Este trabalho foi suportado por concessões do Knut e Alice Wallenberg Foundation. As equipes inteiras dos centros de proteínas humanas Atlas em Uppsala, Estocolmo e Índia são reconhecidos por seus esforços para gerar o Atlas proteína humana. Os autores gostariam de agradecer especialmente a Frank Hammar e Sofie Gustafsson para obter ajuda com as fotos e Karlberg Elene de assistência com a produção TMA quando as filmagens.

1. Como se preparar tecidos para a produção de tissue microarray (Animação 1) <ol><li> Selecionar material de parafina relevante formalina fixo incorporado (amostras de tecidos ou células), incluindo correspondente secção de tecido manchado hematoxilina. </li><li> Marcar área relevante na secção de tecido. Recomenda-se a ter uma secção corada com hematoxilina acabada de cortar correspondente ao bloco de parafina. </li><li> Projete o modelo usado para a produção de TMA. Randomize as amostras dentro do modelo para evitar artefatos causados ​​por problemas técnicos, tais como cobertura do anticorpo sobre a seção TMA todo e problemas de seccionamento. Adicionar marcadores de orientação adicionais para o modelo para orientação. </li><li> Organizar os tecidos de acordo com o modelo. </li></ol> 2. Produção Microarray manual de Tissue (essencial para a filmagem) <ol><li> Para ser capaz de obter um comprimento normalizado de os fragmentos de tecido, marcar o estilete 4,5 milímetros por exemplo, (Figura 2). Guidelines para o espaçamento entre os centros de exemplo: núcleo de tamanho 0,6 milímetros - 0,8-1,0 milímetros núcleo milímetros de tamanho 1.0 - 1,8-2,0 mm núcleo de tamanho 1,5 milímetros - 2,0-3,0 milímetros núcleo tamanho 2,0 milímetros - 2,5-4,0 milímetros Recomenda-se para deixar 2,5-3,0 margens mm em cada lado do bloco de parafina para evitar rachaduras da parafina. </li><li><ol class="lalpha"><li> Monte os socos selecionado para ser usado. Comece por afrouxar os parafusos da chave sextavada que prende o soco no lugar. O punção é correctamente posicionada, quando a ranhura no cubo punção é colocado firmemente contra a haste de metal no plástico v-bloco. Apertar os parafusos e certificar-se que a borda do clipe de metal é horizontal. </li><li> O soco destinatário (marcados em verde e vermelho, específico para o distribuidor) deve ser colocado para a esquerda. O perfurador dador (marcado em verde e azul, específico para o distribuidor), que tem um diâmetro ligeiramente maior, deve ser colocado para a direita (Figura 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Mova os socos ao longo dos x e y eixos usando os botões de ajuste XY. O botão de ajuste direita move os socos ao longo do eixo-x e o botão de ajuste esquerdo move os socos ao longo do eixo y. Existe uma leitura digital na micrómetro botões tanto de ajustamento. Estes são ativados quando se deslocam os botões. </li><li> Redefinir → pressione o botão ZERO / ABS. Mudança entre polegadas e mm → pressione o botão IN / mm. O espaço entre os furos deve ser de 2,0 mm (medido entre os centros dos furos) quando se utiliza um perfurador 1 mm para um modelo de 9x8. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Para garantir que não empurrar o soco demasiado baixo para dentro do bloco, atingindo a cassete e destruir o soco, colocar uma cassete sem parafina no suporte e definir a posição inferior da punção receptora a 1 mm acima da parte inferior da cassete usando o parafuso batente de profundidade nacanto esquerdo superior da guia de Z-(Figura 3). </li><li> Colocar o bloco receptor no suporte e usar o menor chave de parafusos para fixar os parafusos. Não aperte os parafusos apertados ou a parafina pode libertar-se da cassete. </li><li> Empurrar o perfurador destinatário para baixo cerca de 5 mm para dentro do bloco receptor e usar o identificador no soco para girar o perfurador para trás e para a frente uma vez (Figura 3). O orifício será de 5 mm de profundidade ao empurrar o soco, tanto para baixo para dentro do bloco quanto possível. </li><li> Aliviar a pressão descendente empurrando lentamente, de modo que as molas podem mover o perfurador para cima. Use o estilete para