עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למחקר המיפוי של המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות. תמיכה נוספת ניתן על ידי NIDCD 5R01 DC007613.

1. Utricle Dissection והתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים הבוגרת (4 שבועות ומעלה) העכבר באמצעות פרוטוקול מאושר לערוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזוז את תעלת השמע החיצונית משני צידי הראש, ומושכים את העור קדימה לכיוון האף. לחצות את ראש מהסוף להתחלה ולהסיר את המוח משני הצדדים לגלות את המבוך הגרמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הגולגולת מן שבלול גרמי ולהעביר את המבוך הגרמי (כולל בולה) על מכסה המנוע רקמת התרבות מצויד המיקרוסקופ לנתח (הערה: עבודה adenovirus יש לבצע בארון דרגת הגנה II ביולוגי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מכסה המנוע, כדי להעביר את כל שבלול מאכל תרבות 35mm רקמה המכילה כלי התקשורת המבתרים סטריליים (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בולה השמיעה הוא עדיין שלם (אפשר להסיר את בולה במהלך דיסקציה ברוטו ידי הוספת התמונות שלך בין בולה ואת שיאשבלול), להשתמש בשני מלקחיים (1 מס &#39;3 ו - 1 # 5) לשבור את הבולה (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את ציוני הדרך של הכנת שבלול גרמי: איפקס, בסיס, ossicles, חלונות סגלגלים בסיבוב השמיני, שורש העצב, תעלות בצורת חצי עיגול (איור 1 ג&#39;, ד &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האוזן הפנימית בצלחת עם הצד המדיאלי כלפי מעלה, כך חלונות סגלגלים עגול איפקס הם בתחתית המנה, שורש העצב השמיני הוא פונה כלפי מעלה. החזק את ההכנה באמצעות מספר # 3 מלקחיים באזור של תעלות בצורת חצי עיגול (איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל מצויד בלהב # 11, לנתק את שיאו של שבלול הפסגה רק כדי שורש העצב (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ההכנה כך הוא חתך את החלק פונה כלפי מעלה. השתמש תעלה חצי עגול ידית קדמית כמו לייצב את ההכנה (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספר 5 מלקחיים, להסיר את השבלול על כישור את מטהלבסיס. בנקודה שבה האזור וו של שבלול פונה כלפי מטה, השתמש בדיקה בסדר (מחצית מספר # 55 מלקחיים שבורים) להרים את המדף הגרמי האחרון של lamina ספירלה גרמית (איור 1F), חושפת את שקיק. מתחת שקיק היא מדרגת משורת, שהוא ציון דרך חשוב. Utricle צמוד מיד מדרגת משורת (איור 1G), והוא מוקף העצם. השתמש בדיקה לשבב העצם במרחק מספיק כדי לחשוף כ 1/3 של utricle. מוציאים בזהירות את utricle באמצעות מס &#39;55 מלקחיים (איור 1H). הליך זה יהיה בדרך כלל תוצאה של הסרת האפיתל גג פיגמנט כמו utricle נמשך מן הכנת גרמי. עם זאת, אם utricle מוסר האפיתל עם גג שלם, הגג ניתן להסיר באמצעות מס &#39;55 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles עבור זיהום adenovirus (או ניסויים הדמיה חי) חייב להיות מוסר במהלך otoconia לנתיחה (לפני ההדבקה).במקרה זה, להשתמש במזרק luer נעילת כי הוא מלא עם התקשורת הניתוח, מצויד במחט קטנה בקוטר (בדרך כלל 26-28 מד). החזק utricle בקצה באמצעות מס &#39;55 (איור 1i מלקחיים). להביא את קצה המחט קרוב utricle עם שיפוע של המחט כלפי מטה. השתמש זרם של התקשורת לנתח לפוצץ את otoconia (איור 1J). לחלופין, otoconia ניתן להסיר על ידי צחצוח אותם באמצעות כלי עפעף (טד פלה, Inc # 113). Utricles שלא הולכים לעבור זיהום adenoviral הם בדרך כלל תרבותי חופשי צף 24 גם צלחות עם תרביות רקמה otoconia שלמים (ראה להלן להסרת otoconia שלאחר התיקון, שהוא קל יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל utricles הם גזור, לשנות את התקשורת המבתרים לתרבות התקשורת סטרילית: DMEM F12 (Gibco # 11320) בתוספת 5% FBS ו 50 יח&#39; / מ&quot;ל ​​פניצילין G (Sigma). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles מתורבתים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. אם הם תרבויות להיות maintaעומד לבחינה במשך יותר מ 48 שעות, 1/2 של התקשורת תרבות יש לשנות כל שני וחמישי. תרבויות יכול להישמר במשך שבוע או יותר. </li></ol> 2. Adenovirus זיהום של תאים תומכים חשוב: עבודה עם adenovirus דורש רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) נהלים הסמכה. בדוק עם מנהל מוסדי biosafety שלך כדי לקבל הדרכה והכשרה על BSL2 ההליכים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח utricles לעיל בתקשורת דיסקציה (אין סרום). הסר otoconia לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן להדביק, להעביר 1 utricle (תאים שיער למעלה) לבאר כל אחד Nunc מיני מגש (פישר # 12-565-68) המכיל 15 μL סרום ללא DMEM F12 (זה חשוב כי בסרום יכול להשבית את הנגיף) . העברה זו קל יותר עם 1.5 מ&quot;מ microcurette (# 10082-15 מ כלי מדעי בסדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלנו Ad-GFP הוא סרוטיפ 5 עם הגנים E1 ו-E3 ויראלי שנמחקו מקדם האדם CMV נהיגה transgמז (GFP). וירוס זה התקבל וקטור Biolabs (פילדלפיה, פנסילבניה <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). וירוסים המניות ניתנים titers של 1.0-4.0 × 10 10 PFU / מ&quot;ל. הוסף 0.5-2 μl של וירוס המניות זה טוב המכילים utricle (איור 1 ליטר). הסכום בפועל משמש משתנה בהתאם כייל הנגיף ומלאי. אנחנו בדרך כלל להדביק כל utricle עם 1.0-4.0 × 10 7 PFU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות utricles של הנגיף, המכיל התקשורת ב 37 ° C / 5% CO 2 למשך 2 שעות. לאחר 2 שעות, להעביר את utricles חזרה צלחת 24 גם רקמת התרבות המכיל התקשורת והתרבות עם סרום. התרבות utricles לילה ב 37 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles ניתן להשתמש למחרת לניסויים הדמיה חיים, או שהם יכולים להיות קבוע עבור immunochemistry תא השיער (ראו להלן). נגיפי ביטוי transgene עליות לאורך זמן, כך שאם ביטוי transgene נמוך ב 24 שעות שלאחר זיהום או כךמועיל תאים תרבות נוספים 24 שעות סרום המכיל התקשורת. אם אתה רואה תא רעילות שיער, להפחית את כמות הנגיף בשימוש. </li></ol> 3. קיבוע Utricle, הסרת Otoconia, ו Immunochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף התקופה תרבות, לתקן utricles ב paraformaldehyde 4% גם עבור 3 שעות בחדר זמני (על פלטפורמת נדנדה) או לילה ב 4 ° C. שטפי utricles (3 פעמים, 15 דקות כל אחת) ב 0.1 מ &#39;(1X) pH של Sorensen חיץ פוספט 7.4. פעולות אלה מבוצעות צלחת 24 גם בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת Otoconia: הערה: Otoconia יש להסיר לפני ההדבקה adenovirus (ראה שלב 1.11 לעיל). עם זאת, utricles שאינם להידבק יכול להיות מתורבת וקבוע עם otoconia עדיין שלם. במקרה כזה, בצע את הפעולות המתוארות כאן כדי להסיר את otoconia לאחר קיבוע. בדוק utricles על אפיתל הגג הנותר כל פיגמנט. מוציאים בזהירות את כל האפיתל הגג הנותר באמצעות 2 # 55 וorceps. כדי להסיר את otoconia, להחליף את מאגר פוספט של Sorensen עם 750-1000 μl Cal-Ex במסיר אבנית (פישר # CS510-1D). השאירו Cal-Ex על utricles דקה 1 ו 40 שניות (לא יעלה על 2 דקות). החלף Cal-Ex עם חיץ פוספט 0.1 M של Sorensen ו לשטוף (5 פעמים, 5 דקות כל אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה utricles ב borohydride נתרן (Sigma # 452882, 1% במים deionized) במשך 10 דקות. לשטוף utricles במאגר פוספט 0.1 M של סורנסן (5 פעמים, 5 דקות כל אחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Utricles מקום לבלום פתרון (PBS + 2% שור סרום אלבומין + 0.8% עיזים סרום רגיל + 0.4% טריטון X-100) במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים ראשוניים דגירה לילה ב 4 ° C. נגד שרירן 7 א (או פרוטאוס Biosciences # # 25-6790 או MYO7A 138-1 מ התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק) בשעה 1:100 בחסימת תוויות פתרון כל התאים שיער. כדי לתייג בנפרד תאים שיער striolar ולא striolar, השתמשנו פעמיים תווית protocoאני עם חד שבטי נגד calmodulin (Sigma C # 3545, 1:150) ו polyclonal נגד calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, קליפורניה, ארה&quot;ב, 