המחברים מודים מדעי החיים פריימן מרכז מרכז צוות מחקר דג הזברה לטיפול שלהם ותחזוקה של דג הזברה.

1. Resuspend morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 300 ננומטר של fluorescein-מתויג morpholino אל μl 100 מים nuclease ללא להפוך את פתרון 3 מ&quot;מ בערך. הפתרון הוא morpholino aliquoted אל פרפין חתום צינורות מרובים microcentrifuge ומאוחסנים בטמפרטורת החדר, הרחק מן האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את הריכוז המדויק morpholino, לדלל 5 μl של פתרון morpholino (או מים ריק) ב 95 μl של 0.1 N HCl. הגדרת הבסיס על ספקטרופוטומטר ב 265 ננומטר עם ריק מים ולאחר מכן לקבוע את קריאת פתרון morpholino בדילול מלא. להכפיל את ספיגת morpholino ידי קבוע שנקבע שלה על ידי גורם דילול כדי לקבוע את ריכוז ng / μl. קבוע morpholino מחושב: Morpholino קבוע = משקל מולקולרי של ספיגת X 1000/molar morpholino. משקל מולקולרי ספיגת טוחנת על morpholino ניתן למצוא באתר &quot;Oligo מאפיינים &quot;גיליון מסופק עם המוצר. מחלקים את ריכוז morpholino, ב ng / μl, לפי משקל מולקולרי כדי לקבוע את הריכוז מ&quot;מ. מדולל morpholino, במידת הצורך, כדי ריכוז בעבודה מ&quot;מ, 1.2 בדרך כלל. </li></ol> 2. סנפיר קטיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים דג הזברה הבוגרת או Tricaine או 2-phenoxyethanol על 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מים במיכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות סנפיר באמצעות סכין גילוח או אזמל סטרילי הפרוקסימלי עד 1 הסתעפות lepidotrichial. זה צריך להיעשות במקום הפרוקסימלי / דיסטלי אותו על כל חיה (למשל 7 קטעים הגרומות דיסטלי מן המחוך סנפיר). חשוב: לוודא לחתוך לחלוטין בניצב למישור הקדמי / האחורי של החיה. קיצוצים זווית תגרום תוצאה סנפיר אחיד של חצאי הגב ואת הגחון של סנפיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הדגים לאקווריום. אנחנו בדרך כלל לשמור את הדגים על 33 ° C כדי להגביר את קצב התחדשות. בהתאם לעיצוב ניסיוני, WAIT 0-2 ימים שלאחר קטיעה (DPA) עבור התחדשות סנפיר להתחיל לפני מציגה morpholino. גישות חלופיות נדונים הדיון, להלן. </li></ol> 3. Morpholino Injection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הזרקת morpholino, להפוך את הצלחת ההזרקה (איור 2). הקפד לחתוך חריץ בקצה אחד של טוב, שעוזר לייצב את הדגים עבור ההליך microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 2 DPA, להכין את מערך מיקרו הזרקה פתרון morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את morpholino fluorescein-מתויג לריכוז הנכון (ממליץ להתחיל עם 1.2 מ&quot;מ) ומניחים באמבט מים C ° 65, במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המחט זכוכית הזרקת מיקרו באמצעות מחט חולץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מחט עם morpholino (הערה: תלוי אם אתה גב מילוי או הקדמי לטעון המחט שלך תקבע אם אתה טוען המחט הראשונה, או לחתוך את קצה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קצה המחט בn זווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות של המערכת מיקרו הזרקה להזריק בועה כ 5 NL של morpholino לכל זריקה. כמויות גדולות יותר של morpholino