פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial בודדים בטלנצפלון דג הזברה כדי לאפשר ניטור ארוך טווח שלהם, כמו גם מניפולציה של מסלולים ספציפיים באופן תא אוטונומי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תיוג תא יחיד בצורה מהירה ויעילה, כמו גם עריכת גנים ומניפולציה מסלול איתות באופן תא אוטונומי. שיטה זו מאפשרת חקירה של שאלות בסיסיות של ביולוגיה של התא, למשל, על דללנציה של תאים, תחזוקה של הומלוסטזיס אפיתל, ואת הסימטריה של חלוקת התא.
התחל באמצעות מנגנון מושך מחט להכין נימי זכוכית. השתמש בטיפים microloader כדי למלא נימי זכוכית מוכן עם עשרה microliters של פתרון פלסמיד. לאחר מכן לחץ על תפריט לשנות נימי"על מכשיר ההזרקה כדי לאפשר את המחט להיות טעון לתוך מחזיק המחט.
לאחר מכן החלף את התקן ההזרקה משינוי נימי למצב הזרקה. לאחר מכן, באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה פי ארבעה, ומדפים Finden, לחתוך רק את קצה נימי. לאחר מכן להחיל לחץ על דוושת כף הרגל כדי לאשר כי פתרונות פלסמיד פועל בקלות מתוך המחט ללא הפרעה.
כאשר המחט מוכנה, להעביר דג זברה ממיכל הבעלים למיכל של פתרון הרדמה. ולחכות כמה דקות עד שתנועת הזימים תירגע. לחץ על צד הגב דגים הרגעה עד ספוג רטוב מראש מתחת סטריאומיקרוסקופ, ולהשתמש נירוסטה לנתח microknife עם 40 מילימטר חיתוך קצה ועובי 0.5 מילימטר כדי ליצור בזהירות חור קטן בגולגולת הדג בצד האחורי של telencephalon, ממש ליד הגבול של טקטום אופטי.
להטות את הדג לפי הצורך ולכוון את קצה נימי הזכוכית לכיוון הגולגולת בזווית הנכונה כדי להקל על חדירה של קצה נימי דרך החור. לאחר מכן, בזהירות רבה להכניס את קצה נימי לתוך החור דרך שכבת התא ependymal הגבי, עד שהוא מגיע החדר telencephalic, ולהחיל לחץ על דוושת כף הרגל במשך כ 10 שניות כדי לספק כ 1 microliter של פתרון פלסמיד. ההצלחה של המשלוח ניתן לאשר על ידי התבוננות התפשטות הנוזל הירוק לאורך החדר.
מכסים את הדג telencephalon עם כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד. עבור אלקטרופורציה של החיה מוזרק פלסמיד, להסיר את הספוג מן הגדרת ההזרקה לטבול את הצד הפנימי של electrotips לתוך ג'ל אולטרסאונד. מקם את ראש הדג בין האלקטרודות, עם האלקטרודה החיובית בצד הגחוני של הראש והאלקטרודה השלילית בצד הגבי.
לאחר מכן, בעוד עדיין מחזיק את הגוף של הדג בספוג, לחץ על האלקטרודות בעדינות ובדיוק נגד telencephalon ולנהל את הזרם עם דוושת הרגל, מחזיק את האלקטרודות במקום עד כל חמשת הפולסים הם סיימו. אם האלקטרופוריה מוצלחת, ניתן לראות פלסמיד שכותרתו תאים ependymoglial יחיד בין התאים שאינם פלסמיד שכותרתו ependymoglial. בהתאם ליעילות של תהליך האלקטרופוזיה, מספר גבוה או נמוך יותר של תאים ependymoglial עשוי להיות מסומן.
עם זאת, הפרוטוקול המודגם מניב מספר גבוה יותר של תאים מסומנים בתווית מאשר פרוטוקולים שפורסמו בעבר. שים לב כי הצפיפות הגבוהה ביותר של תאים מסומנים נוטה להופיע בעיקר בצד החדר הפנימי של שתי ההמיספרות בשל האופן שבו נוזל פלסמיד מוזרק מפיץ בין ההמיספרות. בסרטון זה, חצי כדור אחד של telencephalon דג הזברה מוצג 3D, שם התאים ependymoglial עם תהליכי רדיו, נמצאים מגנטה כאשר נצפה מהצד.
באמצעות אלקטרופורציה שותף עם פלסמיד אחר כי תוויות גרעינים, חלוקת תאים של תאים ependymoglial ניתן לראות. אלקטרופוליאציה לא מוצלחת גורמת למספר נמוך מאוד או ללא תאים ependymoglial שכותרתו. תאים ependymal הגבית, לעומת זאת, הם הסיכוי הטוב ביותר להיות מתויג.
סומא שלהם הוא גדול יותר בקובואיד והם אינם בעלי תהליכים מוארכים רדיו כפי שניתן לראות מנקודת מבט צדדית של שכבת התא ependymoglial. תאים המסומן tdTomato-mem הם ככל הנראה תאים תלותיים, הממוקמים מעל השכבה של ependymoglia. לעומת זאת, כניסתה של tdTomato-mem המבטאת פלסמיד לתאי ependmyoglial בודדים גורמת לביטוי tdTomato-mem בנוסף לתיוג התא הראשוני.
הדברים החשובים ביותר לזכור הם לחתוך רק את קצה נימי לחדור את השכבה ependymal תוך הזרקת כך הנוזל מתפשט בכל החדר. טכניקה זו מאפשרת ניטור ארוך טווח של תאים ependymoglial יחיד באמצעות הדמיה in vivo, ולכן לבסס את תפקידם התחדשות המוח, כמו גם הקישור הגנטי העצום שלהם vivo.
