המחברים מבקשים להודות מדעי החיים פריימן מרכז מרכז צוות מחקר דג הזברה לטיפול שלהם ותחזוקה של דג הזברה.

1. Morpholino הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל oligos morpholino צריכה להיות אישית מעוצבת והורה דרך GeneTools (Philomath, OR). אנו משתמשים באופן חיובי טעון lissamine-tagged morpholinos לכונן morpholinos electroporated לכיוון האלקטרודה השלילית. ניסינו, ללא הצלחה, יעד שלילי טעון והעמסת-tagged morpholinos אל האלקטרודה החיובית באמצעות טכניקה זו. מדולל 300 nmol של morpholino לתוך 100 μl מים nuclease ללא להניב פתרון 3 מ&quot;מ. Aliquot morpholino לתוך פרפין אטום צינורות מרובים microcentrifuge. אחסן הרחק אור בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז morpholino על ידי דילול 5 μl של morpholino (או מים המשמשים לדלל את morpholino כמו ריק) ב 95 μl של 0.1 N HCl. קבע את אורך הגל ספקטרופוטומטר (λ) עד 265 ננומטר. חשב את קבוע morpholino באמצעות המשוואה הבאה: משקל קבוע = מולקולרית מיוחדת morpholin שלךo X 1000/molar ספיגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכלו למצוא את משקל מולקולרי ונתונים על ספיגת טוחנת את גיליון &quot;אוליגו מאפיינים&quot; מסופק עם כל morpholino. נתח את ריק כדי לוודא קריאה בסיסית לקחת קריאות של כל morpholino בדילול מלא. הכפל את ספיגת ב 265 ננומטר של כל morpholino נקבע על ידי קבוע שלה על ידי פקטור התימהול כדי לקבל את ריכוז ng / μl. מחלקים את המספר הזה על ידי משקל מולקולרי כדי לקבוע את הריכוז מ&quot;מ. לדלל את morpholino, במידת הצורך, כדי ריכוז בעבודה. </li></ol> 2. הסרת השכבה הקרנית החיצונית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 6-12 מבוגר בן חודש דג הזברה ב Tricaine או 2-phenoxyethanol על 1.0 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מים טנק דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף דג הזברה תוך לחלח פיסת מגבת נייר, המכסה את הזימים, אבל משאיר בעין חשופה. דג עטוף ממוקם תחת stereoscope ואת ההגדלה הוא גדל עד קוטר של העין ממלא כשליש שלשדה הראייה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש דומון # 5 פינצטה, לתפוס את הקרנית החיצונית ליד הסדק אופטיים. רקמה זו היא בצבע אדום מסומן &quot;OC&quot; באיור 1. יש בליטה קלה או שפתיים מסומנים בחץ שכותרתו &quot;CL&quot;. משוך בזווית נמוכה (כלומר 10 מעלות) על פני העין להסיר את הקרנית החיצונית. עם תרגול, זה יכול להסתיים בתנועה אחת. אם להחליק פינצטה, לתפוס מחדש את רקמת ושוב למשוך בזווית נמוכה עד הוסרו. קרנית היטב המצורפת יכולה לגרום לעין להיעקר מהשקע כאשר שלף. אתה יכול לשמור את העין מן המועתקת ידי מייצבת עם קבוצה נוספת של פינצטה. </li></ol> 3. חיתוך הקרנית הזרקת morpholino: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הסרת הקרנית החיצונית, לעשות חתך קטן בקרנית היכן התלמיד עונה על קשתית (איור 2). הדבר נעשה באמצעות להב ספיר אזמל (ראו חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 0.5 μl של הפתרון mM morpholino 3.0 לתוך Hamiltעל מזרק מצויד במד 33 נשלף, בוטה לקצה המחט (ראו חומרים). פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר בתוך הקו. בזהירות להכניס את המחט אל תוך הזגוגית דרך חתך (איור 2). אל תכניס את המחט עמוק מדי או שאתה תהיה לנקב את הרשתית או לעקור את העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק את הפתרון morpholino לחלל vitreal. בהתאם לגיל של הדג, המרחב vitreal תקיים ~ 0.5 μl. אתה צריך לדמיין זגוגי צבוע דולף מתוך החתך כפי שהוא שנעקרו על ידי הפתרון morpholino. עד להזריק כמות קטנה של דליפות morpholino פתרון מתוך החתך. אתה צריך בבירור לדמיין את morpholino lissamine-tagged בתוך העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזריקה, להחזיר את הדגים לאקווריום להתאושש. בדרך כלל אנחנו רק להזריק את עינו השמאלית, תוך שימוש בעין ימין כפקד uninjected, אבל electroporation של שתי העיניים אפשרי. </li></ol> 4. Electroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבאהזרקה של דגים כ 10, מחדש להרדים דגים מוזרק ועוטפים אותו בחתיכת לחלח של מגבת נייר, רק מכסה את הזימים, אבל משאיר בעין חשופה. מעבירים את הדג בצלחת פטרי. לבשי כפפות לטקס או דומה, כדי למנוע חשיפה ההרדמה. בעוד מחזיק בעדינות את הדגים אל החלק התחתון של התבשיל, למלא את הצלחת עם הרדמה (איור 3, פאנל משמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 מ&quot;מ בקוטר צלחת פלטינה אלקטרודה (ראו חומרים) localizes פולסים electroporation למחצית בקירוב של הרשתית. אנחנו בדרך כלל המטרה הרשתית הגבי. לחץ בעדינות את האלקטרודה החיובית כלפי מטה על מחצית הגחון של העין. עם הקרנית החיצונית מוסרת, העין בקלות לסובב, חושף את החלק הגבי של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם עדיין לוחצת על הצד הגחוני של העין, במקום אלקטרודה שלילית ליד (~ 1-2 מ&quot;מ) חצי הגב החשוף של העין. היזהר שלא לגעת אלקטרודה שלילית ישירות לעין, אשר תגרום נזקהרשתית הגבי. ברגע שאתה לקבוע את המרחק הראוי בין האלקטרודות, השתמש בורג התאמה על ידית של אלקטרודות, כדי לשמר את התפשטות כאשר electroporating. דבר זה שומר את האלקטרודה השלילית המרחק האופטימלי של גלגל העין, כאשר האלקטרודה החיובית נלחץ מטה בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate את העין באמצעות Electroporator CUY21 Square Wave (ראו חומרים). הפרמטרים electroporation יש להגדיר שני ברציפות של 50 msec קטניות, ב V 75 עם הפסקה 1-sec בין פולסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור דגים לאקווריום. אנחנו בדרך כלל מתחילים פרוטוקול שלנו ניוון אור המושרה קבוע ברשתית מיד לאחר electroporation. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 3-5 ימים לאחר electroporation (בהתאם ליציבות morpholino), את התווית lissamine ניתן דמיינו בכל שכבות הרשתית ברשתית מחולק (איור 4). זו משמשת אישור נוכחות שלשכותרתו morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו יכולים להשיג מציאה חלבון מלא עד 3-5 ימים לאחר electroporation, בהתאם ליעילות של morpholino (איור 5). בדרך כלל, במהלך לימודי טיפול באור, אנחנו הקציר עיניים 3 או 4 ימים לאחר electroporation morpholino. הדבר נעשה על ידי הסרת העין כולה עם מלקחיים דומון # 5B עם קצוות מעוגלים (איור 6; חומרים) ועיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה 15. כמו עם טכניקה כל מציאה, הפגנה של מציאה יעיל יש להראות על מנת לאמת את הפנוטיפ. לכן, אנו ממליצים antisera השגת חלבון העניין שלך. לחלופין, אם הנוגדן אינו זמין ואת morpholino מופנה גם את acceptor אחוי או אתר התורמות mRNA מראש, זה יחסום שחבור יעיל של ה-mRNA. במקרה זה, ניתן להשתמש הפוכה transcriptase-PCR כדי להגביר את רצפי איגוף ב RNA morphant ולקבוע את היעילות של חסימת splic נורמלידפוס ing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הרשתית הם מחולק מן האף אל הזמני על הציר הגבי הגחון, את הקופסאות הכחולות מוצל (איור 6) מייצג את אזורים של הרשתית אשר ניזוקים לרוב מהאירוע electroporation עצמו. תיבת ורוד מוצל מייצג את האזור כי הוא ממוקד מבוא morpholino לתאי הרשתית על ידי electroporation. </li></ol><img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי המתאר את הסרת שכבות האפיתל של הקרנית. הלוח השמאלי מציג את המאפיינים המבניים העיקריים של העין, כולל העדשה (L), הזגוגית (Vit), הרשתית (R), את הקרנית החיצונית (OC), את הקרנית הפנימית (IC), ואת בליטה קרנית ( CL). האוריינטציה של העין מוצג בפינה הימנית התחתונה של הפאנל הראשון מסומן קדמית (A), אחורי (P), הגבי (ד), ועל הגחון (V). צבע אדום מעיד על הקרנית החיצונית מוסר. הפאן השני<html> אל מראה כיצד מלקחיים המשמשים לתפוס את הבליטה הקרנית למשוך את הקרנית החיצונית על פני העין בזווית נמוכה (לוח ג&#39;). הפאנל הימני מראה כיצד זוג נוסף של מלקחיים ניתן להשתמש בעין יציב תוך משיכת הקרנית. <img alt="באיור 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> באיור 2. סכמטי של המעורבים הזריקה intravitreal של morpholino. חתך קטן עשה בעין היכן התלמיד עונה על איריס (פאנל משמאל). הפער שנוצר צריך להיות גדול מספיק עבור 33 מחט מד, אשר מתמלא הפתרון morpholino, להיות מוכנס (פאנל באמצע). לאט לאט להזריק 0.5 μl של פתרון לתוך הזגוגית (פאנל מימין). אתה צריך לדמיין כמות קטנה של פתרון vitreal לצאת החתך כמו הזגוגית מוחלפת בחלקה על ידי עם lissamine-tagged morpholino (פאנל מימין). ig3.jpg &quot;/&gt; באיור 3. סכמטי של ההליך electroporation בכלל. הדגים בהרדמה, אשר הוזרקו intravitreally עם morpholino, עטוף בעדינות במגבת נייר לחה (פאנל משמאל). מגבת נייר יש לכסות את הזימים, אך לא לחסום את העין (פאנל באמצע). לחץ בעדינות את האלקטרודה החיובית על החלק הגחוני של העין, מה שמאפשר חצי הגבי של העין כדי לסובב מתוך השקע. מניחים את האלקטרודה השלילית כ ​​1 מ&quot;מ מהמחצית הגבי של העין ולהתחיל את electroporation (פאנל מימין). <img alt="איור 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> איור 4. תמונה Confocal השוואת הרשתית electroporated ללא intravitreally הזרקת lissamine-tagged morpholino (א), וכן ברשתית מוזרק intravitreally ו electroporated עם lissamine-tagged morpholino (B). התווית lissamine נמצא בכל שכבות הרשתית סוגי תאים. ROS, מוט החיצונימגזרים; שכבת ONL, הגרעין החיצונית, שכבת INL, הגרעין הפנימי; GCL, תא שכבה גנגליון. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> איור 5. תמונות Confocal השוואת immunolocalization PCNA ב הרשתיות electroporated עם morpholino שליטה (פאנלים משמאל) הרשתיות electroporated עם morpholino אנטי PCNA (לוחות מימין) לפני מותו אור המושרה תא photoreceptor. Dark המותאמות דג הזברה לבקן מבוגר הושמו אור חזק מתמיד 1, 2, או 3 ימים לאחר electroporation של morpholino. Morpholino השליטה לא להדחיק ביטוי PCNA גוברת אור פגומים הרשתיות. אנטי PCNA morpholino ביעילות הפילו הביטוי PCNA חלבון דרך שלושה ימים של נזק קבוע אור חזק. <img alt="איור 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> סכמטי באיור 6. (פאנל משמאל) מראה enucleation של העין עבור processing ו cryosectioning, אשר נעשית לאורך הציר הגבי הגחון. תיבת מוצל ורוד (פאנל מימין) מראה את האזור ברשתית עם הסכום הגדול ביותר של חלבון מציאה באמצעות טכניקה זו. תיבות מוצלות כחול מייצגים אזורים שנפגעו לרוב על ידי האירוע electroporation. האוריינטציה של העין מתויג קדמית (A), אחורי (P), הגבי (ד), ועל הגחון (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות

לאחרונה, שני ניתוחים microarray בדקו את ביטוי הגנים השינויים שחלו במהלך רגנרציה של הרשתית או אור פגום או תיקון רשתית בניתוח נכרת 10, 16. שני המחקרים גילה גנים רבים אשר הציג שינויים משמעותיים הביטוי, או להגדיל או להקטין, כי סביר נדרשים עבור אירועים שונים המתרחשים במהלך התחדשות הרשתית, כגון כניסה מחדש של גליה מולר לתוך מחזור התא, המשך התפשטות והגירה של אבות העצבית על השכבה הרשתית פגום, ואת הבידול של אבות העצבית לסוג התא לתקן את עצבי. אמנם השוואה ישירה של שתי קבוצות microarray נתונים לגלות גנים מועמדים שעשויים להיות מעורבים האירועים הללו הסלולר, בסופו של דבר הגנים הללו החלבונים המקודדים שלהם חייבים להיבדק כדי לקבוע אם הם נחוצים התחדשות הנוירונים. כאן, אנו מתארים גישה חזקה אובדן-of-פונקציה conditionally מציאה חלבונים עניין ברשתית דג הזברה מבוגר. טכניקה זו שימשה ללמוד שני חלבונים תאיים ו תאיים, וכן מולקולות איתות, גורמי שעתוק וחלבונים הדרושים שכפול הדנ&quot;א 17-19. לכן, שיטה זו סייעה רבות להבנת המנגנון המולקולרי שבבסיס התחדשות הרשתית הבוגרת דג הזברה. בדקנו פרמטרים electroporation מרובים (, מתח מספר פולסים, זמן בין הפולסים), לפני פרוטוקול מוצלח הושג. בדו&quot;ח הקודם של electroporating morpholinos לתוך סנפיר הזנב דג הזברה התחדשות בשימוש 10 פולסים במתח נמוך (15 V) 20. מכיוון הרשתית דג הזברה מבוגר מוקף שכבות תאים מרובים אינו נגיש בקלות אלקטרודות פינצטה, הפרמטרים המשמשים סנפיר צלחו בשעה ביעילות electroporating morpholinos לתוך הרשתית מבוגר. לעומת זאת, מתח גבוה (100 V) לעיתים קרובות מילulted מוות לדגים. לאחרונה, 5 פולסים של 80 V תוארה electroporate פלסמיד דנ&quot;א לתוך הרשתית עכבר שזה עתה נולד גור 21. מצאנו כי מעט פחות אינטנסיבי 2 פעימות של 75 הביא V ב electroporation מוצלח של morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה מבוגרים עם הישרדות של 100% מהדגים טופלו. בנוסף, גילינו כי הסרת החיצונית ביותר (או החיצונית ביותר) מרכיב של הקרנית בצורה ניכרת את יעילות electroporation. הגדלת מספר פעימות עשוי לבטל את הצורך הסרה של רקמה זו, אך עלולים גם הם לגרום נזק לרקמות גדולה