יכול לשבש את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הדג ומניחים על צלחת ההזרקה. הסר את כל נוזל עודף לכוון את המחט למקום המתאים, דיסטלי רק כדי ray הגרמית (איור 3). באמצעות מיקרוסקופ ומכשירים microinjection מתאים morpholino זריקות (ר &#39;טבלה של חומרים כימיים מסוימים), להזריק לתוך morpholino סנפיר מן הקדמי אל האחורי, כפי שמוצג באיור 3. הזרקת מ האחורי אל הקדמי גורם רקמות סנפיר להפשיל במהלך ההזרקה הוא קשה מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט בעדינות לתוך רקמת רגנרטיבית, דיסטלי רק כדי ray כל גרמי (מסומן &quot;1&quot; באיור 3) ולדחוף distally עד הממוקם blastema (מסומן &quot;2&quot; באיור 3). להיזהר לא לדחוף את המחט דרך enסנפיר הצמיג. כאשר מחט מותאמת בצורה נכונה, להזריק morpholino (כלומר ללחוץ פעם אחת). ב 1.2 מ&quot;מ, הפתרון fluorescein-מתויג morpholino נראה צהוב, ירוק, גם בתנאי תאורה רגילים. עם כל הזרקה, &quot;עלים&quot; הצהוב של פתרון morpholino ניתן דמיינו, אשר מסייע לתהליך הלוקליזציה של זריקה כדי blastema. כ 75 NL (10-15 קליקים) של פתרון morpholino צריך להיות מוזרק לכל קרן גרמי. השהה ~ 1 שניות בין קליקים. אנחנו רק להזריק בצד הגב, באמצעות הגחון כביקורת electroporation בלבד. לחלופין, אפשר לחזור על התהליך כולו באמצעות morpholino שליטה על מחצית הגחון של סנפיר. </li></ol> 4. Electroporation של morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הזרקת morpholino, להסיר את הצלחת של מנגנון הזרקת מיקרו הזרקה. מלאו את הצלחת הזרקת היטב עם פתרון הרדמה עד דגים הוא מתחת למים. Electroporation מבוצע מתחת לקו המים. </li> &lt;li&gt; פלטינה 3 מ&quot;מ קוטר צלחת פינצטה האלקטרודה (CUY 650-P3 מלקטת, Protech הבינלאומי) localizes להבזקי למחצית בקירוב של סנפיר. היזהר שלא לגעת אלקטרודות לרקמות סנפיר. על מנת להבטיח כי האלקטרודות לא נוגעים רקמות סנפיר, לסובב את הדג על הצד הגבי שלה להישיר מבט אל קו האמצע של electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate הן את הגב ואת הגחון (כדי לשלוט על כמה תופעות לא ספציפיות electroporation) הצדדים של סנפיר באמצעות CUY21 כיכר גל Electroporator (Protech International, Inc). נגבו את האלקטרודות עם KimWipe לחה לאחר כל electroporation להסיר בועות שעלולות יצרו. אם הם לא יוסרו, מיני תשלום מצטבר, אשר ימשוך את הרקמות אל האלקטרודה. הפרמטרים electroporation יש להגדיר 10 ברציפות 50 msec קטניות, ב V עם 15 שניות הפסקה 1 בין הפולסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגים על השקופית כוס או צלחת פטרי ובמהירות התמונה סנפיר, והקפד nOTE אוריינטציה הגב / הגחון. תמונה זו תשמש לצורך ניתוח לצמיחה מחודשת למחרת. להחזיר את הדגים לאקווריום. </li></ol> 5. אנליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חלבון ממוקד אשר הפילו בביטוי נדרש התחדשות סנפיר נכון, הבדל דרמטי בין חצאי הגב ועל הגחון של סנפיר צריך להיות ברור 1 ביום שלאחר electroporation (5 ב איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 3 DPA, לצלם תמונה נוספת של סנפיר דג זה ולהתאים את התמונה עם תמונה 2 המקביל DPA (5 ב איור). וריאציה טבעית במרקם סנפיר פיגמנטציה בין בעלי חיים יאפשר לך לזהות נכון דגים הפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תמונה NIH, להתחקות אחר 2 תחומים DPA DPA ו 3 של שני חצאים הגב ועל הגחון (איור 5 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את תחום השימוש הגבי% לעומת הגחון את הנוסחה הבאה: (הגב 3dpa - הגב 2dpa) / (הגחון 3dpa -<html> 2dpa הגחון) X 100% = שטח </li></ol> 6. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו תמיד assay עבור תוצאה סנפיר על hpe 3 DPA, או 24 (שעות electroporation הודעה). בשלב זה, fluorescein-מתויג morpholino צריך להיות נוכח 1/2 של סנפיר הגב (איור 1, איור משלים 6 א). זה נורמלי לראות כמה נגרר לרמה של קטיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא צריך להיות שום הבדל בין הצדדים ואת הגב סנפיר הגחון ב הזריק electroporated עם morpholinos הביקורת (איור 6 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם morpholino ניסיוני מטרות חלבון חיוני תוצאה סנפיר, ההבדל הדרמטי בין הצדדים ואת הגב הגחון יש לשים לב (איור 6C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם האלקטרודה נגע סנפיר במהלך electroporation, רקמות יופיע חום (כמעט שרוף בהופעה) ו נמקי. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. סכמטי של האירועים השונים המתרחשים במהלך התחדשות סנפיר. פעמים את הבסיס עבור כל אירוע ניתנות שעות לאחר קטיעה (hPa), ומתאימים הטמפרטורה במיכל של 33 ° C. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> איור 2. א סכמטי של הצלחת ההזרקה, אשר עשוי agarose ומכיל קטן גם להחזיק את הדגים במהלך microinjection של morpholino. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> איור 3. סכמטי של microinjection morpholino. מקום א &#39;הדג בצלחת עם ראש של דג ב החריץ בנוי היטב, אשר יסייעו דגים להישאר יציב. ב בהגדלה נמוכה, לארגן את המחט כך היא קרובה רקמות התחדשות של סנפיר. ג </stro&gt; ng בהגדלה גבוהה יותר, להזריק morpholino דיסטלי לקרן כל סנפיר גרמית (כלומר בכל blastema). המחט צריכה להזין את רקמת דיסטלי רק כדי ray הגרמית (1), ולאחר מכן להמשיך אל המיקום של blastema (2). הערה: את העיגולים ירוקים סכמטי נועדו רק כדי להראות את מיקום ההזרקה. Morpholino יכול בקצרה דמיינו כמו &quot;עלים&quot; ירוק / צהוב לאחר כל הזרקה, אך זה לא מתעקש כפי שמוצג סכמטית. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> איור 4. סכמטי של electroporation סנפיר. א &#39;בעקבות microinjection, הצב את הדג בצלחת פטרי מלא הרדמה electroporate שני חצאים הגב ועל הגחון. ב הקפד שלא לגעת רקמות סנפיר. האלקטרודות צריך להיות ממוקם ~ 1 מ&quot;מ מרקמות. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; איור 5. סכמטי של האמצעים שננקטו כדי לחשב תוצאה עיכוב סנפיר. א &#39;קח תמונה של סנפיר דג אחד ב 2 DPA זריקה, morpholino או מיד לפני או אחרי ו electroporation. עקוב אחר רקמות רגנרטיבית של הגב הן (ירוק) ועל הגחון (כחול) חצאי הסנפיר באמצעות תמונה NIH, (קווים מקווקווים שחורים). ב &#39;בשעה 3 DPA, לצלם תמונה נוספת של סנפיר כל פעם לאתר את אזורי הגב ועל הגחון של לצמיחה מחודשת באמצעות תמונה NIH. ג להפחית את שטח של לצמיחה מחודשת על 2 מ DPA לצמיחה מחודשת על סך 3 DPA הן שיהיו ברשותך את הגב ואת הגחון. אזור אחוזים לעומת הגב הגחון מחדש את הצמיחה ניתן לחשב באמצעות הנוסחה: ((D 3dpa - ד 2 DPA) / (V 3dpa - V 2dpa)) X 100. אחוז עיכוב = 100 - שטח אחוז. