עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (MCB-0923794 אל רגל).

1. ייצור גופי פרי מיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזר המרכז לחסן אגר 10 ב צלחת קוטר 6.0 ס&quot;מ פטרי עם המתח הפורה של פ graminearum (המלץ PH-1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחוסן מנות תחת אורות הניאון הבהירים בטמפרטורת החדר (18-24 ° C) ולאפשר לגדול עד תפטיר הגיע לקצה החיצוני של צלחת פטרי (3-5 ימים). בית אורות ניאון מסחריים לעבוד בסדר עבור גירוי הגוף הפרי היווצרות השחרור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות עם קיסם mycelia אוויר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 1.0 מ&quot;ל 2.5% Tween 60 א.ק. אל פני השטח עם הוקי כוס סטרילית או בסופו מעוגל של מוט זכוכית סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחות לאור. אל תוסיף Parafilm על צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24 שעות, את פני השטח של הצלחות צריך מראה מבריק. אם mycelia מופיע שוב, משטח גירוד מחדש להחיל Tween-60 הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב התפתחות גופי פרי מיניים במהלך השבוע הבא. שלבי הביניים שלפיתוח perithecium ניתן לקצור ידי בעדינות לגרד את פני השטח של אגר ופלאש להקפיא RNA החילוץ (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגים למבוגרים יצטברו על מכסה של צלחת ביום 7. בהתחלה אלו יהיו רק לעין תחת מיקרוסקופ לנתח, אבל מיום ליום 9, הם צברו לצפיפות מספיק כדי להיות גלוי לעין בלתי מזוינת. </li></ol> 2. Ascospore Assay פריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6 אחרי יישום של פתרון Tween, חתכו 1 ס&quot;מ קוטר המעגל מתוך אגר עם מקדח עץ. לחלופין, אזמל ניתן להשתמש כדי להסיר קטע בגודל דומה. המעגל יכול להיות פרוס לשניים, וכל חצי דגש על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט החלקים כך את פני השטח המכיל את גופי פרי ניצב לפני השטח של שקופית, וכן נבגים נורים לאורך בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף בתא לחות במשך הלילה תחת אורות. נבגים יצטברו עלהשקופית ולהיות גלוי לעין בלתי מזוינת למחרת בבוקר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגים שנצברו ניתן לשטוף שקופיות עם מים לכמת אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוטנציאליים מעכבי שחרור ascospore ניתן ושם ישקלו לו ויעריכו על ידי הוספת אותם בצד האחורי של הבלוק אגר במהלך הרכבה של assay. מעכבי כמה ערוץ יון להפחית הפרשות כבר ושם ישקלו לו ויעריכו בעבר עם הטכניקה הזו 15. </li></ol> 3. דור של צאצאיהם רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום לחצות ידי יחסנו אגר גזר עם שני זנים של פ graminearum (1 + ניט ואחד ניט-), הצבת נקודות חיסון בצדדים מנוגדים של צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העובש מילאו את פני השטח, לגרד את החלק האווירי וליישם Tween-60 הפתרון כפי שתואר לעיל. השתמש הסמן לציין בצד של צלחת פטרי שבה העובש להיפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור תרבויות לאור דגירה עד פיתחו גופי פרי מיניים, ו cirrhi לא להיותאקדח כדי ליצור מתוך גופי פרי מיניים יחד בצומת בין שתי התרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, להכניס להציג גופי פרי מיניים יחד בצומת של שתי התרבויות. באמצעות סיכה חרק, עיקור וטבל במים סטריליים, לגעת cirrhus לאורך הגבול הזה בקלילות עם קצה של סיכה. לחות על הפין צריך לאפשר cirrhus את להיצמד סיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את קצה הפין עם cirrhus עליו מים סטריליים 200 μl בצינור Eppendorf לשטוף את הנבגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכת להבה, ללחלח את זה שוב לקחת עוד cirrhus. פיק 10-15 cirrhi, ומקום אחד בצינור נפרד של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות מערבולת בקצרה מכיל מושעה cirrhi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 60 μl של השעיה נבג עם טפטפת ומניחים על המדיום MMTS 1 ב 9 ס&quot;מ צלחת פטרי. מורחים בעזרת מקל הוקי סטרילית. ההשעיה נבג הנותרים ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבוע replated במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubate בטמפרטורת החדר (אור לא הכרחי) למשך 3-5 ימים עד מושבות קטנות מאוד להופיע (איור 3). יהיו שני סוגים של פנוטיפים בין המושבות. את מתישה מושבות העובש תהיה דלילה יותר המושבות + מטומטם. Cirrhi מ רקומביננטי גופי פרי מיניים יראה את שני פנוטיפים המושבה ביחס שווה בקירוב. מחק את צלחות עם מושבות של הפנוטיפ רק אחת עליהם. שימו לב, לעיתים יותר משני פנוטיפים לגרום עקב הפרדה של גורמים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מושבות V8 או אגר גזר לאחסון. הבדיקה מושבות על אגר DOX של Czapek (את מתישה זנים לא יגדל על DOX Czapek של) ועל מחשב כף יד עם כלורי (0.5 מ &#39;אשלגן כלורי, לצלילי + מטומטם לא יגדל על מחשב כף יד עם כלורי) כדי לאשר את הפנוטיפ הנכון. לבחון את המושבות עבור התכונות הרצויות. </li></ol> 4. נציג תוצאות ייצור גופי פרי מיניים המטרה היא להיות הדשא של<html> גופי פרי מיניים ללא mycelia או נבגים לכאורה. פני השטח של התרבות יופיע דומה קטיפה שחורה (איור 1). ב 24 שעות לאחר היישום של Tween את פני השטח של אגר צריך ברק קל. אם mycelia להופיע שוב, ואז הצלחת לא יכול היה לגרד מספיק כדי לגרום להתפתחות perithecium. Ascospore פריקה תמיד מספקים assay שלך כמה בלוקים של אגר מהלחץ wild-type. אם אלה לא אש, אז גם גופי פרי מיניים שלך צעיר מדי, מבוגר מדי. אם הם מבוגרים מדי, אז העובש רבים יופיעו על פני השטח של תרבות ונותן לו גוון לבנבן. אם זה לא המקרה, הם עשויים להיות צעיר מדי, assay יש לנסות שוב בעוד 24 שעות. מדי פעם, תרבויות לא למלא היטב, הניסוי יהיה צורך לחזור. הקפד לבצע את assay בתנאי תאורה נאותים. רקומביננטי הצאצאים &gt; גופי פרי מיניים רקומביננטי צריך לעשות את רוב גופי פרי מיניים יחד בצומת בין שני זנים. אנחנו בדרך כלל לעבד 10 cirrhi מהצלב ולפחות 4-6 של אלה צריכים להיות רקומביננטי. לעתים רחוקות, המוטציה מונעת זן מן ההזדווגות. אם אחד ההורים יש פנוטיפ צמיחה חריגה, אז יותר מ 2 פנוטיפים יכולים להיות נוכחים בין מושבות על MMTS. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> באיור 1. שלבי ההתפתחות perithecium על אגר גזר. H שמאל, 72 לאחר יישום Tween. הערה פיגמנט אדום גופי פרי מיניים צעיר מאוד גלוי בתור גרעינים שחורים על פני השטח. נכון, ב 144 שעות, גופי פרי מיניים בוגרים יצרו. שים לב כמעט מלאה העדר mycelia שטחית בתרבויות הצדדים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> 2. איור פריקה assay. התוספת כתום אגר גזר מכוונת כך thaנבגים טי משוחררים בכוח גופי פרי מיניים בוגרת על פני השטח שלו יכול להצטבר על פני השטח של שקופיות זכוכית. 15 שעות זמן הצטברות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> איור 3. הבדלים בין צמיחה ניט + ו מתישה מושבות על מצע MMTS סלקטיבית. את מתישה המושבות (ראשי חץ) קטנים יותר. את + מושבות מטומטם (חיצים) להראות צמיחה איתנה. התמונה צולמה לאחר 7 ימים.