1:200). נוגדנים משני (בדרך כלל Alexa נוגדנים פלואוריד משניים מצומדות של Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה, ארה&quot;ב) הם מדולל 1:500 לבלום פתרון מודגרות במשך 4 שעות בחושך בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר utricles על שקופיות הזכוכית באמצעות Fluoromount-G (דרום ביוטק, בירמינגהם, אל על, ארה&quot;ב). </li></ol> 4. נציג תוצאות Utricles תרבותי באמצעות שיטה זו שומרים מלא משלים של שני תאים שיער ותאים תומכים (איור 2). תאים שיער בתרבויות בריאים הצגת פרופילים גרעיני עגולים מוקפים אזורים cytoplasmic דקים כי הם שרירן 7 א חיובי (איור 2, לוח למעלה). התאים התומכים (תווית עם אנטי Sox2) הם קטנים יותר וצפופות יותר מאשר תאי שיער (איור 2, לוח נמוך יותר). ADEnovirus מדביק 25-50% מהתאים התומכים ב utricle, ולא בתאי השיער נגועים (איור 2, Ad-GFP לוחות). יש לציין כי titer עבודה אופטימלית של כל adenovirus צריכה להיקבע באופן אמפירי, שכן התא למוות שיער אפשרי אם כייל הנגיף הוא גבוה מדי. בנוסף, אזורים של נזק מכני (שנגרם במהלך דיסקציה) ייקח את כמויות גדולות של הנגיף. אלו אזורים של נזק מכני הם להבחין בקלות בקו רציף של תאים עם רמות גבוהות מאוד של ביטוי ה-GFP ותאי שיער חסר. זאת בניגוד לביטוי GFP מפוזר בתמיכה של התרבות תאים פגומים (תרשים 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Utricle Dissection. :. שמיעתית בולה (AB) ב &#39;:. בולה שבור באמצעות שתי מלקחיים חסון C: שבלול בוני (RW = חלון עגול, S =. העורק stapedial, C = שבלול, St = משורת) D: להב סכין המנתחים (SB) משמש כדי לנתק את שיאו של שבלול הפסגה לעצב הגולגולת השמיני (8 ה N) ASC = תעלה חצי עגול הקדמי E..: ההכנה נערכת היטב באמצעות מספר # 3 מלקחיים במזלג 1 מוכנס לתוך התעלה חצי עגול הקדמי (ASC) והשני על העצם החיצונית (החצים). מבוך קרומי מוסר באמצעות מלקחיים F:. עם מבוך קרומי הוסר, בתורו הבסיסי של lamina ספירלה גרמית גלוי ליד האזור וו. בדיקה בסדר מוכנס מתחת למדף הזה גרמי להרים את המדף למעלה להסיר אותו (חץ) G:. לאחר הסרת שקיק, utricle (U) גלוי צמוד מיד מדרגת משורת (SF) H:. Utricle (U ) מוסר באמצעות מספר # 55 מלקחיים (חץ) SF = המדרגה משורת אני:.. Utricle עם otoconia (O) הוסר חלקיתד חושיות (SE) אפיתל מתחת לעין J:. Otoconia (O) יוסרו utricle באמצעות זרם של התקשורת מועברים על ידי מזרק מצויד במחט 26-מד. צל של מחט (S) נראה בתחתית התמונה K:. Utricle עם otoconia להסיר אפיתל סנסורי (SE) L גלוי:. זיהום adenoviral: כל utricle (U) ממוקם הפרט היטב מיני מגש. תאים התומכים נגועים adenovirus ידי pipetting וירוס טוב (P = עצה Pipet). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Adenovirus בתיווך זיהום של תאים תומכים. Utricles נדבקו ביטוי adenovirus המניע של חלבון פלואורסצנטי ירוק (Ad-GFP). המוצגים הם תמונות confocal של שכבת שיער התא שכבת תאים תומכים באותו אזור של utricle 1. תאים שיער מסומנים עם נוגדנים נגד 7 א שרירן(מג&#39;נטה). תאים התומכים מסומנים עם נוגדנים נגד Sox2 (אדום). סכמטי מראה את המבנה של האפיתל חושית utricle ואת המיקומים של תאים שיער (HC) ותאים תומכים (SC). מיקומם של (אופטי) סעיפים confocal המוצגים העליון (U) ונמוך (L) לוחות מסומנים על ידי קווים מקווקווים ב סכמטית. לוחות בפסגה: בתמונות שצולמו confocal ברמה של גרעין התא שיער, Ad-GFP האות מופיע הרווחים בין התאים שיער אינו חופף עם 7 א תא שיער סמן שרירן. לוחות תחתון: בקטעים confocal ברמה של גרעין התא תמיכה, Ad-GFP האות colocalizes עם סמן את התא תמיכה סוקס-2. Ad-GFP תוצאות זיהום בביטוי GFP בתמיכה תאים בלבד, ולא בתאי השיער נגועים. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. זיהום adenoviral לא לגרום למוות של תאים שיער או תאים תומכים. אוטricles נדבקו GFP-Ad ב 4 × 10 8 PFU / מ&quot;ל. Utricles תויגו עם נוגדנים כנגד 7 א שרירן (תא סמן שיער) ו Sox2 (תמיכה סמן התא). תא שיער ספירת תאים התומכים היו שווים עבור utricles בקרה Ad-GFP utricles נגועים.