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> איור 6. דוגמאות צפויתוצאות. תמונה א פלורסנט מראה fluorescein-מתויג השליטה morpholino במחצית הגב של סנפיר, 24 שעות לאחר electroporation (hpe). ב brightfield דמותו של סנפיר אשר הזריק electroporated עם morpholino השליטה במחצית הגב . התמונה מראה צמיחה מחדש שווה של שני חצאים הגב ועל הגחון של סנפיר, 24 hpe. ג תמונה brightfield של סנפיר אשר הזריק electroporated עם morpholino ניסיוני במחצית הגב. התמונה מראה עיכוב לצמיחה מחודשת בצד הגב / מוזרק. הקו מציג את כמות לצמיחה מחודשת על 2 DPA, מיד לפני ההזרקה morpholino ו electroporation. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> איור 7. סכמטי של הזרקה חלופי הליך electroporation לחלבונים היעד מעורב ריפוי הפצע והיווצרות blastema. א להזריק את morpholinoבין קרני סנפיר כל גרמי על 1/2 של סנפיר הגב. ב Electroporate morpholino לפי נורמלי. ג לקטוע את סנפיר בקרבה מיידית (~ 1 קטע גרמי) כדי הזריקה. ד fluorescein-מתויג morpholino ניתן לצפות ב האפיתל הפצע blastema ב hpe 24. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> איור 8. שימוש בטכניקה זו כדי למקד האפיתל הפצע והיווצרות blastema. א תמונה brightfield של סנפיר על 24 hPa אשר הזריק electroporated עם morpholino הבקרה מיד לפני קטיעה. תמונה ב הניאון של סנפיר שמוצג הערה א &#39;לוח כי 1/2 הגב מוזרק של סנפיר מראה ספיגת טוב morpholino ברקמות רגנרטיבית. C -. C &quot;הגדלה גבוהה של 1/2 של סנפיר הגב שמוצג לוחות A ו-B המוזרקים הם בדרך כלל גלויים עדיין (ראשי חץ), אבל התאים הממוקדים רבים היגרו להשתתף האפיתל הפצע והיווצרות blastema (החץ). <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> איור 9. שימוש בטכניקה זו כדי למקד את התאים הנודדים לטופס. Blastema א פלורסנט ותמונות brightfield הבלעה מראה סנפיר הזריק electroporated עם morpholino משני חצאים את הגב ואת הגחון. סנפיר נקטעה אז בשני מישורים. 1/2 הגב נחתך דיסטלי מיד את המוזרקים, שם כמו 1/2 הגחון נחתך 9-10 חלקים הגרומות דיסטלי לאתרים הזרקה. ב &#39;בשעה 24 hPa, התמונות הבלעה הניאון brightfield מראים כי morpholino העביר את הגב להתחדש (1), אך לא מתחדשים הגחון (2), המציין כי רק תא בקרבה מיידית לאתר את החתך להשתתף היווצרות blastema. שני סטים של ראשי חצים לבנים להראות את הרמה של כל קטיעההמטוס. לוחות מסומנים 1 ו 2 בקצה הימני של התמונה מראה נוף בהגדלה גבוהה יותר של חצאי הגב ועל הגחון של סנפיר, בהתאמה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">משלימה איור 1.</a> וידאו של מחסנית-Z confocal האזור המתאים למיקום של blastema ב סנפיר הזריק electroporated עם morpholino שליטה. התמונה צולמה ב hpe 24. מאז מולקולה fluorescein אחד לא יכול להיות חזותי, לא כל morpholino ניתן דמיינו או לכמת. עם זאת, התמונות האלה נותנים מושג כלשהו על דרגות שונות של ספיגת שניתן דמיינו בתאים, מן נקודות punctate בודדים, לתאי שלמים מלאים morpholino ניאון. על התמונה עדיין, כיוון מוצג. סרגל קנה מידה: 25 מיקרון.

