Bu çalışma Knut ve Alice Wallenberg temelden bağışları ile desteklenmiştir. Uppsala, Stockholm ve Hindistan İnsan Protein Atlas merkezlerinin tüm kurmayları İnsan Protein Atlas oluşturmak için çabaları için kabul edilmiştir. Çekerken, yazarlar, özellikle TMA üretimi ile yardım için fotoğraf ve Elene Karlberg yardım için Frank Hammar ve Sofie Gustafsson teşekkür etmek istiyorum.

1. Doku Mikroarray Üretim için dokular nasıl hazırlanır (Animasyon 1) <ol><li> Karşılık gelen hematoksilen lekeli doku bölümü de dahil olmak üzere ilgili formalin sabit parafin malzeme (doku ya da hücre örnekleri) seçin. </li><li> Doku bölümünde ilgili bölümü işaretleyin. Bu parafin blok karşılık gelen bir yeni kesilmiş hematoksilen lekeli bölümü olması tavsiye edilir. </li><li> TMA üretimi için kullanılan şablonu tasarlayın. Örneğin, bütün TMA bölümü ve kesit sorunlar üzerinde antikor kapsama gibi teknik sorunlardan kaynaklanan eserler önlemek için şablon içinde örnekleri Rastgele. Yönlendirme için şablonuna ek yönlendirme işaretleri ekleyin. </li><li> Şablona göre dokuların düzenleyin. </li></ol> 2. Manuel Doku Mikroarray Üretim (çekim için Temel) <ol><li> , Doku çekirdek standart bir uzunluk elde stileyi örneğin 4.5 mm (Şekil 2) işaretlemek için edebilmek. GuidelÖrnek merkezleri arasındaki mesafe için ines: çekirdek büyüklüğü 0,6 mm - 0.8-1.0 mm Çekirdek boyutu 1.0 mm - 1.8-2.0 mm çekirdek büyüklüğü 1,5 mm - 2.0-3.0 mm Çekirdek boyutu 2.0 mm - 2.5-4.0 mm Bu parafin çatlamasını önlemek için parafin blok her iki tarafında 2.5-3.0 mm kenar boşluğu bırakmak önerilir. </li><li><ol class="lalpha"><li> Kullanılmak üzere seçilen delgeçler monte edilir. Yerde yumruk tutan altıgen soket vida gevşeterek başlayın. Yumruk hub oluk sıkıca v-blok plastik metal çubuk karşı yerleştirildiğinde yumruk doğru konumlandırılmış. Vidaları ve metal klibin kenarı yatay olduğundan emin olmak. </li><li> Alıcı yumruk sola yerleştirilmelidir (yeşil ve kırmızı, distribütör için özel olarak işaretlenmiş). Donör yumruk biraz daha büyük bir çapa sahip olan, (Şekil 3) sağa doğru konulmalıdır (yeşil ve mavi, distribütör için özel olarak işaretlenmiş). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> XY ayar dügmesini kullanarak x ve y eksenleri boyunca yumruklar taşıyın. Doğru ayar düğmesi x ekseni boyunca hareket yumruklar ve sol ayar düğmesi y ekseni boyunca yumruklar taşır. Ayarlaması kolları hem dijital bir mikrometre okuma vardır. Kolları hareket ettirirken Bu aktive edilir. </li><li> Reset → SIFIR / ABS düğmesine basın. Inç ve mm arasında Shift → / aa IN düğmesine basın. Bir 9x8 şablon için bir 1 mm zımba kullanıldığında delikleri arasındaki boşluk 2.0 mm (delik merkezleri arasındaki ölçülen) olmalıdır. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Kaset vurmak ve yumruk yok, sen blok içine çok aşağı yumruk itmeyin sağlamak için, tutucu içinde parafin olmadan bir kaset koydu ve kaset alt yukarıdaki 1 mm alıcı yumruk alt konumunu ayarlamak az derin stop vidasından kullanılarakZ-kılavuz sol üst köşesinin (Şekil 3). </li><li> Tutucu alıcı blok koyun ve vidaları sıkıştırmak için küçük bir tornavida kullanın. Sıkı vidaları sıkıştırın etmeyin ya da parafin kasetinden kurtulacağım olabilir. </li><li> Alıcı blok içine aşağı alıcı yumruk yaklaşık 5 mm itin ve (Şekil 3) kez ileri ve geri döndürmek için yumruk yumruk kolu kullanın. Mümkün olduğunca blok içine kadar aşağı yumruk iterken delik 5 mm derinliğinde olacaktır. </li><li> Yaylar yumruk yukarı taşımak, böylece yavaş yavaş aşağı doğru iterek basıncını tahliye edin. Yumruk boşaltmak ve parafin çekirdek atmak için stileyi kullanın. </li></ol></li><li> Donör delme (Şekil 