עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קנוט אליס ולנברג קרן. צוותי כולו של המרכזים החלבון האנושי אטלס ב אופסלה, שטוקהולם והודו הודה על מאמציהם ליצור אטלס החלבון האנושי. המחברים מבקשים להודות במיוחד פרנק Hammar ואת סופי גוסטפסון לעזרה עם תמונות Elené Karlberg על הסיוע בהפקת TMA כאשר מצלמים.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

אימונוהיסטוכימיה הוא ללא ספק היישום הנפוץ ביותר עבור TMAs. שילוב של IHC ו TMAs ניתן להשתמש במסגרות שונות, כגון סינון תפוקה גבוהה של ביטוי דפוסי חלבון ברקמות 7 8 תאים 9 10 מחקרים, גילוי סמן ביולוגי המבוסס על דגימות רקמה של קבוצות חולים גדולות 11 12 ויותר ביולוגיה הגידול הבסיסי מחקרים, כולל פנוטיפים / גנוטיפים שונים, שלבי התמיינות, התקדמות גרורות 13. אחד היתרונות של שימוש TMAs הוא חומר קבוצות גדולות ניתן לנתח בו זמנית, בשני הניסויים לשחזור יותר חיסכון חומר ביולוגי בעל ערך והבטחת. יתר על כן, השימוש TMA הטכנולוגיה חוסכת בעלויות מגיב ועיבוד הזמן במעבדה. כמו TMA מכיל רק כמות מוגבלת של רקמות, רקמות ההטרוגניות היא הבעיה. בהתאם לסוג של רקמות שאלות כדי לקבל מענה, מספר דוגמאות עשוי להיות נחוץ מן specime אותהn. עבור רקמות סרטן, שימוש של שניים עד ארבעה ליבות כל אחד מן הדגימה מומלץ כפי שהוא הוכח לגרום ברמה גבוהה של דיוק בייצוג של סעיפים רקמות שלמות 13 14. תלוי בהרכב רקמות בקוטר של אגרופים (החל מ 0.6 מ&quot;מ 2) יכול להיות מותאם. רקמות מורכבים מורכב משני סוגי תאים שונים, מבנים שונים מחוץ הסלולר מטריקס. ההרכב של כל סוג רקמה שונה המכיל כמות משתנה של שומן, כלי דם, רקמת חיבור, סחוס וכו &#39;, ישפיע על הלחץ הדרוש אגרופים איסוף ליבות נפרדות. לכן חשוב לתרגל את כל השלבים בהליך על חומר שאינו בעל ערך כלשהו, ​​לפני הפקת TMA עם רקמות שהוגדרו עבור הניסויים המיועדים. כאשר חתך מגוון של רקמות שונות בתוך בלוק TMA 1 את הרכב הבלוק יכול להשפיע על היכולת לרכוש חלקים באיכות גבוהה. Certain רקמות, כגון עור, מוח עצם, מוח שומן, חזה, לדקלם חתך של גוש TMA קשה בשל השפעת הבדלי מרקם מקרין כמה סעיפים להושיט באמבט מים עד כמה קשיות שונה נחתך על ידי הלהב וכו &#39; לכן מומלץ לרקמות הקבוצה עם תכונות דומות כגון רקמת השומן עשירה לאחת TMA, כאשר ישים. רוב רקמות סרטן הן במובן זה הומוגנית, המאפשרת חתך של TMAs סרטן. שיטת חתך חלופה לייצוב ליבות microarray יכול להיות מועסק בעת טיפול TMA עם סוגי הטרוגניות של רקמות. השימוש סרט דבק יכול להיות מועיל, כדי למנוע את אובדן ליבות הנשורת ב TMA מחולק. שימוש בסרט הדבקה צריך להיות מועסק בזהירות, שכן הסרט יכול להשפיע על עובי של ליבות מחולקות למדורים ולאחר מכן גם את התוצאה של הכתמה IHC 15. ב חלבון אטלס האדם הגדרת תבנית TMA של 9x8 (לא כולל סמנים) ליבות arדואר בשימוש. יש חשיבות לקבל מספר מקסימלי של חלקים ולשמור את כל הרקמות המיוצגים לאורך הרחוב. כדי לשמור ריאגנטים וזמן הסריקה, סעיפים 2 ממוקמים בשקופית 1 כוס המאפשר תבנית המרבי של 9x8. מאגר מרכזי עבור מידע חלבון, 16 Universal Resource חלבון כולל כ 20.300 ערכים הנסקרת חלבון אדם, מתוכם רק כ 66% יש ראיות ברמת החלבון. גם ברוב של גנים אשר יש עדויות לקיום ברמת החלבון, יש נדירים, אם בכלל, מידע על תפקוד החלבון והפצה של הביטוי. אתגר חשוב לעתיד היא לנתח את דפוס חלוקת והשפע היחסי של החלבונים האלה מוכרים סוגים שונים של רקמה אנושית. מידע ממסדי נתונים כגון Uniprot, ENSEMBL, הנתונים שפורסמו מתוך PubMed יכול לשמש כמדריך לקבוע אם דפוסי צביעה immunohistochemical באמצעות נוגדניםבמחלקות חלבונים לא ידועים מייצגים פרופילים חלבון בפועל של חלבון המטרה המיועד. בנוסף, מספר אסטרטגיות אימות אחרים נדרשים כדי להבטיח פונקציונליות נוגדנים, עבור פונקציונליות למשל נוגדנים במערכים חלבון, למחוק המערבי, immunofluorescence, חיסוני המשקעים הנפתח ניסויים. אולי הכלי החשוב ביותר עבור אימות של פונקציונליות נוגדנים היא להשתמש נוגדנים לזווג, כלומר שני נוגדנים שונים כנגד העלה נפרדות, שאינן חופפות אפיטופים על חלבון המטרה זהה, להשוות assay ספציפי התוצאה 17. בהתבסס