<ol>
	<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 377, 577-595 (1997).</li><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+guidance+of+regenerating+optic+axons+by+chondroitin+sulfate+glycosaminoglycans+in+zebrafish.">Repellent guidance of regenerating optic axons by chondroitin sulfate glycosaminoglycans in zebrafish.</a> J. Neurosci. 22, 842-853 (2002).</li><li>Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+mechanism+underlies+the+planar+polarization+of+regenerating+sensory+hair+cells.">A two-step mechanism underlies the planar polarization of regenerating sensory hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 18615-1820 (2006).</li><li>Johnson, S. L., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutations+that+cause+stage-specific+defects+in+Zebrafish+fin+regeneration.">Temperature-sensitive mutations that cause stage-specific defects in Zebrafish fin regeneration.</a> Genetics. 141, 1583-1595 (1995).</li><li>Nechiporuk, A., Poss, K. D., Johnson, S. L., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+a+temperature-sensitive+mutant+emmental+reveals+a+role+for+sly1+during+cell+proliferation+in+zebrafish+fin+regeneration.">Positional cloning of a temperature-sensitive mutant emmental reveals a role for sly1 during cell proliferation in zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 258, 291-306 (2003).</li><li>Tu, S., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+in+the+growing+and+regenerating+zebrafish+fin.">Fate restriction in the growing and regenerating zebrafish fin.</a> Dev. Cell. 20, 725-732 (2011).</li><li>Geraudie, J., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+RA-induced+apoptosis+and+patterning+defects+in+regenerating+fins+and+limbs.">Correlation between RA-induced apoptosis and patterning defects in regenerating fins and limbs.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 529-532 (1997).</li><li>Jazwinska, A., Badakov, R., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin-betaA+signaling+is+required+for+zebrafish+fin+regeneration.">Activin-betaA signaling is required for zebrafish fin regeneration.</a> Curr. Biol. 17, 1390-1395 (2007).</li><li>Laforest, L., Brown, C. W., Poleo, G., Geraudie, J., Tada, M., Ekker, M., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+sonic+hedgehog,+patched+1+and+bmp2+genes+in+patterning+of+the+zebrafish+dermal+fin+rays.">Involvement of the sonic hedgehog, patched 1 and bmp2 genes in patterning of the zebrafish dermal fin rays.</a> Development. 125, 4175-4178 (1998).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Poss, K. D., Shen, J., Nechiporuk, A., McMahon, G., Thisse, B., Thisse, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+Fgf+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration.">Roles for Fgf signaling during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 222, 347-358 (2000).</li><li>Raya, A., Koth, C. M., Buscher, D., Kawakami, Y., Itoh, T., Raya, R. M., Sternik, G., Tsai, H. J., Rodriguez-Esteban, C., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch+signaling+pathway+precedes+heart+regeneration+in+zebrafish.">Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11889-11895 (2003).</li><li>Smith, A., Avaron, F., Guay, D., Padhi, B. K., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+BMP+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration+disrupts+fin+growth+and+scleroblasts+differentiation+and+function.">Inhibition of BMP signaling during zebrafish fin regeneration disrupts fin growth and scleroblasts differentiation and function.