3) geçmek için taret taşıyın. </li><li> Alıcı blok tutucu üzerinden donör blok (Şekil 3) ile donör blok köprü yerleştirin. </li><li><ol class="lalpha"><li> Donör Nokt itindonör bloğun seçilen alana h. Karşılık gelen hematoksilen ve faiz bölgeye örnek olmaktır doku bulmak için imlenmiş eozin slayt kullanın. El sol elinizle pozisyonda donör blok tutun ve sağ elinizle yumruk itin. Eğer Stile üzerinde itmek gerektiğini unutmayın. Derinlik donör blok için uygun konumda yumruk hareketi engellemek değil, bu nedenle ikinci işareti Stile üzerinde görünür olduğunda bastırıyor durdurmak önemlidir. </li><li> Bir kez yumruk (Şekil 3) kolu çevirin. Hala donör blok köprü donör blok tutarak yavaşça aşağı doğru basınç bırakın. </li><li> Donör doku tercihen alıcı çekirdek daha kısa 0.5 mm delikli edilir. Bu proses değerli temsili doku kaybı kaçınarak, alıcının blok yüzeyinde göbeklerin ayarlanabilir bir uyum sağlar. </li></ol></li><li> Köprü ve donör blok çıkarın. Yapmakdonör yumruk (nokta 4) daha önce yapılmış delik ile uyumlu olduğundan emin olun. Siz donör yumruk ve alıcı blok delik uyumlu değilse ayarlayın vidaları kullanarak yumruk konumunu ayarlamak gerekir. </li><li> Ucu alıcı blok deliğin üst ulaşıncaya kadar dikkatlice aşağı yumruk itin. Bu pozisyonda tutarken, deliğe doku çekirdek boşaltmak için stileyi kullanın. Çekirdek yüzeyi blok yüzeyi ile aynı hizada olacaktır. </li><li> Alıcı yumruk taret geri hareket ettirin. </li><li> XY ayar düğmeleri ile bir sonraki konuma gider. </li><li> Dizi tamamlanana kadar yukarıdaki noktası 4c itibaren tekrarlayın. </li><li> Tüm alıcı blok bittiğinde alıcı blok tutucu vidayı gevşetin. 40 dakika süreyle 42 ° C blok pişirilir. Cam bir slaytta aşağı bakacak kesit alanı ile blok koyun. Bir test tüpü sahibi (veya uygun başka inşaat) ve t yer üstüne bloğu ile cam slayt yerleştirindiye fırınlayın. Pişirme sonra fırından test tüpü tutucusunu çıkarın ve yavaşça cam slayt okşayarak tarafından blok yüzeyine düzleştirin. </li><li> 10 dakika boyunca bir soğutma cam plaka üzerine kayar ile blok yerleştirin. TMA boyunca temsilcisi doku sağlamak için her 50. bölümünde bir kalite kontrolü yapılır. </li></ol> 3. Nasıl Bölüm TMAlar (Animasyon 2) <ol><li> Bölümüne transfer sistemi (HM 355S, Microm) ile bir mikrotom kullanarak 4 mikron kalınlığında kesitler kesin. Sistem tüm döner Mikrotomlar ile birlikte kullanılabilir. Sistemi entegre transferi köprü, ısıtılmış bir su banyosu ve bir kontrol ünitesi ile bir bıçak taşıyıcı oluşur. Bıçaklı bölümlerde su banyosuna bir transfer köprü ile ıslak transfer yüzeyi üzerinde kayar. </li><li> Bölümler bunlar hassas doku noktalar (göğüs ve beyin gibi örneğin lipid zengin dokular) erimesi önlemek için, uzattığınız hemen sonra su banyosu alınmalıdır. PlaBir SuperFrost cam slayt üzerine ce bölümü. Bölümler su içinde bırakılabilir zaman parafin tipi kullanılan ve suyun sıcaklığı mumlu bağlıdır. ° C ve 37-39 arasında bir su banyosu sıcaklığında önermektedir ° C&#39;de 56-58 arasında bir erime noktasına sahip HistoLab Products A, bizim laboratuar kullanımı parafin </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) kurutma için bir kayar tutucuya slaytlar yerleştirin. </li><li> Slaytlar 12-24 saat süreyle 50 ° C fırınlanır. Eğer bir fırça gibi kullanarak el bıçaklı bir su banyosuna bölümüne taşımak zorunda STS olmadan Mikrotom kullanma. </li></ol> 4. Test ve İmmünohistokimya için Titrasyon Prosedürü (Animasyon 3) Her bir antikor doku ve farklı hücre tipleri bir karışımını içeren özel olarak tasarlanmış TMAlar kullanılarak standart bir test prosedürü tabi tutulur. Amaç her antikor için bireysel ve optimize immun protokolü