אנו חייבים תודה לאליס Gaughan ומחמם-ג&#39;ינג וואנג, שמצטיין טכניים תמיכה, הזנה רוחנית ותמיכה מוסרית היו תפקיד מרכזי במחקרים אלו נעים קדימה. מחקרים אלה נתמכו על ידי מענק NIH AI036532 לgah.

1. הקרנה קטלנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עד 10 עכברי נמען לכלוב microisolator תואם irradiator לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין ב2 מנות שווות מסכמות מינון כולל (מנה כוללת = 9 cGy למקבלי BALB.B). הקרנה שנייה צריכה להיות 3 שעות אחרי הראשון. הזריקה אמורה להתרחש בין 4-6 שעות לאחר הקרנה סופית. עכברים להקרין באו 137 מקור Cs או RS2, 000, irradiator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההקרנות במינון, עכברי החנות השני בכלוב microisolator עם מי acidified עד למועד השתלה. </li></ol> 2. הכנת Splenocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר תורם אחד בהתאם להנחיות מוסדיות. כל תורם בדרך כלל מניב 75x10 6 - 125x10 6 splenocytes. שימוש CD8 ערכות טיהור, כל עכבר בדרך כלל מניב 6x10 6 - 12x10 6 תאי T CD8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הטחול ידי ביצוע 2 2 סנטימטר חתך סנטימטר אנכי הימני של קו האמצע ישירות 1תחת כלוב הצלעות. לחתוך את הפרווה, עור, וקרום בטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת טחול וליצור השעית תא בודדה על ידי הצבת מסך טחול ברשת μl 40 בצלחת פטרי עם 1640 RPMI עם 5% FBS. השתמש בוכנת מזרק כדי להתפרק טחול עד שכל הטחול כבר עבר דרך מחיצת רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור כל WT וL2G85.B6 תורם. לאסוף את כל השעיות התא הבודדה WT בצינור חרוטים 1-50 מ&quot;ל, ולאסוף את כל L2G85.B6 השעיות התא הבודדות בצינור חרוטי מ&quot;ל נפרד 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ב 1200 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב 4 ° C. כדורי resuspend ב1640 RPMI עם 5% FBS ותאים לספור. </li></ol> 3. הכנת מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עור מאיבר אחורי אחת של עכבר תורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך כמו רקמת שריר כמה שאפשר מעצם הירך ועצם שוקה / שוקית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת גפיים אחוריים על ידי חיתוך עצם ירך משם במפרק הירך. לחתוך כפה אחורית ממש מתחת לצומת שוקה / שוקית. כל קיצוצי העצם צריכים להתבצע באמצעות מספריים חסונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל רקמת שריר שנותר. חתוך את השוקית-יחסית מח עצם קטן נמצא בשוקית ולא שווה את המאמץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח רגל אחורית ב5% תהליך קר 1640 RPMI FBS וחוזר עם האיבר האחורי השני. כל עכבר אמור להניב בין 20x10 6 - 40x10 6 תאים במח עצם. </li></ol> 4. הסרת מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת גפיים אחוריים אחת מתקשורת והמקום בצלחת פטרי גדולה עם כמות קטנה של מדיה קרה (~ 1 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מפרק הברך. שימוש במזרק (נפח מ&quot;ל&gt; 5), מחט תת עורית להכניס לתוך השוקה ומדכא את המזרק עד שכל החומר האדום הוסר מפנים של שוקה. חזור על תהליך עם עצם ירך. השלך עצמות נטולות מח עצם שנותרו. חזור על תהליך עם גפה אחורית שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור השעית תא בודדה על ידי תקשורת pipetting המכיל מח עצם לתוך צלחת פטרי גדולה ובוכנת מזרק שימוש ו40 μl<html> רשת מסך. השעית פיפטה תא בודדה לתוך צינור חרוטים 50 מ&quot;ל ולשמור על קרח. </li></ol> 5. CD3 אזילה יש מגוון דרכים לפוגעות CD3 + תאים ממח העצם. המעבדה שלנו משתמשת בערכה שנעשתה על ידי Miltenyi BIOTEC (CD3-ביוטין - 130-093-021). לכלות CD3 + תאים ממח העצם בעקבות הפרוטוקול של היצרן. החיץ לערכות Miltenyi להלן ייקרא מאגר MACS (2 mM EDTA, BSA 0.5% ב PBS, 7.2 pH). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי צנטריפוגה splenocytes ותאי מח עצם ב 1200 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב 4 ° C וספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל supernatant. תאי resuspend מח עצם ב100 μl לכל 10 מיליון תאי מח עצם במאגר המקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם CD3 דלדול באמצעות מייצר פרוטוקול &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את תאי מוח עצם מדולדל CD3 3 פעמים ב PBS סטרילית. הרוזן CD3 מתרוקן תאי מח עצם וresuspend בנפח מתאים כדי להזריק 10 7 תאים. </li></ol>תחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. L2G85.B6 CD8 + טיהור תאי T יש מגוון של דרכים לטהר CD8 תאי T מL2G85.B6 עכברים. כמו כן, יש כמה דרכים לפוגעות CD8 תאי T מתורמי splenocyte WT. המעבדה שלנו משתמשת בערכות מMiltenyi BIOTEC (CD8 דלדול - 130-049-401, CD8 טיהור - 130-095-236). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend WT הגלולה במאגר MACS μl 90 ל10 7 תאים. המשך עם דלדול התא CD8 T לפי מייצר &#39;פרוטוקול (CD8 דלדול - 130-049-401). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend L2G85.B6 הגלולה במאגר MACS μl 40 ל10 7 תאים. המשך עם טיהור התא CD8 T לפי מייצר &#39;פרוטוקול (CD8 טיהור - 130-095-236). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור כל אוכלוסייה בתא ולשטוף את כל אוכלוסייה 3 פעמים עם PBS סטרילית. Resuspend כל אוכלוסייה בנפח המתאים כדי להזריק 18x10 6 WT (CD8 המדולדל) וsplenocytes 2x10 6 L2G85.B6 המטוהר CD8 תאי T. </li></ol>7. הכנת הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 10 7 CD3 תאי מח עצם מדולדל, 18x10 6 WT (CD8 המדולדל) splenocytes ו2x10 6 L2G85.B6 מטוהרים CD8 תאי T בצינור microcentrifuge. לשטוף עם סטרילי PBS וresuspend ב 300 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק הכנת תא לוריד הזנב של עכברי נמען. זריקות צריכים להיעשות באמצעות 28 מחטי מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי חנות בכלוב microisolator עם מי acidified. עכברי ציון יומי באמצעות שיטת ניקוד GVHD ניקוד שפותחה על ידי קוק ואח&#39; 1. </li></ol> 8. Bioluminescent הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלה לאחר שישה ימים, להזריק עכברי נמען עם 4 מ&quot;ג D-luciferin. אפשר 5 דקות לluciferin להגיב בלוציפראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר בתא isoflurane של imager פליטת האור ומקבלי תמונה למשך 5 דקות עם binning הקטן. פעולה זו תיצור תמונה ברזולוציה גבוהה תוך איסוף כמו אירועים רבים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים באמצעות חייםתוכנת תמונה. קנה המידה של התמונה פסאודו הצבעים יכול להיות שונה כדי להניב את התוצאות הטובות ביותר. עם זאת, זוהי חובתו של אותו קנה המידה לשימוש בכל ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורים של עניין ניתן ליצור באמצעות תוכנת תמונה חייה וemittance אור ניתן לכמת על ידי חישוב הזרם (פוטונים / sec) שנפלט מכל אזור