esvaziar o soco e descartar o núcleo de parafina. </li></ol></li><li> Mover a torre para mudar para o dador perfurador (Figura 3). </li><li> Coloque a ponte bloco dador com o bloco dador sobre o suporte de bloco receptor (Figura 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Empurre a punção de doadoresh para a área seleccionada do bloco dador. Usar uma hematoxilina e eosina correspondente lâmina corada onde a região de interesse foi marcado para localizar o tecido que está a ser amostrado. Manualmente segurar o bloco de doadores na posição com a mão esquerda e empurre o soco com a mão direita. Note que você não deve empurrar o estilete. O limitador de profundidade não bloqueia o movimento perfurador na posição apropriada para o bloco dador, por isso, é importante que pára de empurrar quando a segunda marca é visível na estilete. </li><li> Rodar a pega do perfurador uma vez (Figura 3). Lentamente, liberte a pressão para baixo enquanto mantém o bloco de doadores na ponte bloco doador. </li><li> O tecido do dador é de preferência perfurado 0,5 milímetros mais curto do que o núcleo do destinatário. Este processo irá garantir um alinhamento ajustável dos núcleos na superfície bloco receptor, evitando a perda de tecido representativo valioso. </li></ol></li><li> Remover a ponte e do bloco dador. Fazercerteza de que o doador perfurador é alinhado com o furo que foi feita anteriormente (ponto 4). É necessário ajustar a posição de perfuração utilizando os parafusos de fixação se o perfurador dador e do orifício no bloco receptor não estão alinhados. </li><li> Cuidadosamente empurrar o perfurador para baixo até que a sua ponta atinge o topo do furo no bloco receptor. Mantendo esta posição, usar o estilete para esvaziar o núcleo tecido dentro do buraco. A superfície do núcleo deve estar em alinhamento com a superfície do bloco. </li><li> Mova o revólver de volta para o soco destinatário. </li><li> Mova para a posição seguinte com os botões de ajuste XY. </li><li> Repita a partir do ponto 4c acima até que a matriz está completa. </li><li> Quando o bloco receptor inteiro tenha terminado, desapertar os parafusos no suporte do bloco receptor. Coza no bloco em 42 ° C durante 40 minutos. Colocar o bloco com a área de corte voltado para baixo sobre uma lâmina de vidro. Coloque a lâmina de vidro com o bloco no topo de um suporte de tubos de ensaio (ou a construção apropriada outro) e colocar em tele forno. Após o cozimento, remover o suporte do tubo de ensaio do forno e achatar a superfície do bloco suavemente alisando a lâmina de vidro. </li><li> Colocar o bloco com a lâmina de vidro sobre uma placa de arrefecimento durante 10 minutos. Para garantir tecido representativo em todo o TMA um controle de qualidade em cada seção 50 º é realizada. </li></ol> 3. Como TMAs Seção (Animação 2) <ol><li> Corte 4 mm de espessura usando um micrótomo com sistema de transferência de seção (HM 355S, Microm). O sistema pode ser usado com todos os actuais micrótomos rotativos. O sistema é composto por um transportador de lâmina com ponte de transferência integrado, um banho de água aquecida e uma unidade de controlo. A partir da lâmina as secções deslizar sobre a superfície de transferência de molhada através de uma ponte de transferência para o banho de água. </li><li> As secções devem ser tomadas a partir do banho de água imediatamente depois de terem esticados para fora, para evitar a fusão das manchas de tecidos sensíveis (ex. tecidos lipídicos ricos como da mama e do cérebro). Place a seção sobre uma lâmina de vidro SuperFrost. O tempo das secções pode ser deixado na água depende do tipo de parafina encerado utilizado e da temperatura da água. O nosso laboratório cera de parafina utilização a partir de HistoLab Products AB, que têm um ponto de fusão de 56-58 ° C e recomendamos uma temperatura de banho de água de 37-39 ° C. </li><li> Colocar as lâminas no porta-lâminas para a secagem à temperatura ambiente (RT) durante a noite. </li><li> As lâminas são cozidos em 50 ° C durante 12-24 horas. Usando um microtom sem STS que tem de transportar a secção da lâmina para um banho de água