değerlendirmektir. Karınca dayalı Başlangıçta bir seyreltme,Primer antikor ibody stok konsantrasyonları test edilir. Bu test boyamanın sonucu protokol daha dilüsyonları ve optimizasyon yönlendirmek için kullanılır. <ol><li> Damıtılmış su ksilen ve dereceli etanol içinde Deparaffinization ve hidratasyon İmmünoboyama önce gerçekleştirilir. </li><li> Endojen peroksidaz gidermek için bir engelleme adım 5 dakika süreyle% 95 etanol içinde% 0.3 H2O 2 gerçekleştirilir. </li><li> Isı Induced epitop Alım (Hier) 125 azından 4 dakika boyunca ısı kaynağı olarak bir basınç kazanı (Decloaking odacık, Biocare Medical) kullanılarak ° C&#39;de, bir tampon, pH değeri alımı 6 gerçekleştirilir Kaynama tamamlandıktan sonra, kaydıraklar basınç kazanı kalır ve 90 soğumasına izin verilir ° C. Hier için toplam işlem süresi yaklaşık 45 dakikadır. </li><li> Hiçbir kesin sonuç ilk testte elde edilirse, daha ileri testler gözlenen boyanma paterni 5 6 dayalı yapılır. Pilot çalışma, HPA yüksek verimli set-up içinde gösterdiBu Hier pH 6, ancak bu tür proteinaz, mikrodalga ve daha yüksek veya daha düşük bir pH ile tampon içinde kaynatma ile ön-inkübasyon gibi diğer yöntemler alma tabii kullanılabilir en yararlı antijeni alma. Antikor inkübasyon sürelerinde, antikor dilüsyonları ve diaminobenzidin (DAB), inkübasyon zaman değişiyor IHC durum örneğin değiştirerek boyama desen daha kesin sonuçlar verebilir. </li></ol> 5.. Boyama Programı, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Bütün inkübasyonlar, RT gerçekleştirilir ve bu protokol aynı reaktifleri ile manuel bir ayar olarak da kullanılabilir. <ol><li> Yıkama tamponu içinde çalkalayın. </li><li> 5 dakika boyunca Ultra V bloğu ile inkübasyondan. </li><li> Yıkama tamponu içinde çalkalayın. </li><li> 30 dakika için primer antikor ile inkübasyondan. </li><li> Yıkama tamponu (x2) yıkayın. </li><li> 30 dakika etiketli turbu peroksidaz-polimer ile Kuluçka. </li><li> Yıkama tamponu (x2) yıkayın. </li><li> DAB çözüm geliştirilmesi10 dakika için. </li><li> Yıkama tamponu (x2) yıkayın. </li><li> 5 dakika için * Mayers hematoksilin Counterstaining. Progresif bir boyama yöntemi kullanılarak zaman (örn. Mayers hematoksilin) ​​yoğunluğu zaman bağlıdır ve herhangi bir farklılaşma gereklidir. Bir gerici boyama yöntemi örneğin Harris hematoksilen bir yapı vurgulamak amacıyla dokuların aşırı boya kaldırmak için farklılaşmayı gerektirir. </li><li> Musluk suyu * yıkayın. </li><li> Lityum karbonat suda durulayın, 1 dakika * için doymuş çözeltisi ila 1:5 seyreltilmiş. </li><li> * 5 dakika için musluk suyunda yıkayın. </li><li> Slaytlar dereceli etanol içinde susuz ve slaytlar (PERTEX, Histolab) dakika muamele edilir </li></ol> Tüm reaktifler slayt başına 300 ul bir ses seviyesinde uygulanır. * Adımlar 10-14 bir histostaining enstrüman (Autostainer XL, Leica) yapılır ve coverslipping ayrıca bir coverslipper sistemi (otomatik cam coverslipper CV5030, Leica) yapılır. 6. Tarama nasılBir Slayt Tarama slayt yöntemi kullanılmaktadır dijital tarayıcı bağlıdır, bu protokolü sadece otomatik tarama sistemi Aperio XT (Aperio Teknolojileri) kullanarak slayt tarama nasıl tanımlar. Için İnsan Protein Atlas set-up 20x büyütme, doku ve hücreler için 40x kullanılır. Otomatik bir tarama doku heterojen bir TMA dahil çeşitli dokularda sayısına bağlı olarak odak sorunlarla olabilir. <ol><li> Kir, tutkal ve cam slayt temizleyin ve coverslip ve bölüm arasında hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin. Hava kabarcıkları gerilemek slayt halinde. </li><li> Rafa slayt koyun ve dijital tarayıcı rafa yerleştirin. 