יותר. מחקרים מקיפים הראו כי שליטה בפרמטרים הללו לא גרמו למוות משמעותי כל תא ברשתית או לשנות את התגובות הסלולר ספציפיים שנצפה במהלך photoreceptor התחדשות 19. Gain-of-לתפקד בלימודים אינם אפשריים כיום באמצעות טכניקה זו in vivo, בשל חוסר היכולת שלנו באופן עקבי electroporate חומצות ריבונוקלאית גדול לתוך כל retinal תאים. עם זאת, ההצלחה של electroporating פלסמידים לתוך הרשתית עכבר in vivo ו הרשתית דג הזברה ב explants מציע זה עדיין אפשרות של דג הזברה 21, 22. אחד היתרונות של טכניקה זו היא electroporation נראה ביעילות להציג את morpholino לתוך כל סוגי תאים ברשתית. עם זאת, חולשה פוטנציאלית היה electroporation ביעילות סיפק את morpholino לתוך רק באזורים ברשתית הגב מרכזי. אירוע electroporation second לקראת המחצית הגחון של תוצאות הרשתית בשנת מיקוד טוב כל השכבות, אבל לעתים קרובות גורם לנזק. זו מגבלה מרחבית סביר נבעה הצורה והמיקום של האלקטרודות. השימוש אישית מעוצבת בצורת כוס אלקטרודות שניתן להציב סביב העין עשוי לשפר את החולשה הזאת. זו מגבלה המרחבי של מסירת morpholino מגביל את השימוש בטכניקה זו מונע את השימוש של suc assayh כמו ניתוח ERG כי ידרוש הערכה גלובלית של הרשתית. יצוין כי כמו כל ניסוי morpholino, רצוי לאשר את התוצאות באמצעות שנייה, שאינן חופפות morpholino ל-mRNA היעד. במקרים מסוימים, ניתן גם electroporate two morpholinos שונים בו זמנית מציאה את הביטוי של שני חלבונים שונים. הראינו את זה על ידי דריסה ביטוי הן את Pax6a וחלבונים Pax6b, בנפרד או ביחד 18. למרות שאנו הדגימו את השימוש בטכניקה זו עם מודל נזק האור שלנו, זה יכול להיות בשימוש סביר ללמוד התחדשות במודלים של נזק אחר 2-8 או להשתמש כדי לבחון את תפקודם של חלבונים פגומים ברשתית. לדוגמה, electroporation של morpholinos יכול לשמש מציאה הביטוי של ערוצים ספציפיים או התמרה מולקולות איתות בתוך הגנגליון או תאים amacrine ולאחר מכן ללמוד את הפונקציה של אותות אלההמסלולים בעיבוד חזותי. עם זאת, כפי morpholinos רק להשפיע על התרגום של חלבון חדש, אפשר היה לחכות עד מחזור חלבון אנדוגני מתרחשת לפני assay ניתן לבצעו. תלוי ביציבות של החלבון, שיכול לנוע בין 18 שעות עד ימים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT או CUY21-SC Square גל electroporator </td><td> Protech הבינלאומי </td><td> CUY21EDIT או CUY21SC </td><td> יחידות שניהם עובדים עבור פרוטוקול זה </td></tr><tr><td> 3 מ&quot;מ קוטר ההנעה אלקטרודות </td><td> Protech הבינלאומי </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino צריכים להיות מותאמים אישית שנועדו חלבון העניין שלך </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> סיגמא </td><td> 77861-1L </td><td> הרדמה: 1:1000 לדלל במים מערכת דגים ההליך, 1:500 עבור המתת חסד </td></tr><tr><td> דומון # 5 פינצטה </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td>14095 </td><td> כל # 5 פינצטה עם העבודה </td></tr><tr><td> דומון # פינצטה 5B עם טיפים זוויתי </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> 500234 </td><td> משמש המתת חסד העין enucleate הבאה </td></tr><tr><td> ספיר להב, קצה כפול רומח, 1 מ&quot;מ רחב, עם ידית סכין ספיר </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> Blade: 500314 לטפל: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> המילטון עם מזרק נשלף 33 מד בוטה סוף מחט </td><td> המילטון החברה </td><td> מזרק: 87930 מחט: 7762-06 </td><td> הסר את מחט המזרק שמגיע עם ולהחליפו 33-מד בוטה קצה מחט </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