manualmente utilizando, por exemplo uma escova. </li></ol> 4. Teste e procedimento de titulação de imuno-histoquímica (Animação 3) Cada anticorpo é submetido a um procedimento de ensaio normalizado utilizando especialmente concebidos TMAs contendo uma mistura de tecidos e tipos de células diferentes. O objetivo é avaliar um protocolo de imunomarcação individual e otimizada para cada anticorpo. Inicialmente diluição um, com base em formigaiBODY concentração estoque do anticorpo primário é testada. O resultado deste teste de coloração é usado para guiar as diluições posteriores e optimização do protocolo. <ol><li> Desparafinização e hidratação em etanol xileno e graduada para a água destilada são realizadas antes da imunocoloração. </li><li> Um passo de bloqueio para extinguir a peroxidase endógena é realizada em 0,3% de H2O 2 em etanol a 95% durante 5 minutos. </li><li> Induzido pelo calor Epitope Recuperação (HIER) é realizada de um tampão de recuperação 6 pH, utilizando uma caldeira de pressão (câmara de Decloaking, Biocare Médico) como fonte de calor durante 4 minutos a 125 ° C. Depois de completada a ferver, as lâminas permanecem na caldeira de pressão e são deixados arrefecer até 90 ° C. O tempo total de processamento para HIER é de aproximadamente 45 minutos. </li><li> Se nenhum resultado conclusivo é obtido no teste inicial, outros testes são feitos com base no padrão de coloração observada 5 6. Um estudo piloto, dentro do HPA de alto rendimento set-up, mostrouque a recuperação de antigénio mais útil onde HIER pH 6, mas outros métodos de recuperação, tais como pré-incubação com microondas proteinase, e destila em tampão com pH mais alto ou mais baixo pode, evidentemente, ser usado. Ao alterar a condição de IHC por exemplo, tempos de mudança de anticorpos de incubação, diluições e tempos de diaminobenzidina (DAB) de incubação do padrão de coloração pode dar resultados mais conclusivos. </li></ol> 5. Programa de coloração, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Todas as incubações são realizadas à temperatura ambiente e este protocolo pode também ser utilizado como um instalação manual com os mesmos reagentes. <ol><li> Lavar em tampão de lavagem. </li><li> A incubação com o bloco V Ultra durante 5 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem. </li><li> A incubação com anticorpo primário durante 30 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem (x2). </li><li> A incubação com peroxidase de rábano rotulado polímero durante 30 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem (x2). </li><li> Desenvolver em solução DABdurante 10 minutos. </li><li> Lavar em tampão de lavagem (x2). </li><li> Contracoloração em hematoxilina Mayers para 5 * minutos. Quando se utiliza um método de coloração progressiva (por exemplo Mayers hematoxilina) a intensidade depende do tempo e não é necessária a diferenciação. Um método de coloração regressiva por exemplo hematoxilina de Harris requer diferenciação para remover o excesso de corante dos tecidos, a fim de acentuar uma estrutura. </li><li> Enxágüe com água da torneira *. </li><li> Enxaguar em água de carbonato de lítio, diluído 1:5 a partir de uma solução saturada de 1 minuto *. </li><li> Enxágüe em água corrente por 5 minutos *. </li><li> As lâminas são desidratadas em etanol graduado e slides são as lamínulas (PERTEX, Histolab) </li></ol> Todos os reagentes são aplicados a um volume de 300 uL por lâmina. * Os Passos 10-14 são feitas em um instrumento histostaining (Autostainer XL, Leica) e lamínulas é adicionalmente feito em um sistema coverslipper (coverslipper vidro automatizada CV5030, Leica). 