על מידע מלוקט, נוגדנים נבדקים טיטרציה על פי סטנדרטים IHC ואת החוויה של הבדיקה והאימות של מעל 35.000 נוגדנים הפרויקט האנושי חלבון אטלס. 20% על כל הגנים עם פרופילי חלבון, נתוני נוגדנים לזווג (2 או יותר נוגדנים כלפי שאינן חופפות אפיטופים על אותו חלבון) שימש כדי לקבוע אסתי הטובה ביותרבן הזוג של דפוס חלבון המתאים הביטוי. נוגדנים מותאמים מספקים האסטרטגיה האולטימטיבי עבור אימות אימונוהיסטוכימיה ספציפיות המבוססות על דפוסי ביטוי חלבונים. אסטרטגיה זו חשובה, כי מספר רב של רקמות שונות שנכללו ההקרנה הבסיסית מגביר את הסיכון תגובתיות צולבת. ראוי גם לציין כי רקמות מסוימות באופן כללי נוטים יותר להראות את הרקע מכתים מקרופאגים למשל, שריר חלק, מבנים צינוריים בכליות ו hepatocytes בכבד. נושאים נוספים שיש לקחת בחשבון כוללים וריאציות טכניקות עיבוד רקמות לאורך זמן על הרקמות שנלקחו חומר ארכיוני, אשר עלולה לגרום שווא דפוסים חיוביים שליליים או לא מתאים IHC צביעה. תופעה זו נתקלה גם בניתוח בחלק גדול. בקרות שליליות וחיוביות חיוניים ויש להשתמש בהם בכל הזדמנות אפשרית. עבור מחקרים עמוקים יותר כולל ניתוח פונקציונלי, שורות תאים עם ביטוי מסוים נאלץ ו לדפוק למטה של ​​TR המתאימיםanscripts (טכנולוגיה siRNA) ניתן להשתמש כדי ליצור פקדים. לקבלת תוצאות אופטימליות ב IHC, חשוב לבדוק ולהשתמש אחזור מערכות אנטיגן, שכן קיבוע בפורמלין גורם שינויים כימיים שונים כגון cross-linking, הידרוליזה של בסיסים שיף מסתירה את האנטיגן 18. לסיכום, נוגדן מבוססי proteomics המעסיקים TMA טכנולוגיה IHC היא אסטרטגיה רב עוצמה ליצירת ביטוי חלבון נתונים בקנה מידה גדול. הפרויקט החלבון האנושי אטלס הוקם כדי ליצור מפה של ביטוי החלבון האנושי ברקמות אדם נורמליים וסרטן. מטרת הפרויקט היא להציג את הטיוטה הראשונה של אטלס חלבון מקיפה האדם בשנת 2015. בנוסף לאספקת פרופילים חלבון איברים ורקמות רגילים, המאמץ הזה גם מספק נקודת המוצא של מחקרים ביו, כולל המאמצים לגילוי סמן ביולוגי קליניים. המטרה הסופית היא להוסיף שכבת המידע הבא על גבי רצף הגנום האנושי Wiתהיה קריטית להבנה עמוקה יותר של הביולוגיה שבבסיס מחלות מדינות שונות, ולספק בסיס לפיתוח כלי אבחון טיפולית חדשנית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> לשטוף את החיץ </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> מדד ת&quot;א 999-TT </td></tr><tr><td> ציטראט חיץ pH6 </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> מדד ת&quot;א 250 Pm1X </td></tr><tr><td> נוגדנים diluent </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> מדד ת&quot;א 125, א.ד. </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP פולימר </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB בתוספת מערכת המצע </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> מדד ת&quot;א 125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V חסום </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> מדד ת&quot;א 125-UB </td></tr><tr><td> נוגדן ראשוני Enhancer </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> מאירס hematoxylin </td><td> HistolAB </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> שם הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> מדריך רקמות מיקרו arrayer </td><td> Estigen, כלי ביצ&#39;ר </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> מפל microtome </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> תמונה אוטומטי הסורק </td><td> Aperio טכנולוגיות </td><td> XT </td></tr><tr><td> שקופיות אוטומטית מכתים מערכת </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> שקופיות אוטומטית מכתים מערכת deparafinization והתייבשות </td><td> לייקה Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> זכוכית אוטומטי coverslipper </td><td> לייקה Biosystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking קאמרית </td><td> Biocare רפואי </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

