافية من كل لوحة (الشكل 2B). </li></ol> 3.3. مراقبة polyQ سمية في الخميرة بواسطة نمو الثقافات السائل هذا البروتوكول هو الأكثر كمية (OD600 أرقام) من المقايسات الثلاثة المذكورة هنا، ويمكن الكشف عن وجود اختلافات دقيقة للغاية في السمية polyQ. وOC المذكورة آنفاcurrence من المكثفات عفوية، ولكن، يمكن ان تنتج يحتمل أن تكون النتائج مضللة. ولذلك فإنني أوصي الجمع بين هذا الاختبار مع ما لا يقل عن واحد من المقايسات تصفيح 2 المذكورة أعلاه. نقترح استخدام أداة BioscreenC لهذه التجارب. وBioscreenC أداة تقيس تلقائيا الكثافة البصرية للثقافات الخميرة في 100-جيدا لوحات في حين حضنت في درجة حرارة محددة مع الإثارة محددة. قد طرق أخرى لنمو خلايا الخميرة وقياس كثافتها الضوئية تنطبق أيضا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا الخميرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على الحد الأدنى من الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون ثلاث مرات في 3 مل من الماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافات بين عشية وضحاها نمت في المتوسط ​​مع الجالاكتوز إلى OD 600 من 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من لوحة 100 BioscreenC جيدا مع 300 ميكرولتر من الثقافات الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج سهل تجربة Bioscreen. تحديد عدد العينات التي ترغب في مراقبة (بما في ذلك الفراغات والمتوسطة فقط،وضع ضوابط)، ودرجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، وتعيين طول تجارب لمدة 3 أيام، تعيين فترات القياس إلى 15 دقيقة، تعيين عامل التصفية إلى 600 نيوتن متر / براون، وتعيين الوضع اهتزاز إلى 15 ثانية قبل كل قياس في متوسطة القوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والصك BioscreenC والبرمجيات المرفقة إنتاج جداول البيانات إكسل من كل نقطة من نقاط البيانات التي اتخذت خلال هذه التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منحنيات النمو مع Excel لكل عينة ومقارنة نمو عينات مختلفة (الشكل 2C). وقدمت وصفا مفصلا لتحليل البيانات التي تنتجها التجارب BioscreenC قبل 10. </li></ol> 4. ممثل النتائج <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" /> الشكل 1. نموذج الخميرة polyQ. أ) تمثيل تخطيطي للالسامة polyQ التوسع ب. البروتين) مضان المجهري تظهر خلايا الخميرة تعبير قصيرة، وغير سامة polyQبروتين توسع (25Q، لوحة على اليسار) وخميرة خلايا تعبر عن والسامة طويل polyQ التوسع البروتين (103Q، لوحة على اليمين). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" /> الشكل 2. ممثل نتائج فحوصات نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. أ) انتشرت فحص التصفيحات. خلايا الخميرة ما يقرب من 700 على لوحات وحضنت لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية. لوحة العلوي يعرض لوحة تحتوي على نسبة الجلوكوز في المتوسط، أي التعبير عن بروتين polyQ التوسع السامة (103Q) لا يسببها. اللوحة السفلى تظهر لوحة تحتوي على خميرة اللبن المتوسطة، أي التعبير عن بروتين polyQ التوسع السامة هو فعل. حدث لا القامع عفوية لاحظ أن في هذه التجربة هو موضح هنا،. ب) الإكتشاف فحص. خمسة المسلسل خمسة أضعاف التخفيفات من خلايا الخميرة ايواء إما بروتين polyQ غير سامة (25Q) أو البروتينات السامة polyQ التوسعوقد شوهدت N (103Q) على لوحات الجلوكوز التي تقمع التعبير عن البروتينات (لوحة على اليسار) أو على لوحات الجلاكتوز التي تحفز على التعبير عنها. وحضنت ثم لوحات لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية ج) BioscreenC التجربة. تم رصد نمو الثقافات من التعبير عن خلايا الخميرة إما بروتين polyQ غير سامة (25Q) أو السامة polyQ التوسع البروتين (103Q) من قبل BioscreenC الصك. ووصف الظروف التجريبية وتحليل التجارب BioscreenC في النص الرئيسي.

