ويدعم العمل في المختبر Duennwald من المنح المقدمة من الاتحاد الأميركي للبحوث الشيخوخة (عفر)، ومؤسسة مرض وراثي (اتش دي اف) ومؤسسة وليام وود.

1. التعبير عن البروتينات PolyQ التوسع السمية في الخميرة وقد أنشأت إجراء تحليل منهجي دقيق لتسلسل الأحماض الأمينية للبروتين polyQ التوسع المطلوب لإنتاج سمية في خميرة 7. هذا السامة polyQ التوسع يحتوي على بروتين الأميني محطة العلم العلامة تليها 17 من الأحماض الأمينية تسلسل الأصلي للبروتين huntingtin، وهي منطقة polyQ، والانصهار كربوكسي لمحطة لبروتين فلوري (إما GFP أو الحراجية المعتمدة، انظر الشكل 1 أ). التعبير عن البروتينات مع التوسعات polyQ من 46 glutamines أو أكثر (على سبيل المثال 72 و 103 glutamines) وتنتج سمية في الخميرة عندما أعرب تحت سيطرة محرض والنسبية قوي GAL1 المروج 7 و 9. كما هو موضح سابقا، polyQ سمية في الخميرة واضح فقط في الخلايا التي تحمل Rnq1p بروتين بريون في التشكل لها، [RNQ +]، على سبيل المثال السلالة خميرة W303 9. والسامة ص بروتين polyQ التوسعecapitulates الجوانب المركزية للpolyQ البيولوجيا في الخميرة، مثل سمية التي تعتمد على طول polyQ (انظر أدناه)، وتجميع (الشكل 1 ب). والجدير بالذكر أن سمية polyQ التوسع البروتينات لا تقتل خلايا الخميرة على الفور، بل يضعف أو بالأحرى إلقاء القبض على دورة الخلية وdevision الخلية، وبالتالي تباطؤ أسفل أو تثبيط نمو مستعمرات الخميرة على لوحات أو الثقافات السائل (البيانات المتوفرة لدينا غير منشورة). 2. المشاكل المحتملة مع خلايا الخميرة تعرب عن السامة PolyQ التوسع البروتينات قد خلايا الخميرة معربا عن توسيع غير ذلك من البروتينات السامة polyQ لا تظهر أي عيب نمو 9. الطبيعة الجينية لهذه المكثفات من polyQ سمية لا يبدو أن يستند إلى الطفرات مندلية بسيطة، وبالتالي يمكن أن تحدث مع وتيرة عالية نسبيا (نتائجنا غير منشورة). ونحن التكهن التي هي سبب هذه المكثفات عفوية من قبل مجهولين علاج من البريونات التي تعمل على غرار [RNQ +] في تحديد toxicity.Thes polyQيمكن المكثفات عفوية (ه) من سمية polyQ يعرض للخطر نجاح أي تجربة والتي تهدف إلى تميز polyQ سمية أو لتحديد وتوصيف معدلات السمية polyQ. من أجل تجنب تكرار وقوع هذه المكثفات عفوية، اتباع التدابير الوقائية المبينة أدناه، والتي ثبت أنها فعالة للغاية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خلايا الخميرة الطازجة للتجارب سمية. لا تقم بتخزين خميرة لفترات طويلة من الزمن. استرداد كثيرا مستعمرات الخميرة الطازجة من المخزونات المجمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد في كثير من الأحيان التعبير وتجميع البروتينات polyQ التوسع السامة عن طريق الفحص المجهري مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا الخميرة في وسائل الإعلام التي تقمع التعبير عن سمية polyQ السامة في جميع الأوقات (أي في وسائل الإعلام التي تحتوي على انتقائية الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون) قبل البدء في أي قياسات سمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستخدم ثلاثة على الأقل transformants مستقل لكل تجربة polyQ سمية. &lt;/ لى&gt; </ol> 3. نمو فحوصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل حالة تجريبية، تطعيم كل مستعمرة واحدة من ثلاث transformants مستقل من خلايا الخميرة إيواء السامة polyQ التوسع