רבים מחלות עיניים תורשתיות הרסנית לגרום לעיוורון מתקדם ובלתי הפיך, משום שבני אדם לא יכולים להתחדש גוסס או חולה הנוירונים ברשתית. לעומת זאת, דג הזברה הרשתית מבוגר בעל יכולת חזקים כדי להתחדש באופן ספונטני כל הכיתה עצבי הולך לאיבוד במגוון רחב של דגמים שונים לנזק ברשתית, כולל לנקב רשתית, אבלציה כימית, חום גבוה ומרוכז, וטיפול אור חזק 1-8. המעבדה שלנו מאופיין בהרחבה התחדשות של photoreceptors בעקבות טיפול קבוע אור עז נוירונים ברשתית הפנימי לאחר intravitreal ouabain זריקה 2, 5, 9. בכל המקרים, תושב גליה מולר להזין מחדש את מחזור התא לייצר אבות העצבית, אשר ממשיכים להתרבות ולהעביר את שכבת הרשתית תקין, שבו הם להתמיין הנוירונים לקוי. אנו מאופיינים חמישה שלבים שונים במהלך רגנרציה של אור Damaהרשתית GED שהיו מודגשת על ידי התגובות הסלולר ספציפיים. זיהינו מספר גנים הביע דיפרנציאלי בכל שלב של התחדשות רשתית על ידי ניתוח ה-mRNA microarray 10. רבים מן הגנים האלה הם גם קריטי להתפתחות העין. כדי לבדוק את תפקידו של גן כל מועמד / חלבון במהלך רגנרציה רשתית, עלינו לפתח שיטה תנאי להגביל את הביטוי של החלבון מועמד רק בזמנים במהלך רגנרציה של הרשתית מבוגר. Oligos Morpholino נמצאים בשימוש נרחב ללמוד אובדן תפקוד של חלבונים ספציפיים במהלך הפיתוח של דג הזברה, Xenopus, אפרוח, עכבר, וגידולים xenografts אנושי 11-14. אלה basepair שונה oligos עם רצף RNA משלים או לחסום את שחבור או התרגום של רנ&quot;א היעד. Morpholinos יציבים בתא והוא יכול לחסל או &quot;מציאה&quot; חלבון ביטוי במשך שלושה עד חמישה ימים 12. כאן,אנו מתארים שיטה יעילה ביטוי חלבון מטרה מציאה ברשתית דג הזברה מבוגר. שיטה זו מעסיקה lissamine-tagged morpholinos antisense כי הם שהוחדר לתוך הזגוגית של העין דג הזברה מבוגר. בעזרת מלקחיים אלקטרודה, morpholino הוא electroporated מכן לתוך כל סוגי התאים של הרשתית הגב מרכזי. Lissamine מספק את האחראי על morpholino עבור electroporation וניתן דמיינו להעריך את הנוכחות של morpholino בתאי הרשתית. מציאה מותנה ברשתית יכול לשמש כדי לבחון את התפקיד של חלבונים מסוימים בזמנים שונים במהלך רגנרציה. בנוסף, גישה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של חלבונים ספציפיים ברשתית ניזוק, בתהליכים כגון התמרה חזותית עיבוד חזותי נוירונים מסדר שני.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

שיטה א &#39;תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

in-vivo-electroporation-of-morpholinos-into-the-adult-zebrafish-retina

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.0K Views.  Wayne State University School of Medicine. שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

Video: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...