20x büyütmede TMA tarama süresi yaklaşık 6 dakikadır. Aperio gelen bir yazılım ilgi alanını seçmek için kullanılır. Odak noktası seçimi yazılım içinde otomatik olarak yapılır. Elle tarama alanı ve odak noktalarının seçiminde de mümkündür. </li><li> Görüntü saat sonraoluşturulan olarak değerlendirilmesi ve IHC lekelenmesi açıklama amacıyla kullanılabilir. Görüntüler deney sonucunda dosya olarak kalır ve tartışmalar için arkadaşları dağıtılmış olabilir ve daha fazla veri yayımlama için kullanılır. Görüntüleri Aperio bir serbestçe kullanılabilir yazılım görülebilir. </li></ol> 7. Nasıl İnsan Protein Atlas Sık Protein ara ile <ol><li> Gidin <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Favori protein, Ensemble&#39;da id, UniProt üyelik numarası veya HGNC adı örneğin insülin adını girin. </li><li> Özet sayfası girin ve normal doku ve organ özeti gidin. Genel pankreas protein ifadesini gösterir. </li><li> &quot;Fazla doku veri&quot; tıklayın. Sen bütün dokularda organı sıralaması dahil görebileceğiniz normal dokuları görüntülemek girin. </li><li> Aynı protein yönelik 3 antikorları için İHK sonuçları görmek için pankreas tıklayın. Bir hi görüntülemek içingörüntü üzerinde pankreas tıklayın gh-çözünürlüklü görüntü. </li><li> Kanserli doku, hücre ve İnsan Protein Atlas içinde başka doğrulama, veri protein ekspresyonu ile ilgili ek bilgiler İnsan Protein Atlas web sitesinde gezinirken bulunabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Animasyon 1. Nasıl doku mikroarray üretimi için dokuların hazırlanması. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Animasyon 1 görmek için buraya tıklayın</a> . Animasyon 2. Nasıl bölümüne TMAlar için. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Animasyon 2 görmek için buraya tıklayın</a> . Animasyon 3. Immünhistokimya tekniği tarif edilmiştir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Animasyon 3 görmek için buraya tıklayın</a> .<img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Şekil 1. Insan proteini Atlas Uppsala içinde işlemi Genel şeması. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Doku çekirdek standart uzunluğu için işaretlenmiş Şekil 2. Donör stileyi 4.5 mm gibi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Şekil 3. Manuel doku microarrayer. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Şekil 4. Üretilen TMAlar farklı kalite örnekleri. (A) düz ve düzgün satır ve sütun gibi parafin kenarına arasında yeterli boşluk ile TMA hizalanır. (B) çekirdek bazıları ile bir TMA çok kesit zaman olası güçlüklere yol kenarına yakın. (C) bir TMA t pişirilir edilmiş olduğuoo uzun doğru şablonu olmadan çökmüş TMA sonuçlanır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Şekil 5. Hematoksilen ve eozin TMAlar. Düz ve hizalı sütun ve satır ile (A) düzgün kesilmiş bölümü. Kötü ya da kirli bıçak kullanarak yarma (B) veya sıkıştırılmış bölümleri (C) neden olabilir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Şekil 6. Antikorların titrasyon. (A) lenf düğümü hücreleri Reaksiyon merkezi geçmişi olmayan özel bir sitoplazmik boyanması (kahverengi gösterildiği gibi) ile sonuçlanan bir optimum titre antikoru gösterir. (B) doku bölümü zayıf bir boyama gösterir. Negatif ya da zayıf bir boyama primer antikorun konsantrasyonunu hedef protein immunohistokimyasal dokularda mevcut değildir çok düşük olduğunda veya bulunur. (C) doku bölümü primer antikorun çok yüksek konsantrasyonda kullanılması nedeniyle overstained edilir. D, taşmak reaktivite ve yanlış pozitiflik geçmeye nedeniyle Subselüler yerini belirlemede zorluklar içinde gemi renk sonuçlar.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