بروتين في 3 مل من وسائل الاعلام خميرة انتقائي مع الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في ظل هذه الظروف، فإن الخلايا لا يتم التعبير عن بروتين polyQ التوسع لأن الجلوكوز في المتوسط ​​يقمع التعبير عنها. لا تدع هذه اكتسى الثقافات؛ الحفاظ على OD 600 (امتصاص الضوء من طول موجي نانومتر 600) من الثقافات بين عشية وضحاها إلى أقل من 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستخدم بشكل روتيني 3 فحوصات مختلفة لرصد عيوب نمو خلايا الخميرة معربا عن السامة polyQ التوسع بروتين: </li></ol> 3.1 نمو على لوحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافات خميرة بين عشية وضحاها (نمت مع الهز دورة في الدقيقة 220) إلى OD 600 من 0.0005 (أي تخفيف 1:1000 ثقافة OD600 0.5 =) في انتقائية ليديا 7 تحتوي على جلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موزعة بالتساوي 50 ميكروليتر (الناتجة في كاليفورنيا. 700 المستعمرات في لوحة) من كل ثقافة المخفف على واحد لوحة (10 قطرها سم) مع متوسط ​​الانتقائية التي تحتوي على الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون واحدة مع لوحة متوسطة الانتقائية التي تحتوي على اللبن كمصدر وحيد للكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 30 درجة مئوية. بعد الحضانة، والتقاط صور فوتوغرافية من كل لوحة، وحساب عدد المستعمرات على جلوكوز وعدد من المستعمرات على لوحات الجالاكتوز. في ظل الظروف المثالية، ينبغي أن يكون هناك مستعمرات أو فقط عدد قليل جدا على لوحة الجالاكتوز عند استخدام خلايا الخميرة تعبر عن شديد السمية polyQ التوسع البروتين (103Q، الشكل 2A). </li></ol> 3.2 المقايسات الإكتشاف هذا الفحص هو أكثر كمية من فحص الطلاء المذكورة أعلاه، وبالتالي يمكن أن تكشف عن خلافات خفية حتى في سمية polyQ مع نفس التجربة على نفس الصفيحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع overnالثقافات ight نمت في المتوسط ​​مع الجلوكوز إلى OD 600 من 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 200 ميكرولتر من هذه الثقافات المخفف إلى لوحات 96-جيدا العقيمة، وإعداد 5 التخفيفات المسلسل أكثر من خمس مرات في الماء المعقم باستخدام ماصة متعدد القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام FROGGER، (وتسمى أيضا نصاب، وامتناع 8 دبابيس 6 × لنقل تعليق خلية) نقل تعليق الخلية التي تحتوي على لوحات وسائل الإعلام الانتقائي مع الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون واللوحات التي تحتوي على وسائل الإعلام الانتقائي مع اللبن كمصدر وحيد للكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوحات لتجف قبل تفرخ لهم في 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أو أربعة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، والتقاط صور فوتوغرافية من كل لوحة (الشكل 2B). </li></ol> 3.3. مراقبة polyQ سمية في الخميرة بواسطة نمو الثقافات السائل هذا البروتوكول هو الأكثر كمية (OD600 أرقام) من المقايسات الثلاثة المذكورة هنا، ويمكن الكشف عن وجود اختلافات دقيقة للغاية في السمية polyQ. وOC المذكورة آنفاcurrence من المكثفات عفوية، ولكن، يمكن ان تنتج يحتمل أن تكون النتائج مضللة. ولذلك فإنني أوصي الجمع بين هذا الاختبار مع ما لا يقل عن واحد من المقايسات تصفيح 2 المذكورة أعلاه. نقترح استخدام