6. Como digitalizarum slide O método de lâminas de digitalização é dependente do scanner digital a ser utilizada, este protocolo apenas define como digitalizar uma lâmina utilizando o sistema de digitalização automatizada Aperio XT (Aperio Technologies). Na proteína Atlas Humano set-up ampliação de 20x para o tecido e 40x para as células são usadas. Digitalização automatizados poderiam encontrar problemas de focagem, devido à heterogeneidade do tecido e do número de diferentes tecidos e incluídos num TMA. <ol><li> Limpe a lâmina de vidro de cola, sujeira e verificar se há bolhas de ar entre as lamelas e da seção. Em caso de bolhas de ar remontar o slide. </li><li> Coloque o slide em um rack e colocar o suporte no scanner digital. O tempo de varredura de uma TMA com ampliação de 20x é de aproximadamente 6 minutos. Um software de Aperio é usado para selecionar área de interesse. Seleção de ponto de foco é feito automaticamente dentro do software. Manualmente seleção de área de digitalização e pontos de foco também é possível. </li><li> Após a imagem hcomo foi gerado pode ser usado para a avaliação e anotação da coloração IHC. As imagens permanecem como um arquivo de resultado da experiência e pode ser distribuído aos colegas para o debate, ainda utilizado para publicação dos dados. As imagens podem ser visualizadas em um software disponível gratuitamente Aperio. </li></ol> 7. Como procurar sua proteína favorita no Atlas proteína humana <ol><li> Navegue até <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Digite o nome de sua proteína favorita, Ensembl ID, número de acesso UniProt ou insulina por exemplo HGNC nome. </li><li> Entre na página de resumo e desloque-se para o tecido normal e resumo do órgão. A visão geral mostra a expressão da proteína no pâncreas. </li><li> Clique em &quot;mais dados de tecidos&quot;. Você entra nos tecidos normais ver onde você pode ver todos os tecidos incluídos ordenadas por órgão. </li><li> Clique no pâncreas para ver os resultados da IHQ para 3 anticorpos dirigidos para a mesma proteína. Para visualizar um oigh-resolução de imagem de pâncreas clique na imagem. </li><li> Mais informações sobre a expressão da proteína no tecido de câncer, as células e validação de dados complementares no Atlas Proteína humana pode ser encontrada pela procura da proteína humana website Atlas. </li></ol> 8. Os resultados representativos Animação 1. Como preparar os tecidos para a produção de tissue microarray. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Clique aqui para ver uma animação</a> . Animação 2. Como TMAs seção. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Clique aqui para ver a animação 2</a> . 3 Animação. A técnica de imuno-histoquímica é descrito. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Clique aqui para ver a animação 3</a> .<img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema geral do processo dentro da Human Protein Atlas Uppsala. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figura estilete Doador 2. Marcado para o comprimento normalizado de núcleos de tecidos, por exemplo, 4,5 mm. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figura 3. Microarrayer tecido Manual. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de qualidade diferente de TMAs produzidos. (A) Um. Recta e devidamente alinhados TMA com espaço suficiente entre as linhas e colunas, bem como para a borda da parafina (B) Um TMA com alguns dos núcleos demasiado perto da borda resultando em prováveis ​​dificuldades quando seccionamento. (C) Um TMA que tenham sido cozido para too tempo, resultando em uma TMA colapso sem o modelo correto. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figura 5. Hematoxilina e eosina TMAs. (A) Uma secção adequadamente cortadas com colunas rectas e alinhados e linhas. Usando uma lâmina mau ou suja pode resultar em divisão (B) ou secções comprimido (C). <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figura 6. Titulação de anticorpos. (A) Reação células center em linfonodo mostra um anticorpo ideal titulada resultando em uma coloração específica citoplasmática (mostrado em castanho) sem fundo. (B) A secção de tecido mostra coloração fraca. Coloração negativa ou fraco é encontrado quando a concentração de anticorpo primário é demasiado baixa, ou se a proteína alvo não está presente nos tecidos imunocoradas. (C) A secção de tecido é overstained devido ao uso de concentração demasiado elevada do anticorpo primário. A dresultados de cores arca em dificuldades que determinam a localização subcelular devido a transbordar, reatividade cruzada e falsa positividade.