<ol>
	<li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+and+neurodegeneration.">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li><li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment.">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li><li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+repeats+and+neurodegeneration.">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains.">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li><li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease.">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li><li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity.">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li><li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells.">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+and+bread+to+brains+and+beyond:+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease.">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li><li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast.">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li><li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+(-)-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا المخطوط الضوء على ثلاث النهج التجريبي مكملة لقياس polyQ سمية في نموذج الخميرة كائن حي استنادا إلى انخفاض النمو من خلايا الخميرة معربا عن السامة polyQ التوسع البروتينات. وعرضت العمل في خميرة رؤى عميقة في آليات الأساسية الخلوية والجزيئية من misfolding البروتين وسميتها التي...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم أداة </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> FROGGER (6x8 دبابيس) </td><td> V &amp; P العلمي في سان دييغو </td><td> نائب الرئيس 407 ه </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100-جيدا لوحات قرص العسل </td><td> Growthcurves الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast

ويرتبط مع بروتين misfolding العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، وخاصة أمراض الاعصاب، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ومرض هنتنغتون 1. ويتسبب مرض هنتنغتون (HD) من قبل توسع غير طبيعي في منطقة (polyQ) polyglutamine داخل huntingtin بروتين. البروتين huntingtin polyQ-الموسع يبلغ 1 التشكل الشاذة (أي أنه misfolds) ويسبب السمية الخلوية 2. هي سبب لا يقل عن ثمانية أمراض الاعصاب المزيد من polyQ-التوسعات، بما في ذلك الترنحات السبيل النخاعي، ومرض كنيدي 3. سهلت الخميرة كائن حي نموذج رؤى هامة في أساس الخلوية والجزيئية من polyQ سمية، بما في ذلك أثر العوامل داخل وفيما بين الجزيئية من polyQ سمية، وتحديد مسارات الخلوية التي يعانون من ضعف في الخلايا معربا عن polyQ التوسع البروتينات 3-8. مهملاي، استنسخت العديد من جوانب polyQ سمية التي وجدت في الخميرة في النظم التجريبية الأخرى، وإلى حد ما في عينات من المرضى HD، مما يدل على أهمية نموذج الخميرة لاكتشاف الآليات الأساسية التي تقوم عليها polyQ سمية. وهناك طريقة مباشرة وبسيطة نسبيا لتحديد polyQ سمية في الخميرة هو قياس العيوب نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. هذا المخطوط يصف ثلاثة نهج التجريبية التكميلية لتحديد polyQ سمية في الخميرة عن طريق قياس نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. أول نهجين التجريبية مراقبة نمو الخميرة على لوحات، ونهج ثالث يراقب نمو الثقافات الخميرة السائلة باستخدام أداة BioscreenC. وعلاوة على ذلك، هذا المخطوط يصف الصعوبات التجريبية التي يمكن أن تحدث عند التعامل مع نماذج polyQ الخميرة ويحدد الاستراتيجيات التي من شأنها أن تساعد على تجنب أوتقليل هذه الصعوبات. ويمكن استخدام البروتوكولات وصفها هنا من أجل تحديد وتوصيف مسارات الوراثية والجزيئات الصغيرة التي تعدل polyQ سمية. وعلاوة على ذلك، قد وصف المقايسات بمثابة نماذج للتحليل الدقيق للتسمم الناجم عن مرض البروتينات المرتبطة أخرى تتجمع في نماذج الخميرة.

Watch this Scientific Journal Video about Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast at JoVE.com

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

هذه المخطوطة تصف ثلاثة بروتوكولات مكملة لتقييم سمية polyglutamine (polyQ) التوسع البروتينات في الخميرة<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;. ويمكن بسهولة أن يتم تعديل هذه البروتوكولات لرصد سمية تتجمع البروتينات الأخرى في الخميرة.

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

growth-assays-to-assess-polyglutamine-toxicity-in-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  Boston Biomedical Research Institute. هذه المخطوطة تصف ثلاثة بروتوكولات مكملة لتقييم سمية polyglutamine (polyQ) التوسع البروتينات في الخميرة خميرة الخباز. ويمكن بسهولة أن يتم تعديل هذه البروتوكولات لرصد سمية تتجمع البروتينات الأخرى في الخميرة.

Video: Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

تعديل الخميرة اثنين والهجين نظام لتحديد البروتينات التفاعل مع عامل النمو Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

تحليل مقارن لهرمون النمو البشري في المصل عن طريق سبري، نانو-سبري وELISA فحوصات

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

تأثير البروتينات الفلورية على الشركاء الانصهار باستخدام فحوصات السمية Polyglutamine في الخميرة

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

الإنتاجية المتوسطة فحص فحوصات لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات ورد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

قياس سمية الببتيد RAN في C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...