</a> Dev Biol. 299, 438-454 (2006).</li><li>Thummel, R., Li, L., Tanase, C., Sarras, M. P., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+expression+pattern+and+function+between+zebrafish+hoxc13+orthologs:+recruitment+of+Hoxc13b+into+an+early+embryonic+role.">Differences in expression pattern and function between zebrafish hoxc13 orthologs: recruitment of Hoxc13b into an early embryonic role.</a> Dev. Biol. 274, 318-333 (2004).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+knockdown+in+zebrafish.">Effective targeted gene knockdown in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-2120 (2000).</li><li>Hoptak-Solga, A. D., Nielsen, S., Jain, I., Thummel, R., Hyde, D. R., Iovine, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+(GJA1)+is+required+in+the+population+of+dividing+cells+during+fin+regeneration.">Connexin43 (GJA1) is required in the population of dividing cells during fin regeneration.</a> Dev. Biol. 317, 541-548 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Yin, V. P., Thomson, J. M., Thummel, R., Hyde, D. R., Hammond, S. M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

כאן, נתאר גישה חזקה אובדן-of-פונקציה תנאי חלבונים מציאה של עניין במהלך רגנרציה של סנפיר דג הזברה מבוגר. טכניקה זו נעשה שימוש כדי ללמוד צומת גנים הפער, איתות קולטנים, גורמי תעתוק, וכן מיקרו RNA במהלך תוצאה סנפיר משובי 16, 20-22. אנו צופים כי טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את הגנים הדרושים ריפוי הפצע והיווצרות blastema ידי התאמת הטכניקה. לדוגמה, אנו הזריק electroporated morpholino השליטה במרחב שבין קרני סנפיר הגרומות על 1/2 של סנפיר הגב לפני קטיעה (איור 7). אנחנו קטוע אז סנפיר דיסטלי מיד למטוס ההזרקה. 24 hPa, צפינו כי morpholino במיקוד התאים נדדו distally להקים גם אפיתל הפצע blastema (איור 8), המציין כי תאים בשלבים הראשונים של התחדשות ניתן טארגeted. הטכניקה יש כמה מגבלות בולטות מעט. כך, למשל, הקרינה מ תג fluorescein לא מתעקש קיבוע עיבוד הבאה ועל אימונוהיסטוכימיה, מה שהופך את זה בלתי אפשרי לקשר בין פנוטיפ הסלולר בפרט (כלומר ריבוי תאים) עם כמות של morpholino הנוכחי בתא. בנוסף, אנו לא הצליחו באופן עקבי להשיג את electroporation של פלסמידים לתוך סנפיר הזנב התחדשות, אם כי הקבוצה הקודמת לא לדווח electroporation מוצלח של ה-DNA לתוך רקמת הסנפיר 23. לבסוף, יש לנו לציין כי morpholino הוא יעיל רק עבור 48 שעות ~~~HEAD=NNS electroporation הודעה 21, האוסר על שימוש בטכניקה זו במתכונתה הנוכחית לבדיקת גנים המעורבים בידול של סוגי תאים חדשים. בדיקות שינוי נוסף של ההליך עשוי להתגבר על המגבלות האלה הנוכחי. בנוסף, ייתכן כי טכניקה זו יכולה לשמשכדי לבדוק את החלבונים המעורבים נדידת תאים מרקמות הבסיס כדי blastema. לדוגמה, אנו הזריק electroporated השליטה morpholino לתוך שני הצדדים של סנפיר (כמתואר באיור 7) לפני קטיעה. אנחנו נקטעה ואז 1/2 של סנפיר הגב דיסטלי מיד למטוס הזרקת ואנחנו קטוע סנפיר הגחון הרבה יותר distally. בגיל 24 hPa, את morpholino חיובי תאים בצד הגבי נדדו מאתר ההזרקה כדי האפיתל שמעליה הפצע blastema. עם זאת, כי לא היה המקרה בצד הגחון (איור 9). זה תומך ברעיון רק את התאים העומדים בבסיס מטוס קטיעה להשתתף בתגובה רגנרטיבית. נתונים אלה מראים גם כי חלבונים שיערו להידרש נדידת תאים ניתן לבדוק באמצעות טכניקה זו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> CUY21-edit או CUY21-SC Square גל electroporator </td><td> PROTECH הבינלאומי </td><td> CUY21EDIT או CUY21SC </td><td> יחידות שניהם עובדים על פרוטוקול זה </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ בקוטר ההנעה אלקטרודות </td><td> PROTECH הבינלאומי </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino יש מנהג שנועד חלבון העניין שלך </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> סיגמא </td><td> 77861-1 ליטר </td><td> הרדמה: 1:1000 לדלל במים המערכת