רקמת microarray (TMA) הטכנולוגיה מספקת את האמצעים לניתוח תפוקה גבוהה של רקמות תאים רבים. הטכניקה משמשת במסגרת פרוייקט האדם חלבון אטלס לניתוח העולמי הביטוי דפוסי חלבון ברקמות אדם נורמליים, סרטן שורות תאים. כאן אנו מציגים את הרכבה של 1 מ&quot;מ ליבות, לאחזר מרקמות נציג שנבחרו מיקרוסקופית, לתוך בלוק אחד הנמען TMA. מספר וגודל ליבות בבלוק TMA יכולים להיות מגוונים מ כ 40 מ&quot;מ עד 2 ליבות מאות ליבות 0.6 מ&quot;מ. היתרון של שימוש בטכנולוגיה TMA היא כי כמות גדולה של נתונים במהירות יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול immunostaining אחת, כדי למנוע השתנות ניסיוני. חשוב לציין, רק כמות מוגבלת של רקמות נדירים יש צורך, המאפשר ניתוח של קבוצות חולים גדולות 1 2. כ 250 קטעים רצופים (4 מיקרומטר עבה) ניתן לחתוך מבלוק TMA ושימשו staini immunohistochemicalng לקבוע דפוסים מסוימים ביטוי החלבון על 250 נוגדנים שונים. בפרויקט האדם חלבון אטלס, נוצרים נוגדנים כלפי כל החלבונים האנושיים נהג לרכוש פרופילים חלבונים המתאימים בשתי רקמות אדם נורמלי מ 144 אנשים ורקמות סרטן מ 216 חולים שונים, המייצגים את 20 הצורות הנפוצות ביותר של סרטן אנושי. מוכתמים Immunohistochemically סעיפים TMA על שקופיות הזכוכית נסרקים ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה שממנו פתולוגים יכול לפרש ויסמנו את התוצאה של אימונוהיסטוכימיה. תמונות יחד עם הפתולוגיה מבוססי הנתונים המתאימים הסברים זמינים בפומבי למען הקהילה המחקר באמצעות חלבון אנושי אטלס הפורטל ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (איור 1) 3 4. אטלס החלבון האנושי מספק מפה המראה את הפיזור והשפע היחסי של החלבונים בגוף האדם. גרסה הנוכחישיאון מכיל מעלה מ -11 מיליון תמונות עם הביטוי נתונים חלבון עבור 12.238 חלבונים ייחודיים, המתאימים יותר מ 61% מכלל החלבונים המקודדים על ידי הגנום האנושי.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Microarrays רקמות מאפשר שיטה יעילה לקבל מידע מקבילים ממספר רב של רקמות. חלקים מייצגים של רקמות נאספו לידי בלוק פרפין אחת. קטעים מתוך בלוק משמשים אימונוהיסטוכימיה וניתוח דפוסי ביטוי חלבון. סריקה דיגיטלית מייצר תמונות המתאימות להפצה של נתונים.

הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

55.7K Views.  Uppsala University. Microarrays רקמות מאפשר שיטה יעילה לקבל מידע מקבילים ממספר רב של רקמות. חלקים מייצגים של רקמות נאספו לידי בלוק פרפין אחת. קטעים מתוך בלוק משמשים אימונוהיסטוכימיה וניתוח דפוסי ביטוי חלבון. סריקה דיגיטלית מייצר תמונות המתאימות להפצה של נתונים.

Video: Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...