<ol>
	<li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae.">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li><li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Researches on Fungi. , (1909).</li><li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1,+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel,+affects+growth,+development,+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae.">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li><li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization.">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li><li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -. H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -. W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+(MAT)+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae.">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li><li>Gueldener, U., Seong, K. -. Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -. R., Adam, G., Mewes, H. -. W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta.">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li><li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li><li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -. H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum),+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins.">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li><li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -. W., Yun, S. -. H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes:+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae.">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li><li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+(Gibberella+fujikuoi.">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li><li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -. C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene,+ROA,+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae.">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li><li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li><li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+cannons:+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota.">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li><li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perithecial+development+by+Gibberella+zeae:+a+light+microscopy+study.">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li><li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum.">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

פ graminearum מותאם במיוחד ללימוד פיתוח גוף הפרי בשל הזמינות של הגנום היטב המבואר ( <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> : 4), ואת הזמינות של Affymetrix- מבוסס microarray 6. זו יש להקל את היכולת לזהות גנים חשובים להזרמת ascospore 7,11,3. השיטות שהוצגו כאן יאפשר החוקר להתמקד קבוצה בדידה של שלבים התפתחותיים ופונקציות לניתוח גנטי של גופי פרי של פ graminearum. השיטות גם להתאמה בקלות פטריות קשורות יכול להיגרם פירות בתרבות, והוא יכול לשמש כאמת מידה להתפתחות במגוון רחב של סוגים אחרים בגוף פטרייתיים הפרי. היכולת להעריך את הפנוטיפ ירי נבג יכול להיות עדין מינים שבהם נבגים קטנים וקשה לראות, כגון <eמ&gt; פ graminearum. אוסף של נבגים בשקופית נקי מאפשר גם הערכה חזותית, והערכה כמותית, כמו נבגים ניתן לשטוף שקופיות ונרשמת. כמה מינים פטרייתיים לייצר הרירית המקיף שלהם נבג נבגי לא ניתן שטפה, אבל יש מנה מיקרוסקופית כפי שהם יישארו בשקופית. מצאנו שזה נכון של Sclerotinia sclerotiorum.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum זן PH-1 </td><td> פטרייתי גנטיקה צילומים מרכז, קנזס </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> Tween 60 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> אגר DOX Czapek של </td><td> Difco, בקטון דיקינסון </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

