Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung am National Institute on Taubheit und andere Kommunikations Erkrankungen unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von NIDCD 5R01 DC007613 zur Verfügung gestellt.

1. Utriculus Dissection und Kultur <ol><li> Euthanize einen Erwachsenen (4 Wochen alt oder älter) Maus unter Verwendung eines zugelassenen Protokoll und enthaupten. </li><li> Snip den äußeren Gehörgang auf beiden Seiten des Kopfes und ziehen Sie die Haut nach vorn in Richtung der Nase. Halbierung der Kopf von hinten nach vorne und entfernen Sie das Gehirn von beiden Seiten, um die knöchernen Labyrinth zu offenbaren. </li><li> Kürzen Sie den Schädel weg von der knöchernen Schnecke und überweisen Sie den knöchernen Labyrinth (einschließlich der Bulla) auf eine Gewebekultur Kapuze mit einem Binokular ausgestattet (Hinweis: Adenovirus Arbeit sollte in einer Klasse II biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden). </li><li> In der Haube, übertragen jede Schnecke auf einer 35-mm Gewebekulturschale mit steriler Sezieren Medien (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Abbildung 1A). </li><li> Wenn die Gehörkapsel noch intakt ist (es ist möglich, die Bulla während des Brutto-Dissektion zu entfernen, indem Sie Ihren Daumennagel zwischen der Bulla und der Spitzedie Cochlea), verwenden Sie zwei Zangen (ein # 3 und # 5 ein), um die Bulla (Abbildung 1B) zu brechen. </li><li> Identifizieren Sie die Sehenswürdigkeiten der knöchernen Schnecke Zubereitung: Apex, Base, Gehörknöchelchen, ovale und runde Fenster, VIII. Nervenwurzel, Bogengänge (Abbildung 1 C, D). </li><li> Setzen Sie den inneren Ohr in die Schüssel mit der medialen Seite nach oben, so dass die ovalen und runden Fensters und Spitze auf der Unterseite der Schale und der VIII. Nervenwurzel sind nach oben zeigt. Halten Sie die Vorbereitung mit Hilfe einer Pinzette # 3 in der Region der Bogengänge (1D). </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 11 Klinge ausgestattet, schneiden Sie die Spitze der Cochlea nur apikal der Nervenwurzel (1D). </li><li> Drehen Sie die Vorbereitung, so dass die abgeschnittenen Teil nach oben zeigt. Verwenden Sie den anterioren Bogengangs als Griff, um die Vorbereitung (1E) zu stabilisieren. </li><li> Mit Nr. 5 Zange, entfernen Sie die Hörschnecke an den Modiolus nach untenmit der Basis. An der Stelle, wo der Haken Bereich der Cochlea sich nach unten dreht, mit einem feinen Sonde (die Hälfte eines zerbrochenen Nr. 55 Pinzetten), um die letzte knöchernen Regal des knöchernen Lamina spiralis (1F) anheben und enthüllt den Sacculus. Direkt unter der Sacculus ist die Stapesfußplatte, was ein wichtiger Meilenstein ist. Die Schlauches unmittelbar an der Fußplatte (1G), und es ist von Knochen umgeben. Verwenden Sie die Sonde, um den Knochen splittern weg genug, um etwa 1/3 des Utriculus offenbaren. Entfernen Sie vorsichtig die Utriculus mit einer Pinzette # 55 (Abbildung 1H). Dieses Verfahren wird in der Regel bei der Entfernung des pigmentierten Dach Epithel führen, da die Schlauches von der knöchernen Herstellung gezogen wird. Wenn jedoch die Schlauches mit dem Dach Epithel intakt entfernt wird, kann das Dach abgenommen mit Nr. 55 Zangen werden. </li><li> Primordialschläuche für Adenovirus-Infektion (oder Live-Imaging-Experimente) müssen die Otokonien während der Dissektion (vor der Infektion) entfernt.In diesem Fall verwenden Sie einen Luer-Lock-Spritze, die mit Sezieren Medien gefüllt ist und mit einer kleinen Injektionsnadel (in der Regel 26 bis 28 Gauge). Halten Sie den Utriculus am Rand mit einer Pinzette # 55 (Abb. 1I). Bringen Sie die Nadelspitze in der Nähe des Schlauches mit der Abschrägung der Nadel nach unten zeigt. Verwenden Sie einen Stream zu sezieren Medien Abblasen des Otokonien (Abb. 1J). Alternativ können Otokonien durch Streichen sie weg mit der Wimper Werkzeug (Ted Pella, Inc. # 113) entfernt werden. Primordialschläuche, die nicht gehen, um Adenovirus-Infektion zu unterziehen sind in der Regel kultivierte freischwebend im 24-well-Zellkulturplatten mit dem Otokonien intakt (siehe unten für Post-fix Otokonien Entfernung, was leichter ist). </li><li> Sobald alle Primordialschläuche seziert werden, ändern