أداة BioscreenC لهذه التجارب. وBioscreenC أداة تقيس تلقائيا الكثافة البصرية للثقافات الخميرة في 100-جيدا لوحات في حين حضنت في درجة حرارة محددة مع الإثارة محددة. قد طرق أخرى لنمو خلايا الخميرة وقياس كثافتها الضوئية تنطبق أيضا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا الخميرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على الحد الأدنى من الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون ثلاث مرات في 3 مل من الماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافات بين عشية وضحاها نمت في المتوسط ​​مع الجالاكتوز إلى OD 600 من 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من لوحة 100 BioscreenC جيدا مع 300 ميكرولتر من الثقافات الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج سهل تجربة Bioscreen. تحديد عدد العينات التي ترغب في مراقبة (بما في ذلك الفراغات والمتوسطة فقط،وضع ضوابط)، ودرجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، وتعيين طول تجارب لمدة 3 أيام، تعيين فترات القياس إلى 15 دقيقة، تعيين عامل التصفية إلى 600 نيوتن متر / براون، وتعيين الوضع اهتزاز إلى 15 ثانية قبل كل قياس في متوسطة القوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والصك BioscreenC والبرمجيات المرفقة إنتاج جداول البيانات إكسل من كل نقطة من نقاط البيانات التي اتخذت خلال هذه التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منحنيات النمو مع Excel لكل عينة ومقارنة نمو عينات مختلفة (الشكل 2C). وقدمت وصفا مفصلا لتحليل البيانات التي تنتجها التجارب BioscreenC قبل 10. </li></ol> 4. ممثل النتائج <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" /> الشكل 1. نموذج الخميرة polyQ. أ) تمثيل تخطيطي للالسامة polyQ التوسع ب. البروتين) مضان المجهري تظهر خلايا الخميرة تعبير قصيرة، وغير سامة polyQبروتين توسع (25Q، لوحة على اليسار) وخميرة خلايا تعبر عن والسامة طويل polyQ التوسع البروتين (103Q، لوحة على اليمين). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" /> الشكل 2. ممثل نتائج فحوصات نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. أ) انتشرت فحص التصفيحات. خلايا الخميرة ما يقرب من 700 على لوحات وحضنت لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية. لوحة العلوي يعرض لوحة تحتوي على نسبة الجلوكوز في المتوسط، أي التعبير عن بروتين polyQ التوسع السامة (103Q) لا يسببها. اللوحة السفلى تظهر لوحة تحتوي على خميرة اللبن المتوسطة، أي التعبير عن بروتين polyQ التوسع السامة هو فعل. حدث لا القامع عفوية لاحظ أن في هذه التجربة هو موضح هنا،. ب) الإكتشاف فحص. خمسة المسلسل خمسة أضعاف التخفيفات من خلايا الخميرة ايواء إما بروتين polyQ غير سامة (25Q) أو البروتينات السامة polyQ التوسعوقد شوهدت N (103Q) على لوحات الجلوكوز التي تقمع التعبير عن البروتينات (لوحة على اليسار) أو على لوحات الجلاكتوز التي تحفز على التعبير عنها. وحضنت ثم لوحات لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية ج) BioscreenC التجربة. تم رصد نمو الثقافات من التعبير عن خلايا الخميرة إما بروتين polyQ غير سامة (25Q) أو السامة polyQ التوسع البروتين (103Q) من قبل BioscreenC الصك. ووصف الظروف التجريبية وتحليل التجارب BioscreenC في النص الرئيسي.