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Não temos nada a divulgar.

A imunohistoquímica é de longe a aplicação mais comumente usado para TMAs. A combinação de IHC e TMAs pode ser usado em várias configurações diferentes, o rastreio de alto rendimento, por exemplo de padrões de proteínas de expressão em tecidos 7 8 9 10 e células, estudos de descoberta de biomarcadores com base em amostras de tecido de coortes grandes 11 12 e mais biologia tumor básica estudos, incluindo diferentes fenótipos / genótipos, os estágios de diferenciação, progressão e metástase 13. Uma vantagem de usar TMAs é que o material a partir de grandes grupos podem ser analisadas de uma só vez, ambas as experiências de poupança de material biológico valioso e assegurando mais reprodutíveis. Além disso, a utilização de TMA tecnologia reduz os custos dos reagentes e tempo de processamento de laboratório. Como um TMA contém apenas uma quantidade limitada de tecido, a heterogeneidade dos tecidos é um problema. Dependendo do tipo de tecido e questões a serem tratadas, várias amostras podem ser necessários a partir do mesmo specimen. Para tecidos tumorais, a utilização de dois a quatro núcleos a partir de cada amostra é recomendada como foi mostrado para resultar em um alto grau de precisão na representação de secções de tecido inteiras 13 14. Dependendo da composição do tecido do diâmetro dos punções (variando de 0,6 mm a 2 mm) pode ser ajustada. Os tecidos são complexos e composto de ambos os vários tipos de células diferentes, estruturas e de matriz extra-celular. A composição de cada tipo de tecido diferente contendo quantidade variável de gordura, os vasos sanguíneos, tecido conjuntivo, cartilagem etc, vai afetar a pressão necessária para perfurar e coleta de núcleos separados. É, portanto, de importância para a prática de todas as etapas do procedimento em material que não é de qualquer valor, antes de produzir uma TMA com tecidos definidos para os experimentos pretendidos. Quando a secção de uma variedade de diferentes tecidos dentro de um bloco de TMA a composição do bloco poderia influenciar a capacidade de adquirir secções de alta qualidade. Cetecidos rtain, por exemplo, pele, medula óssea, do cérebro, gordura e da mama, tornar o seccionamento do bloco de TMA difícil devido ao efeito das diferenças de textura que efectuam como secções esticar no banho de água e como dureza diferente é cortado pela lâmina etc Portanto, é recomendável para os tecidos do grupo com características semelhantes, por exemplo, tecido adiposo rico em uma TMA, quando aplicável. A maioria dos tecidos de cancro são, neste sentido, homogénea, o que facilita o corte de TMAs cancerosas. Um método alternativo para a estabilização de seccionamento dos núcleos microarray pode ser empregue quando manusear uma TMA com tipos heterogéneos de tecidos. A utilização de uma fita adesiva pode ser útil para evitar a perda de núcleos e cair para fora na TMA-seccionado. A utilização de fita adesiva deve ser empregada com cautela, dado que a fita pode influenciar a espessura de núcleos, seccionados e, posteriormente, também o resultado de IHC coloração 15. No Human Protein Atlas set-up modelo de uma TMA de 9x8 (excluindo marcadores) núcleos de are utilizado. É de importância para se obter o número máximo de secções e manter todos os tecidos representados em todo o bloco. Para poupar reagentes e do tempo de digitalização, 2 secções são colocadas sobre uma lâmina de vidro, permitindo um modelo máximo de 9x8. O maior repositório de informações de proteína, 16 Universal Resource Protein inclui aproximadamente 20,300 analisadas entradas de proteínas humanas, das quais apenas aproximadamente 66% têm evidência ao nível das proteínas. Também para a maioria dos genes para os quais há evidência da existência sobre o nível de proteína, existe pouca ou nenhuma informação sobre a função da proteína e da distribuição de expressão. Um desafio importante para o futuro é analisar o padrão de distribuição e abundância relativa destas proteínas desconhecidas em vários tipos de tecido humano. A informação a partir de bases de dados tais