של עניין. </li></ol> 9. נציג תוצאות כ 7-10 ימים לאחר השתלה, עכברים יתחילו להופיע סימנים קליניים של GVHD. עכברים מופיעים מוזנח בשל חוסר הטיפוח. נמענים גם יתחילו לרדת במשקל בין השתלת הודעה 7-10 ימים. הפעילות והיציבה של עכברי נמען תישארנה נורמלים יחסית עד השתלה לאחר כ 12-14 יום. עשרות GVHD מצטברים בהתמדה להגדיל באמצעות השתלת 1 2-3 שבועות לאחר (איור 1 א). מהלך המחלה משתנה מאוד בין עכברים, אולם מקבלים צריכים אחיד להיכנע לGVHD ידי ד 30-40השתלת ays הודעה (1B איור). איור 2 מראה עכברי נמען שצפו בי 6 השתלת הודעת ימים. היקף פסיאודו צבעוני מופעים שונים emittance אור בכל הגוף עם עוצמת האור הגבוהה ביותר שנפלטת בטחול והמעיים. הצטברות תאי T CD8 במעיים עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 6. עכברי נמען ניתן להציב שוב בכלוב microisolator להיות צלמו בנקודת זמן מאוחר יותר או מורדם להדמית vivo לשעבר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קריטריונים </td><td> כיתה 0 </td><td> כיתה 1 </td><td> כיתה 2 </td></tr><tr><td> ירידה במשקל (wkly.) </td><td> &lt;10% </td><td> &gt; 10% - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> יציבה </td><td> נורמלי </td><td> Hunching רק במנוחה </td><td> Hunching כמה; פוגע movement </td></tr><tr><td> פעילות </td><td> נורמלי </td><td> קל עד בינוני ירידה בפעילות </td><td> נייח אלא אם מגורה </td></tr><tr><td> מרקם פרווה </td><td> נורמלי </td><td> קל עד מתונה פורעת </td><td> עלעול קשה / הזנחה עצמית </td></tr><tr><td> מרקם עור </td><td> נורמלי </td><td> קנה מידה של כפות / זנב </td><td> אזורים בולטים של עור נכרתים </td></tr></tbody></table> הטבלה 1. קוק ואח&#39; פתח שיטת ניקוד זה ב -1996 1. עכברים צריכים להיות בקיע מדי יום בכל אחד מהקריטריונים שבצד השמאל. כל עכבר מקבל ציון של 0-2 לכל קריטריון והציון הכולל הוא סכום של כל הציונים הבודדים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> האיור 1. קטלני BALB.B המוקרן הושתלו עם 10 7 עצםתאי מח לבד או עם 18x10 6 splenocytes תא CD8 T המדולדל WT ו2x10 6 המטוהרים L2G85.B6 CD8 תאי T. א) נתוני ציון קליניים של מקבלי מח עצם לבד או עם תאי T CD8 מדולדל splenocytes WT וטהר L2G85.B6 CD8 תאי T. B) נתוני הישרדות של מקבלי מח עצם לבד או עם CD8 תאי T מדולדל splenocytes WT וטהר L2G85.B6 CD8 תאי T. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> איור 2. עכברי BALB.B קטלני מוקרנים הושתלו עם 10 7 תאי מח עצם לבד או עם 18x10 6 splenocytes תאי T CD8 מדולדל WT ו2x10 6 המטוהרים L2G85.B6 CD8 תאי T. מקבלים הוזרקו 4 מ&quot;ג D-luciferin באמצעות הזרקת intraperitoneal והיו צלמו באמצעות IVIS Xenogen למשך 5 דקות בbinning הקטן. נ.ב.תמונות eudo צבע מוצגות בי סגולים מייצגת עצמה נמוכה ואדום מייצג אזורים בעצמה גבוה של עניין היו סגור מסביב לכל העכבר ושטף כולל (פוטונים / sec) הייתה לכימות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> איור 3. עכברי BALB.B קטלני מוקרנים הושתלו עם 10 7 תאי מח עצם לבד או עם 18x10 6 splenocytes תאי T CD8 מדולדל WT ו2x10 6 המטוהרים L2G85.B6 CD8 תאי T. מקבלים הוזרקו 4 מ&quot;ג D-luciferin באמצעות הזרקת intraperitoneal והיו צלמו באמצעות IVIS Xenogen למשך 5 דקות בbinning הקטן. תמונות פסיאודו צבעוניים מוצגות בי סגולים מייצגת עצמה נמוכה ואדום מייצג עצמה גבוהה. מקבלים היו צלמו ב) יום 4, ב &#39;) יום 6, ו-C) העברת הודעה היום 8.