İmmünohistokimya tarafından bugüne kadar TMAlar için en sık kullanılan bir uygulamadır. IHC ve TMAlar kombinasyonu 11 12 ve daha fazla bazik tümör biyolojisi geniş bir hasta kohortlarında doku örnekleri dayalı dokularda protein ifadesini 7 8 kalıpları ve hücreler 10 9, belirteç buluş çalışmaların örneğin yüksek verimli tarama teknikleri, birkaç farklı ayar kullanılabilmektedir farklı fenotipleri / genotipleri, farklılaşma aşamaları, ilerleme ve metastazı 13 de dahil olmak üzere çalışmalar. TMAlar kullanmanın bir avantajı, büyük kohort malzeme hem de değerli biyolojik malzeme tasarrufu sağlanması ve daha tekrarlanabilir deneyler, bir anda analiz edilebilir. Ayrıca, TMA teknoloji kullanımı reaktif maliyetlerini ve laboratuvar işlem zamandan tasarruf sağlanır. Bir TMA sadece bir doku sınırlı miktarda içerdiğinden, doku heterojen bir konudur. Doku ve ele alınması gereken soru türüne bağlı olarak, birkaç örnek aynı specime gelen gerekebilirn. Bütün bu doku bölümlerini 13 14 temsili doğruluğu, yüksek derecede neden olduğu gösterilmiştir olarak tümör dokuları için, her örnek 2-4 çekirdek kullanılması tavsiye edilir. Doku bileşimine bağlı olarak delgeçler (0.6 mm ila 2 mm kadar) ve çapı ayarlanabilir. Dokular karmaşık ve hem de birkaç farklı hücre tipleri, yapıları ve ekstraselüler matriks vardır. Yağ değişken miktarda içeren her farklı doku tipi kompozisyonu, kan damarları, bağ dokusu, kıkırdak dokusu gibi, ayrı çekirdek delme ve toplanması için gerekli basınç etkileyecektir. Bu deneyler için amaçlanan tanımlandığı dokuları ile TMA üretiminde daha önce, herhangi bir değer olmayan malzeme üzerine prosedürü tüm adımları uygulamaya önem taşımaktadır. Bir TMA blok içinde farklı dokularda çeşitli kesitler zaman blok kompozisyonu yüksek kalite bölümleri kazanmak yeteneğini etkileyebilir. Certain dokular, örneğin deri, kemik iliği, yağ, beyin ve meme, bölümleri su banyosunda germek nasıl etkileyen doku farklılıkları etkisi nedeniyle zor TMA blok kesit ve nasıl farklı sertlik vermekteyiz bıçak vb tarafından kesilir uygulanabildiği takdirde Dolayısıyla benzer özelliklere sahip grup dokulara tavsiye edilir, bir TMA içine yağ bakımından zengin doku gibi. Kanser dokularının çoğunda bu anlamda homojen, hangi kanser TMAlar bir kesit kolaylaştırır. Dokular heterojen türleri ile TMA tutarken mikroarray çekirdeği stabilize edilmesi için alternatif bir kesit yöntemi uygulanabilir. Bir yapışkan bant kullanımı kesitli TMA çekirdek ve fall-out kaybı önlemek için yararlı olabilir. Bant kesitli çekirdek kalınlığı etkileyen ve daha sonra da İHK boyama 15 sonuç çünkü yapışkan bant kullanımı, dikkatli kullanılmalıdır. 9x8 İnsan Protein Atlas set-up bir TMA şablonu (işaretleri hariç) çekirdek are kullanılabilir. Bu bölümden maksimal numarası almak ve blok boyunca temsil edilen bütün dokulara tutmak için önemlidir. Reaktifler ve tarama zamanı kaydetmek için, 2 gözlü 9x8 maksimum şablon sağlayan bir cam slayt yerleştirilir. Protein bilgi için büyük deposu, Universal Protein Resource 16 sadece yaklaşık% 66 protein düzeyinde kanıta sahip olan yaklaşık 20.300 yorumlanan insan proteini girişlerini içerir. Ayrıca protein düzeyi üzerindeki varlığını kanıt olduğu genlerin bir çoğunluğu için, kıt veya protein fonksiyonu ve ifade dağıtımı konusunda herhangi bir bilgi yoktur. Gelecek için önemli bir zorluk dağılımı ve insan dokusu, çok çeşitli şekillerde bu bilinmeyen proteinlerin göreceli bolluk analiz etmektir. Böyle Uniprot, Ensemble&#39;da, PubMed yayımlanan veri olarak veritabanlarından bilgi immünohistokimyasal boyanma antikorları kullanarak eğer kurmak için bir kılavuz olarak kullanılabilirservislerinde bilinmeyen proteinleri amaçlanan hedef protein fiili proteini profilleri temsil