<ol>
	<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death.">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li><li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate.">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li><li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+(Danio+rerio)+lateral+line+and+mouse+(Mus+musculus)+utricle.">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li><li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity.">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li><li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death.">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li><li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+hair+cell+death+and+regeneration:+two+halves+of+the+same+equation.">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li><li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail.">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li><li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma.">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li><li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro.">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li><li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium.">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li><li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+activation+of+ERK1/2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium.">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li><li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin.">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li><li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo.">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li><li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death.">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li><li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage.">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li><li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia.">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells.">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li><li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock.">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li><li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+(HSP32).">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li><li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+inhibitors,+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment,+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss.">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li><li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear.">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li><li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury.">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תאים שיער חושי רגישים המוות שנגרמו על ידי מגוון רחב של לחצים, כולל הזדקנות, טראומה רעש, חשיפה לתרופות ototoxic, כולל אנטיביוטיקה aminoglycoside ו ציספלטין סוכן antineoplastic. אצל יונקים תאים שיער תוצאות המוות אובדן שמיעה קבוע ו / או הפרעות שיווי משקל. במערכות מודל במבחנה הם כ?...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בינונים 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טוב מלקחיים (# 55)</td&gt;<td&gt; מדע הגדרות יפות</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טוב מלקחיים (# 5)</td&gt;<td&gt; מדע הגדרות יפות</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מלקחיים (# 3)</td&gt;<td&gt; מדע הגדרות יפות</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פניצילין G</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בסרום שור עוברית</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc מיני מגש</td&gt;<td&gt; פישר</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; וקטור Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex במסיר אבנית</td&gt;<td&gt; פישר</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נתרן borohydride</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד שרירן 7 א (polyclonal)</td&gt;<td&gt; פרוטאוס Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד שרירן 7 א (חד שבטי)</td&gt;<td&gt; התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד calmodulin</td&gt;<td&gt; סיגמא</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; נגד Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; דרום ביוטכנולוגיה Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; טבלה 1</strong&gt;. ריאגנטים וכלים המשמשים בתרבות utricle וזיהום adenovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * הערה: Ad-GFP מסופק בדרך כלל על כייל המניות של 1x10 ידי Biolabs וקטור<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / מ&quot;ל. ביקשנו הגברה אישית על מנת לספק את הנגיף המניה ב כייל של 1.2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / מ&quot;ל.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