<ol>
	<li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+and+neurodegeneration.">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li><li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment.">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li><li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+repeats+and+neurodegeneration.">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains.">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li><li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease.">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li><li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity.">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li><li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li><li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells.">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+and+bread+to+brains+and+beyond:+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease.">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li><li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast.">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li><li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+(-)-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington's+disease+models.">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا المخطوط الضوء على ثلاث النهج التجريبي مكملة لقياس polyQ سمية في نموذج الخميرة كائن حي استنادا إلى انخفاض النمو من خلايا الخميرة معربا عن السامة polyQ التوسع البروتينات. وعرضت العمل في خميرة رؤى عميقة في آليات الأساسية الخلوية والجزيئية من misfolding البروتين وسميتها التي...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم أداة </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> FROGGER (6x8 دبابيس) </td><td> V &amp; P العلمي في سان دييغو </td><td> نائب الرئيس 407 ه </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100-جيدا لوحات قرص العسل </td><td> Growthcurves الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast

ويرتبط مع بروتين misfolding العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، وخاصة أمراض الاعصاب، مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ومرض هنتنغتون 1. ويتسبب مرض هنتنغتون (HD) من قبل توسع غير طبيعي في منطقة (polyQ) polyglutamine داخل huntingtin بروتين. البروتين huntingtin polyQ-الموسع يبلغ 1 التشكل الشاذة (أي أنه misfolds) ويسبب السمية الخلوية 2. هي سبب لا يقل عن ثمانية أمراض الاعصاب المزيد من polyQ-التوسعات، بما في ذلك الترنحات السبيل النخاعي، ومرض كنيدي 3. سهلت الخميرة كائن حي نموذج رؤى هامة في أساس الخلوية والجزيئية من polyQ سمية، بما في ذلك أثر العوامل داخل وفيما بين الجزيئية من polyQ سمية، وتحديد مسارات الخلوية التي يعانون من ضعف في الخلايا معربا عن polyQ التوسع البروتينات 3-8. مهملاي، استنسخت العديد من جوانب polyQ سمية التي وجدت في الخميرة في النظم التجريبية الأخرى، وإلى حد ما في عينات من المرضى HD، مما يدل على أهمية نموذج الخميرة لاكتشاف الآليات الأساسية التي تقوم عليها polyQ سمية. وهناك طريقة مباشرة وبسيطة نسبيا لتحديد polyQ سمية في الخميرة هو قياس العيوب نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. هذا المخطوط يصف ثلاثة نهج التجريبية التكميلية لتحديد polyQ سمية في الخميرة عن طريق قياس نمو خلايا الخميرة معربا عن polyQ التوسع البروتينات. أول نهجين التجريبية مراقبة نمو الخميرة على لوحات، ونهج ثالث يراقب نمو الثقافات الخميرة السائلة باستخدام أداة BioscreenC. وعلاوة على ذلك، هذا المخطوط يصف الصعوبات التجريبية التي يمكن أن تحدث عند التعامل مع نماذج polyQ الخميرة ويحدد الاستراتيجيات التي من شأنها أن تساعد على تجنب أوتقليل هذه الصعوبات. ويمكن استخدام البروتوكولات وصفها هنا من أجل تحديد وتوصيف مسارات الوراثية والجزيئات الصغيرة التي تعدل polyQ سمية. وعلاوة على ذلك، قد وصف المقايسات بمثابة نماذج للتحليل الدقيق للتسمم الناجم عن مرض البروتينات المرتبطة أخرى تتجمع في نماذج الخميرة.

Watch this Scientific Journal Video about Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast at JoVE.com

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

هذه المخطوطة تصف ثلاثة بروتوكولات مكملة لتقييم سمية polyglutamine (polyQ) التوسع البروتينات في الخميرة<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;. ويمكن بسهولة أن يتم تعديل هذه البروتوكولات لرصد سمية تتجمع البروتينات الأخرى في الخميرة.

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

growth-assays-to-assess-polyglutamine-toxicity-in-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  Boston Biomedical Research Institute. هذه المخطوطة تصف ثلاثة بروتوكولات مكملة لتقييم سمية polyglutamine (polyQ) التوسع البروتينات في الخميرة خميرة الخباز. ويمكن بسهولة أن يتم تعديل هذه البروتوكولات لرصد سمية تتجمع البروتينات الأخرى في الخميرة.

Video: Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Genetics

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Cancer Research

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

تحديد المسارات المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية باستخدام سميه الخميرة والشاشات المثبطة

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لاكتشاف المركبات النشطة بيولوجيا ضد السمية العصبية بوساطة البولي جلوتامين

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

Neuroscience

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

تأثير البروتينات الفلورية على الشركاء الانصهار باستخدام فحوصات السمية Polyglutamine في الخميرة

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy bodies containing misfolded and aggregated &#945;-synuclein. &#945;-synuclein is an abundant presynaptic protein that regulates synaptic vesicle trafficking, but the accumulation of its proteinaceous inclusions results in neurotoxicity. Recent studies have revealed that various genetic factors, including bacterial chaperones, could reduce the formation of &#945;-synuclein aggregates in vitro. However, it is also important to monitor the anti-aggregation effect in the cell to apply this as a potential treatment for the patients. It would be ideal to use neuronal cells, but these cells are difficult to handle and take a long time to exhibit the anti-aggregation phenotype. Therefore, a quick and effective in vivo tool is required for the further evaluation of in vivo anti-aggregation activity. The method described here was used to monitor and analyze the anti-aggregation phenotype in the humanized yeast Saccharomyces cerevisiae, which expressed human &#945;-synuclein. This protocol demonstrates in vivo tools that could be used for monitoring &#945;-synuclein-induced cellular toxicity, as well as the formation of &#945;-synuclein aggregates in cells.

An in vivo physiological model of &#945;-synuclein is required to study and understand the pathogenesis of Parkinson's disease. We describe a method to monitor the cytotoxicity and aggregate formation of &#945;-synuclein using a humanized yeast model.

طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

PolyQ Aggregation Assay to Identify Neuroprotective Effect of a Compound in Worms

Source: Wang, Q. et al. <a href="https://app.jove.com/v/63081">Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video describes an in vivo method to screen the protective potential of neuroprotective test compounds in reducing polyQ aggregation in body wall muscle cells of nematodes and ameliorating aggregation-associated proteotoxicity.

مقايسة تجميع PolyQ لتحديد التأثير الوقائي العصبي لمركب في الديدان

Source: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity. J. Vis. ...