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפרוטוקול לגרימת GVHD בעכברים שהוצגו כאן מהווה מודל רלוונטי קליני של GVHD העכברי. הוקם במקור על ידי ברגר ואח&#39;. בשנת 1994, / 6 C57Bl לשילוב מתח BALB.B הוא MHC-תאם, עם תמותת GVHD מתווכת על ידי CD4 CD8 התלוי, גורמי אש T 2, דומים מאוד לתרחיש הקליני השכיח ביותר 3. זה ידוע כי השתלת...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא 40 מיקרומטר </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-ביוטין </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Microbeads אנטי ביוטין </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a microbeads </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-049-401 </td><td> נהג לכלות CD8 תאי T מטחול. </td></tr><tr><td> קוקטייל נוגדן טיהור CD8a </td><td> Miltenyi יוטק </td><td> 130-095-236 </td><td> משמש לטיהורCD8 תאי T מטחול. </td></tr><tr><td> D-luciferin </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

מחלת שתל נגד מארח (GVHD) היא המחסום להגבלת השימוש הרחב של השתלת מח עצם כטיפול מרפא למגוון ליקויים המטולוגיות. GVHD נגרם על ידי תאי T alloreactive בשלים הנמצאים במח עצם השתל שהחדירו לתוך הנמען ולגרום ניזק לאיברים מארחים. עם זאת, בעכברים, תאי T יש להוסיף לבידוד מח העצם גורמים GVHD. למרות עבודה מקיפה שנעשתה לאפיין השתלת הודעת T תא תגובות, טכנולוגיית הדמית bioluminescent היא שיטה לא פולשנית כדי לעקוב אחר דפוסי סחר בתאי ה T בגוף חי. בעקבות קרינה קטלנית, עכברי נמען מושתלים עם תאי מח עצם וsplenocytes מעכברים תורמים. תת תאי T מL2G85.B6 (עכברים הטרנסגניים שconstitutively מבטאים לוציפראז) נכללים בהשתלה. על ידי השתלת תאי T מסוים תת בלבד, אחד הוא מסוגל לעקוב אחר תת תאי T ספציפי בגוף חי,ובהתבסס על המיקום שלהם, לפתח השערות בדבר תפקידו של תת תאי T ספציפי בקידום GVHD בנקודתי זמן שונות. בהשתלת הודעת מרווחים קבועים מראש, עכברי נמען הם צלמו באמצעות מצלמת CCD IVIS Xenogen. עוצמת אור ניתן לכמת באמצעות תוכנת תמונת חיים כדי להפיק תמונה פסאודו צבע המבוססת על עוצמת פוטון (אדום = בעצמה גבוהה, סגולות = עצימות נמוכות). בין השתלה לאחר 4-7 ימים, עכברי נמען מתחילים להראות סימנים קליניים של GVHD. קוק ואח&#39;. 1 פתח שיטת ניקוד ללכמת את התקדמות מחלה המבוססת על מרקם נמען עכברי פרווה, שלמות עור, פעילות, ירידה במשקל, ויציבה. עכברים הם הבקיעו יומיים, ומורדמים כשהם הופכים לגוססים. עכברים בדרך כלל מטופלות הפכו גוססים השתלת 20-30 ימי הודעה. מודלים עכבריים הם כלים רבים ערך ללימוד אימונולוגיה של GVHD. סלקטיבי השתלת התאים T מסוים תת אלשפל לזיהוי מדוקדק של התפקידים כל תת מחזות. הלא פולשני מעקב תגובות תא T in vivo מוסיף עוד שכבה של ערך למודלים עכבריים GVHD.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model at JoVE.com

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

השתלת מח עצם Murine היא טכניקה בשימוש נרחב ללמוד מנגנונים אימונולוגיים המסדירים את מחלת שתל נגד מארח בבני אדם. היכולת לעקוב אחר דפוסי סחר בתא T<em&gt; In vivo</em&gt; מאפשר ניתוח מפורט של ההתפתחות וההנצחה של תגובות תא T במחלת שתל נגד מארח.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K Views.  The Ohio State University Medical Center. השתלת מח עצם Murine היא טכניקה בשימוש נרחב ללמוד מנגנונים אימונולוגיים המסדירים את מחלת שתל נגד מארח בבני אדם. היכולת לעקוב אחר דפוסי סחר בתא T In vivo מאפשר ניתוח מפורט של ההתפתחות וההנצחה של תגובות תא T במחלת שתל נגד מארח.

Video: Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...