אובדן שמיעה והפרעות מאזן נגרמות בדרך כלל עקב מותם של תאים שיער mechanosensory, שהם תאים הקולטן של האוזן הפנימית. מכיוון שאין קו התא באופן משביע רצון מייצג תאים שיער יונקים, מחקר על תאים שיער מסתמך על תרבויות איברים ראשוניים. ביותר המאופיין במערכת מודל במבחנה של בוגרים לתאי שיער יונקים מנצל תרבויות איברים של utricles מעכברים בוגרים (איור 1) 1-6. Utricle הוא איבר שיווי המשקל, ואת בתאי השיער של utricle דומים במבנה והן בתפקוד לתאי שיער באיבר השמיעה, האיבר של קורטי. עכבר מבוגר הכנה utricle מהווה האפיתל חושית בוגרת לימודי של אותות מולקולריים המווסתים את הישרדות, הומאוסטזיס, ומוות של תאים אלה. יונקים תאים שיער שבלול הם מובחנים סופני ואינם מחדש כאשר הם הולכים לאיבוד. שאינם לאמאחוליות malian, שמיעה או מוות שיווי המשקל תא השיער מלווה התחדשות חזקים אשר משחזר השמיעה ושיווי המשקל פונקציות 7, 8. התא התחדשות שיער מתווך על ידי גליה דמויי תאים תומכים, אשר קשר עם משטחים basolateral של תאים שיער ב האפיתל חושי 9, 10. תאים תומכים גם הם מתווכים חשובים של הישרדות שיער התא ומוות 11. פיתחנו לאחרונה טכניקה זיהום לתמוך תאים בתרבית באמצעות utricles adenovirus. באמצעות סוג adenovirus 5 (dE1/E3) כדי לספק transgene המכיל GFP בשליטת היזם CMV, אנו מוצאים כי adenovirus במיוחד וביעילות מדביק תאים תומכים. תמיכה דלקת יעילות התא הוא כ 25-50%, ותאי השיער לא נגועים (איור 2). חשוב לציין, אנו מוצאים כי זיהום adenoviral לתמוך תאים לא לגרום רעילות לתאי השיער או תאים תומכים, כמו ספירת תאים ב Ad-GFP infutricles ected שקולים לאלה שאינם נגועים utricles (איור 3). כך adenovirus בתיווך ביטוי גנים בתמיכה של תאים בתרבית utricles מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את התפקידים של תאים תומכים כמתווכים של הישרדות שיער התא, מוות והתחדשות.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection at JoVE.com

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

תאים שיער Mechanosensory הם תאים הקולטן של האוזן הפנימית. ביותר המאופיין<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת מודל של בוגרים לתאי שיער יונקים מנצל תרבויות איברים של utricles מעכברים בוגרים. אנו מציגים דיסקציה של utricle עכבר מבוגר, ואנחנו מראים adenovirus בתיווך זיהום לתמוך תאים בתרבית utricles.

דיסקציה של Utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.6K Views.  Medical University of South Carolina. תאים שיער Mechanosensory הם תאים הקולטן של האוזן הפנימית. ביותר המאופיין במבחנה מערכת מודל של בוגרים לתאי שיער יונקים מנצל תרבויות איברים של utricles מעכברים בוגרים. אנו מציגים דיסקציה של utricle עכבר מבוגר, ואנחנו מראים adenovirus בתיווך זיהום לתמוך תאים בתרבית utricles.

Video: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

ניתוח החלק ההקפאה של האזור התת-כספי למבוגרים לניתוח פרוטאום כמותי מדויק ועמוק

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

העשרת תרביות נוירונים של גרעיני שורש גבי של עכבר בוגר על ידי אימונופנינג

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...