como UniProt, Ensembl, os dados publicados de PubMed pode ser utilizado como um guia para determinar se os padrões de coloração imuno-histoquímica utilizando anticorpos paraenfermarias proteínas desconhecidas representam perfis de proteínas reais da proteína alvo pretendido. Além disso, várias estratégias de validação outros são necessários para garantir a funcionalidade de anticorpos, por exemplo, a funcionalidade de anticorpos em matrizes de proteína, Western blot, imunofluorescência, imuno-precipitação e pull-down experimentos. Talvez o mais importante ferramenta para a validação da funcionalidade do anticorpo é a utilização de anticorpos emparelhados, isto é, dois anticorpos diferentes criado contra separados, não sobrepostos epítopos na proteína alvo mesmo, para comparar-ensaio específico resultado 17. Com base na informação recolhida, os anticorpos são testadas e ajustadas de acordo com padrões de IHC e da experiência de testar e validar mais de 35.000 anticorpos no projeto Human Protein Atlas. Durante mais de 20% de todos os genes com perfis de proteínas, os dados de anticorpos emparelhados (2 ou mais anticorpos em relação de não sobreposição epítopos sobre a mesma proteína) tem sido usado para determinar uma melhor estimativacompanheiro do padrão correspondente expressão da proteína. Anticorpos emparelhados proporcionar uma estratégia final para a validação específicas imunohistoquímica baseados padrões de expressão de proteínas. Esta estratégia é valiosa porque a multidão de diferentes tecidos incluídos na seleção de base aumenta o risco de reatividade cruzada. Deve também ser notado que certos tecidos são em geral mais propenso a mostrar fundo coloração macrófagos por exemplo, músculo liso, túbulos distais no rim e hepatócitos no fígado. Outras questões a considerar incluem variações de técnicas de processamento de tecidos ao longo do tempo para os tecidos retirados de material de arquivo, que pode resultar em falsos negativos ou positivos inadequado padrões de coloração IHQ. Este fenômeno também é encontrado na análise de grande parte. Controles negativos e positivos são vitais e devem ser usados ​​sempre que possível. Para estudos mais aprofundados, incluindo análises funcionais, linhas de células com expressão forçada e específica knock-down de tr correspondentesanscripts (tecnologia siRNA) pode ser usado para criar controles. Para melhores resultados em IHC, é importante para testar e utilizar sistemas de recuperação de antigénio, uma vez que a fixação de formalina induz modificações químicas diferentes, por exemplo, de ligação cruzada, a hidrólise de bases de Schiff de mascaramento do antigénio 18. Em conclusão, baseados em anticorpos proteômica empregando tecnologia e TMA IHC é uma estratégia eficaz para gerar dados de expressão de proteínas em grande escala. The Human Protein Atlas projeto foi criado para criar um mapa de expressão da proteína humana em tecidos humanos normais e cancerosas. O objetivo deste projeto é apresentar um primeiro esboço de um Atlas Proteína abrangente Humano até 2015. Além de fornecer perfis de proteína em órgãos e tecidos normais, esse esforço também fornece um ponto de partida para projectos de investigação biomédica, incluindo esforços de descoberta de biomarcadores clínicos. O objetivo final é adicionar uma camada de informação seguinte no topo da seqüência do genoma humano que wivai ser crucial para uma compreensão mais profunda da biologia subjacente a vários estados de doença, e fornecer uma base para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico e terapêutica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> O tampão de lavagem </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Tampão citrato pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Diluente anticorpo </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision LP HRP polímero </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB sistema de substrato mais </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Bloco </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Anticorpo primário-Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hematoxilina </td><td> Histológicoab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Manual de tecido micro arrayer </td><td> Estigen, Instrumento Beecher </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Cachoeira micrótomo </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Scanner de imagem automatizado </td><td> Aperio Technologies </td><td> XT </td></tr><tr><td> Sistema de coloração automática corrediça </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> Sistema automático de imunoistoquímica slide para desparafinização e desidratação </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Coverslipper vidro automatizada </td><td> Leica Biosfo r </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Câmara Decloaking </td><td> Biocare Medical </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

O tecido microarray tecnologia (TMA) fornece os meios para alto rendimento análise de múltiplos tecidos e células. A técnica é utilizada dentro do projecto da proteína humana Atlas para análise global de padrões de proteínas de expressão em tecidos humanos normais, o cancro e linhas celulares. Aqui apresentamos a montagem de núcleos de 1 mm, recuperados de tecidos representativos microscopicamente selecionados, em um único bloco receptor TMA. O número e tamanho dos núcleos em um bloco de TMA pode ser variado de aproximadamente 40 mm 2 núcleos para centenas de 0,6 mm núcleos. A vantagem de usar TMA tecnologia é que grande quantidade de dados pode rapidamente ser obtido usando um protocolo de imunocoloração único para evitar a variabilidade experimental. Importante, apenas a quantidade limitada de tecido de escassos, é necessário, o que permite a análise de coortes de pacientes grandes 1 2. Aproximadamente 250 secções consecutivas (4 mm de espessura) pode ser cortado a partir de um bloco de TMA e utilizado para imuno-histoquímica staining para determinar os padrões de expressão específicos de proteína por 250 anticorpos diferentes. No ser humano projecto Proteína Atlas, os anticorpos são gerados para todas as proteínas humanas e usada para adquirir perfis de proteínas correspondentes em ambos os tecidos humanos normais a partir de 144 indivíduos e tecidos cancerosas de 216 pacientes diferentes, que representam as 20 formas mais comuns de cancro humano. Seções imunohistoquímica, TMA em lâminas de vidro são digitalizados para criar imagens de alta resolução a partir do qual podem interpretar os patologistas e anotar o resultado da imuno-histoquímica. Imagens juntamente com os correspondentes dados baseados em patologia de anotação são feitas publicamente disponível para a comunidade de pesquisa através da Human Protein Atlas portal ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figura 1) 3 4. O Atlas proteína humana fornece um mapa mostrando a distribuição e abundância relativa das proteínas no corpo humano. A versão atualSion contém mais de 11 milhões de imagens com dados de proteínas de expressão para 12.238 proteínas únicas, correspondentes a mais de 61% de todas as proteínas codificadas pelo genoma humano.

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Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Tissue microarrays permite a um método eficiente para obter informações simultâneas a partir de uma infinidade de tecidos. Partes representativas de tecidos são montados em um único bloco de parafina. Secções do bloco são utilizados para imuno-histoquímica e análise dos padrões de expressão da proteína. Escaneamento digital gera imagens correspondentes para distribuição de dados.

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

55.8K visualizações.  Uppsala University. Tissue microarrays permite a um método eficiente para obter informações simultâneas a partir de uma infinidade de tecidos. Partes representativas de tecidos são montados em um único bloco de parafina. Secções do bloco são utilizados para imuno-histoquímica e análise dos padrões de expressão da proteína. Escaneamento digital gera imagens correspondentes para distribuição de dados.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...