דגים ההליך, 1:500 על המתת חסד </td></tr><tr><td> מיקרו injectiעל המשאבה </td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> PV830 אוויר PicoPump </td><td> רבים מערכות microinjection שונים יכול לשמש </td></tr><tr><td> מיקרו מניפולטור </td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> MMJR </td><td> ימני (MMJL עבור שמאלי) </td></tr><tr><td> מיקרו הזרקה, מחטים 1.0 מ&quot;מ קוטר חיצוני </td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> 1B100F-4 </td><td> אלה הם ההתכה של זכוכית בורו הנימים, נכנס מחט </td></tr><tr><td> מחט בעל </td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> 5430-ALL </td><td> פיקו Nozzle Kit, הקפד הבלעה מ&quot;מ 1.0 פיפטה אטם </td></tr><tr><td> מחט חולץ </td><td> סאטר </td><td> P-97 </td><td> אחרים micropipette / מחט מושכי צריך גם לעבוד </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> לייקה, ניקון, Zeisשל </td><td> מספר משתנה בהתאם ליצרן </td><td> כל סטראו עם 20x אופטיקה ואת היכולת לעבוד עם micromanipulators </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

מינים מסוימים של urodeles ודגים teleost יכול לחדש רקמות שלהם. דג הזברה הפכו להיות מודל נפוץ ללמוד התחדשות ספונטנית של רקמות בוגרות, כמו הלב 1, 2 הרשתית, חוט השדרה 3, עצב הראייה, 4 תאים שיער חושי 5, 6 ו סנפירים. סנפיר דג הזברה הוא תוספת פשוטה יחסית, כי הוא לטפל בקלות ללמוד בשלבים מרובים התחדשות epimorphic. קלאסי, התחדשות סנפיר התאפיין בשלושה שלבים ברורים: ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה סנפיר. לאחר קטיעת חלק סנפיר, האפיתל סביב proliferates ו נודד על פני הפצע. ב 33 מעלות צלזיוס, תהליך זה מתרחש בתוך שש שעות לאחר קטיעה (hPa, איור 1 ב) 6,7. בשלב הבא, התאים הבסיסיים של שושלות שונות (שמות עצם, דם, גליה, פיברובלסטים) להזין מחדש את מחזור התא כדי ליצור blastema שגשוג, Wבשעה שהייתי האפידרמיס שמעליה ממשיך להתרבות (איור 1D) 8. תוצאה מתרחשת כאשר התאים בקרבה blastema מחדש להתמיין שושלות של כל אחד מהם כדי ליצור רקמה חדשה (איור 1 ד) 8. תלוי ברמה של קטיעה, התחדשות מלאה ניתנת תוך שבוע עד חודש. ביטוי במספר רב של משפחות גנים, כולל Wnt, hox, FGF, MSX, חומצה רטינואית, ששש, חריץ, BMP ו-activin בטא גנים, הוא מעלה מוסדר בשלבים מסוימים של סנפיר התחדשות 9-16. עם זאת, את התפקידים של גנים וחלבונים אלה מקודדים שלהן במהלך רגנרציה היה קשה להעריך, אלא אם כן מעכב ספציפי של חלבון קיים 13, מוטציה הטמפרטורה רגיש קיים או בעל חיים מהונדס (או overexpressing חלבון wild-type או הדומיננטית שלילי חלבון) נוצר 7,12. אנחנו develoPED טכניקה גנטית הפוכה במהירות ובקלות לבדוק את הפונקציה של הגן במהלך כל התחדשות סנפיר. Oligonucleotides morpholino נמצאים בשימוש נרחב ללמוד אובדן חלבונים ספציפיים במהלך דג הזברה, Xenopus, אפרוח, עכבר ופיתוח 17-19. Morpholinos basepair עם רצף RNA משלים splicing או לחסום מראש mRNA או תרגום ה-mRNA. אנו מתארים שיטה יעילה להציג את fluorescein-מתויג antisense morpholinos אל סנפירי דג הזברה התחדשות לביטוי מציאה של חלבון המטרה. Morpholino הוא מיקרו מוזרק blastema כל סנפיר זנב דג הזברה התחדשות ו electroporated לתוך התאים הסמוכים. Fluorescein מספק תשלום electroporate morpholino וכדי להמחיש morpholino ברקמת הסנפיר. פרוטוקול זה מאפשר מציאה חלבון מותנה כדי לבחון את התפקיד של חלבונים ספציפיים במהלך תוצאה סנפיר רגנרטיבית. ב Discussion, אנו מתארים כיצד גישה זו ניתן להתאים ללמוד את התפקיד של חלבונים ספציפיים במהלך ריפוי פצעים או היווצרות blastema, כמו גם סמן הפוטנציאל של נדידת תאים במהלך היווצרות blastema.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

in-vivo-electroporation-morpholinos-into-regenerating-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.8K Views.  University of Notre Dame. אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה ר...

Video: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...