eder. Ayrıca, diğer bazı doğrulama stratejileri protein dizileri, Western Blot, immünfloresan, immüno-yağış ve açılan deneylerde Örneğin antikor işlevsellik için, antikor işlevselliği sağlamak için gereklidir. Belki antikor işlevselliği doğrulama için en önemli araç eşleştirilmiş antikorlar kullanmak, yani iki farklı antikor testi-spesifik sonuç 17 karşılaştırmak için, aynı hedef proteini ayrı, örtüşmeyen epitoplara kaldırdı. Derlenen bilgilere göre, antikorlar IHC standartları ve İnsan Protein Atlas projesinde 35.000 antikorlar üzerinde test edilmesi ve tanınması gelen deneyim göre test edilmiş ve titre edilir. Protein profilleri ile tüm genlerin% 20&#39;den, eşleştirilmiş antikorlar (aynı protein örtüşmeyen epitopları doğru 2 veya daha fazla antikor) veri en iyi Esti belirlemek için kullanılmıştırgelen protein ifade deseninin dostum. Eşleştirilmiş antikorlar özel immünhistokimya bazlı protein ekspresyonu doğrulanması için nihai bir strateji sunmak. Temel tarama dahil farklı dokuların çok sayıda çapraz reaksiyon riskini artırır, çünkü bu strateji değerlidir. Bu belli dokularda genel olarak örneğin makrofajlar, düz kas, böbrek distal tübüller ve karaciğerde hepatositlerde boyama arka plan göstermek için daha fazla eğilimli olduğu da unutulmamalıdır. Yanlış negatif ya da uygunsuz pozitif IHK boyanma neden olabilir arşiv malzemesi alınan dokular için zamanla doku işleme teknikleri farklılıklar, düşünülmesi gereken ek sorunları. Bu olgu, aynı zamanda büyük bir bölümü analiz görülür. Hem negatif hem pozitif kontroller çok önemlidir ve mümkün olduğunda kullanılmalıdır. İlgili tr fonksiyonel analiz, zorla ifade ile hücre hatları ve özel knock-down gibi derin çalışmalar içinanscripts (siRNA teknolojisi) denetimler oluşturmak için kullanılabilir. Formalin fiksasyonu çeşitli kimyasal değişiklikler, çapraz bağlama antijen 18 maskeleme Schiff bazları hidroliz gibi indükler yana IHC optimum sonuçlar için, bu, antijen alma sistemleri test etmek ve kullanmak önemlidir. Sonuç olarak, TMA teknolojisi ve IHC kullanıldığı antikor bazlı proteomiks büyük bir ölçekte proteini ifade verilerinin üretilmesi için güçlü bir strateji. İnsan Protein Atlas projesi normal insan dokularının ve kanser insan protein ekspresyonunda bir harita oluşturmak için kurulmuştur. Bu projenin amacı, 2015 yılında kapsamlı bir İnsan Protein Atlas ilk taslağını sunmak. Normal organ ve dokularda protein profilleri sağlamanın yanı sıra, bu çaba da klinik biyomarker bulma çabaları da dahil olmak üzere biyomedikal araştırma projeleri için bir başlangıç ​​noktası sağlar. Nihai hedef, insan genom dizisi üstüne bir sonraki bilgi katmanı eklemek olduğunu wiçeşitli hastalık durumları altta yatan biyolojinin daha derin bir anlayış için çok önemli olacak ve yeni tanı ve tedavi araçları geliştirmek için bir temel teşkil edeceğiz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Tampon yıkayın </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Tampon PH6 sitrat </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Antikor seyreltici </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP polimer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB artı substrat sistemi </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Blok </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> İlköğretim Antikor Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hematoksilen </td><td> Histolab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Manuel doku mikro arrayer </td><td> Estigen, Beecher Enstrüman </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Şelale mikrotom </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Otomatik görüntü tarayıcı </td><td> Aperio Teknolojileri </td><td> XT </td></tr><tr><td> Otomatik slayt boyama sistemi </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Deparafinizasyon ve dehidrasyon için otomatik slayt boyama sistemi </td><td> Leica Biyosistem </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Otomatik cam coverslipper </td><td> Leica Biosystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking odası </td><td> Biocare Tıp </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