sexual development and ascospore discharge in fusarium graminearum

Fusarium graminearum הפכה מערכת מודל ללימודי פיתוח של פטריות פתוגניות פילמנטיות. פ graminearum בקלות מייצר גופי פרי, המכונים גופי פרי מיניים, על אגר גזר. גופי פרי מיניים מכילים מספר רב של סוגי רקמות, המיוצר בשלבים מסוימים של פיתוח perithecium. אלה כוללים (לפי סדר הופעתם) היווצרות התיבות perithecium (המעוררים העובש ascogenous), הקיר החיצוני, paraphyses (mycelia סטרילית אשר תופסים את מרכז perithecium עד asci לפתח), asci, ואת ascospores בתוך asci 14. ההתפתחות של כל אחד רקמות אלו מופרדים על ידי כ 24 שעות, כבר בסיס של מחקרים transcriptomic במהלך התפתחות מינית 12,8. עיין Hallen et al. (2007) לתיאור מעמיק יותר של ההתפתחות, כולל תמונות של כל שלב. כאן, אנו מציגים את שיטות להפקת והקציר סינכרוניLY פיתוח מדשאות גופי פרי מיניים ללימודי הזמני של ויסות הגנים, פיתוח תהליכים פיזיולוגיים. למרות השיטות האלה נכתבים במיוחד לשימוש עם פ graminearum, טכניקות ניתן להשתמש במגוון רחב של מחלות נוספות, ובלבד הפרי יכול להיגרם בתרבות ויש כמה בתיאום לפיתוח. יש לנו להתאים לאחרונה בפרוטוקול זה כדי ללמוד את ההתפתחות המינית של פ verticillioides. אמנם גופי פרי מיניים אדם יש הרים יד על מין זה, כי הדשא של פיתוח גופי פרי מיניים לא יכול היה להיגרם, התהליך עובד היטב לחקר ופיתוח (Sikhakolli ואת שביל, לא פורסם). התפקיד החשוב ביותר של גופי פרי פטרייתי הוא פיזור נבגים. ברבות מיני Ascomycota (נאד לייצר פטריות), נבגים נורים מתוך נאד, עקב הדור של לחץ turgor בתוך נאד, נהיגה פליטה של ​​נבגים (נוזל epiplasmic) דרךנקבובית עצה נאד 2,7. המחקרים שלנו של הפרשות ascospore בכוח גרמו לפיתוח של &quot;assay הפרשות נבג&quot;, שבו אנו משתמשים כדי לסנן על מוטציות בתהליך. כאן אנו מציגים את פרטי assay זה. פ graminearum הוא homothallic, וכך יכול להיווצר גופי פרי בהיעדר בן זוג תואם. היתרון של homothallism היא כי מעבר אין צורך לייצר צאצאים הומוזיגוטים עבור תכונה מסוימת, פן כי יש להקל את לימוד התפתחות מינית מין זה 14,7. עם זאת, זנים heterothallic נוצרו, שניתן להשתמש בהם עבור המעבר 5,9. אפשר גם לחצות זנים homothallic לקבל מוטנטים של גנים מספר 1 זן 1. הדבר נעשה על ידי coinoculating 1 צלחת פטרי עם 2 זנים. יחד לנקודת המפגש, רוב גופי פרי מיניים יהיו רקומביננטי (בתנאי מוטציה באחד הזנים ההורים לא לעכבoutcrossing). הגיל גופי פרי מיניים, הם להפריש ascospores בהמוניהם במקום בכוח למלא אותם. Exudate נבג שנוצר (המכונה cirrhus) יושב בקצה perithecium והוא יכול בקלות להסיר להתאוששות של נבגים בודדים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול כדי להקל על זיהוי רקומביננטי גופי פרי מיניים ואת ההתאוששות של הצאצאים רקומביננטי.

Watch this Scientific Journal Video about Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum at JoVE.com

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

צלבים מיניים ובידוד של הצאצאים רקומביננטי הם כלי מחקר חשובים פטריות פילמנטיות,<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, הטכניקות הדרושות בהצלחה לבצע את התהליכים האלה מוצגים.

התפתחות מינית והפרשות Ascospore ב Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Research

JoVE Journal

Biology

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

21.7K Views.  Michigan State University. צלבים מיניים ובידוד של הצאצאים רקומביננטי הם כלי מחקר חשובים פטריות פילמנטיות, Fusarium graminearum, הטכניקות הדרושות בהצלחה לבצע את התהליכים האלה מוצגים.

Video: Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascospore ייצור אוסף לניסויים microarray.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...