Doku mikroarray (TMA) teknolojisi, birden fazla doku ve hücrelerin yüksek verimlilik analizi için araçlar sağlar. Normal insan dokularında tekniği, kanser hücresi hatlarında ve protein salgılanma modellerini küresel analizi için insan proteini Atlas proje içinde kullanılmaktadır. Burada tek bir alıcı TMA blok içine mikroskopik olarak seçilmiş temsili dokulardan alınan 1 mm çekirdek montaj, sunuyoruz. Bir TMA blokta çekirdek sayısı ve büyüklüğü 0.6 mm çekirdek yüzlerce yaklaşık kırk 2 mm çekirdeklerinden değiştirilebilir. TMA teknolojisi kullanılarak bir avantajı verilerin bu büyük miktarda hızla deney değişkenliği önlemek için, tek bir immun protokol kullanılarak elde edilebilir. Önemli olarak, nadir doku sadece sınırlı bir miktarda hastaya büyük kusaklardaki analizi 1 2 olanak sağlayan, ihtiyaç duyulmaktadır. Yaklaşık olarak 250 ardışık bölümleri (kalın 4 mikron) bir TMA blok kesilmiş ve immünhistokimyasal staini için kullanılabilir250 farklı antikorları spesifik protein ekspresyonu belirlemek için ng. İnsan Protein Atlas proje içinde, bütün insan antikorları proteinleri doğru oluşturulur ve insan kanser 20 en yaygın formları temsil eden 216, farklı hastalar, 144 bireyler ve kanserli hem de dokulardan Normal insan dokularında karşılık gelen protein profilleri elde etmek için kullanılır. Cam lamlara İmmunohistokimyasal lekeli TMA bölümleri patologlar yorumlamak ve immünhistokimya sonuçlarının açıklama olabilir hangi yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için taranır. Araya gelen patoloji tabanlı açıklama verilerle Görüntüler İnsan Protein Atlas portalı (aracılığıyla araştırma toplumu için kamuya yapılan <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Şekil 1) 3 4. İnsan Protein Atlas insan vücudunda dağıtım ve proteinlerin göreceli bolluk gösteren bir harita sunar. Mevcut verMisyonu ise, insan genomu tarafından kodlanan tüm proteinlerin fazla% 61&#39;e karşılık gelen 12,238 eşsiz protein, protein ifade verileri ile 11 milyon görüntüleri içerir.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Tuvar dokuların çok sayıda eşzamanlı bilgi elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Dokuların Temsilcisi parçaları tek bir parafin blok içine monte edilir. Bloktan bölümleri proteini ifade kalıpların immünhistokimya ve analiz için kullanılır. Dijital tarama veri dağıtımı için ilgili görüntüler oluşturur.

İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray&#39;ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

55.8K Görüntüleme.  Uppsala University. Tuvar dokuların çok sayıda eşzamanlı bilgi elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Dokuların Temsilcisi parçaları tek bir parafin blok içine monte edilir. Bloktan bölümleri proteini ifade kalıpların immünhistokimya ve analiz için kullanılır. Dijital tarama veri dağıtımı için ilgili görüntüler oluşturur.

Video: Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 Yetişkin Cilt Dokularından İnsan Melanositlerin Verimini Zenginleştirir

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Sığır Yumurtalık Korteks Doku Kültürü

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...