Sie die Medien zu sezieren sterilen Nährmedien: DMEM F12 (Gibco Nr. 11320) mit 5% FBS und 50 U / ml Penicillin G (Sigma) ergänzt. </li><li> Primordialschläuche werden bei 37 ° C und 5% CO 2 kultiviert. Wenn Kulturen sind zu mainta seininiert für mehr als 48 Stunden, sollte die Hälfte der Kulturmedien jeden zweiten Tag gewechselt werden. Kulturen können für eine Woche oder länger aufrechterhalten werden. </li></ol> 2. Adenovirus-Infektion von Stützzellen Wichtig: Die Arbeit mit Adenovirus erfordert Biosafety Level 2 (BSL2) und Urkunde. Fragen Sie bei Ihrem Institutional Biosafety Officer für Beratung und Weiterbildung auf BSL2 Verfahren. <ol><li> Sezieren Primordialschläuche wie oben in Dissektion Medien (kein Serum). Entfernen Sie Otokonien wie oben. </li><li> Wenn Sie bereit sind zu infizieren, übertragen ein Utriculus (Haarzellen nach oben) in jedes Well ein Nunc Mini-Tray (Fisher # 12-565-68) mit 15 ul serumfreiem DMEM F12 (das ist wichtig, weil Serum das Virus zu inaktivieren kann) . Dieser Transfer ist leichter, mit einem 1,5 mm microcurette (# 10082-15 von Fine Science Tools). </li><li> Unsere Ad-GFP ist Serotyp 5 mit den viralen Gene E1 und E3 gelöscht und des humanen CMV-Promotor, der die transgen (GFP). Dieses Virus wurde von Vector BioLabs (Philadelphia, PA erhalten <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Lager Viren in Titern von 1,0-4,0 × 10 10 PFU / ml bereitgestellt. In 0,5-2 ul Lager Virus in jede Vertiefung mit einem Utriculus (Abb. 1 l). Die tatsächliche Menge verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von dem Virus und-Titern. Wir in der Regel infizieren sich Utriculus mit 1,0-4,0 × 10 7 PFU. </li><li> Kultur die Primordialschläuche in Virus-enthaltenden Medium bei 37 ° C / 5% CO 2 für 2 Stunden. Nach 2 Stunden, übertragen Sie die Primordialschläuche zurück auf die 24-Well-Zellkultur-Platte, die Nährböden mit Serum. Kultur Primordialschläuche die über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Primordialschläuche kann verwendet werden, am nächsten Tag für die Live-Imaging-Experimenten werden, oder sie können für Haarzelle Immunchemie befestigt werden (siehe unten). Virale Transgenexpression der Zeit zunimmt, so dass, wenn Transgenexpression ist bei 24 Stunden nach der Infektion gering auch immerNutzen zur Kultivierung von Zellen weitere 24 Stunden in serumhaltigen Medien. Wenn Sie Haarzelle Toxizität sehen, reduzieren die Menge an Virus verwendet. </li></ol> 3. Utriculus Fixierung, Otokonien Removal, und Immunchemie <ol><li> Am Ende der Kulturzeit, zu fixieren Primordialschläuche in 4% Paraformaldehyd für entweder 3 Stunden bei Raumtemperatur (auf einer Schüttelplattform) oder über Nacht bei 4 ° C Wash Primordialschläuche (3-mal, jeweils 15 min) in 0,1 M (1X) Sorensens Phosphatpuffer pH 7,4. Diese Schritte werden in einer 24-Well Gewebekultur-Platte durchgeführt. </li><li> Otokonien Entfernung: Hinweis: Otokonien muss vor der Adenovirus-Infektion entfernt werden (siehe Schritt 1,11 oben). Allerdings kann Primordialschläuche, die nicht infiziert zu sein, kultiviert und mit dem Otokonien noch intakt fixiert werden. In diesem Fall verwenden Sie die hier beschriebenen Schritte, um die Otokonien nach der Fixierung zu entfernen. Überprüfen Primordialschläuche sie für jeden weiteren pigmentierte Epithel Dach. Entfernen Sie vorsichtig das restliche Dach Epithel mit zwei Nr. 55 forceps. Um die Otokonien entfernen, ersetzen Sorensen-Phosphat-Puffer mit 750-1000 ul Cal-Ex-Entkalker (Fisher # CS510-1D). Verlassen Sie Cal-Ex auf Primordialschläuche für 1 Minute und 40 Sekunden (nicht mehr als 2 Minuten). Ersetzen Sie Cal-Ex mit 0,1 M Sorensen-Phosphat-Puffer und waschen (5-mal, jeweils 5 min). </li><li> Inkubieren Primordialschläuche in Natriumborhydrid (Sigma # 452882, 1% in VE-Wasser) für 10 min. Waschen Sie Primordialschläuche in 0,1 M Sörensen-Phosphatpuffer (5-mal, jeweils 5 min). </li><li> Platz Primordialschläuche in Blocking-Lösung (PBS + 2% Rinderserumalbumin + 0,8% normales Ziegenserum + 0,4% Triton X-100) für 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Plattform. </li><li> In primären Antikörpern und über Nacht bei 4 ° C Anti-Myosin 7a (entweder Proteus Biosciences # 25-6790 oder # MYO7A 138-1 aus der Developmental Studies Hybridoma Bank) bei 1:100 in Blockierungslösung Etiketten alle Haarzellen. Separat zu beschriften striolar und nicht-striolar Haarzellen, haben wir ein Doppel-Label-Protokolls in Verwendungl mit monoklonalen anti-Calmodulin (Sigma C # 3545; 1:150) und polyklonalen anti-Calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Sekundäre Antikörper (Alexa Fluor meist konjugierte sekundäre Antikörper von Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) werden 1:500 in Blocking-Lösung verdünnt und für 4 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem schwankenden Plattform. </li><li> Berg Primordialschläuche auf Glasplättchen mit Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Primordialschläuche kultiviert mit dieser Methode die volle Ergänzung der beiden Haar-und Stützzellen (Abbildung 2). Haarzellen im gesunden Kulturen zeigen Runde nuklearen Profile von dünnen zytoplasmatischen Regionen, die Myosin-positiven 7a umgeben sind (Abbildung 2, oberes Feld). Stützzellen (markiert mit anti-Sox2) sind kleiner und dichter besiedelt als Haarzellen (Abb. 2, unten) verpackt. Adenovirus infiziert 25-50% der Stützzellen im Utriculus, und keine Haarzellen infiziert sind (Abbildung 2, Ad-GFP-Panels). Es sei darauf hingewiesen, dass die optimale Arbeitsbedingungen Titer jeder Adenovirus empirisch ermittelt werden müssen, da Haar Zelltod ist möglich, wenn der virale Titer zu hoch ist. Darüber hinaus werden die Regionen von mechanischen Beschädigungen (verursacht während der Dissektion) nehmen große Mengen an Virus. Diese Regionen einer mechanischen Beschädigung sind leicht zu erkennen durch eine durchgezogene Linie von Zellen mit sehr hohen GFP-Expression und fehlende Haarzellen. Dies steht im Gegensatz zu der gestreuten GFP-Expression in Stützzellen eines unbeschädigten Kultur (2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Utriculus Dissection. A:. Gehörkapsel (AB). B: Die Bulla ist gebrochen mit zwei stabilen Zange C: knöchernen Schnecke (RW = runde Fenster, S =. A. stapedia, C = Cochlea, ST = Stapes) D: A Skalpellklinge (SB) dient zum Abschalten der Spitze der Cochlea apikal des VIII. Hirnnerven (8 th N) ASC = anterioren Bogengangs E..: Die Herstellung ist fest mit einer # 3-Zange mit einer Gabel in die vordere Bogengang (ASC) und das andere auf der äußersten Knochen (Pfeile) eingesetzt gehalten wird. Das häutige Labyrinth wird mit einer Pinzette entfernt F:. Mit der häutigen Labyrinths entfernt, ist der basalen Windung des knöchernen Spiralblatt sichtbar in der Nähe des Hakens Region. Eine feine Sonde wird unter dieser knöchernen Regal eingefügt, um das Regal anheben und entfernen Sie sie (Pfeil) G:. Nach der Entfernung des Sacculus ist Utriculus (U) sichtbar unmittelbar neben dem Stapesfußplatte (SF) H:. Utriculus (U ) wird unter Verwendung eines # 55 Zange (Pfeil) SF = Stapesfußplatte I:.. Utriculus mit Otokonien (O) teilweise entfernt eind Sinnesepithel (SE) darunter sichtbar J:. Otokonien (O) aus des Schlauches mit einem Strom von Medien durch eine Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet geliefert entfernt. Der Schatten der Nadel (n) ist sichtbar am unteren Rand des Bildes K:. Utriculus mit Otokonien entfernt und Sinnesepithel (SE) sichtbar L:. Adenoviralen Infektion: je Utriculus (U) ist im Einzelfall auch von einer Mini platziert -Fach. Hintergrundinformationen Zellen mit Adenovirus durch Pipettieren Virus in dem Bohrloch (P = Pipettenspitze) infiziert. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. Adenovirus-vermittelte Infektion von Zellen unterstützen. Primordialschläuche wurden mit Adenovirus die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP-Ad) infiziert. Es zeigen konfokale Bilder der Haare Zellschicht und der unterstützenden Zellschicht im gleichen Bereich eines Schlauches. Haar-Zellen werden mit einem Antikörper gegen Myosin 7a markierten(Magenta). Hintergrundinformationen Zellen mit einem Antikörper gegen Sox2 (rot) markiert. Schema zeigt die Struktur des Utriculus Sinnesepithel und die Standorte der Haarzellen (HC) und Stützzellen (SC). Standorte der konfokalen (optisch) Abschnitte in der oberen (U) und unteren gezeigt (L) Platten sind durch gestrichelte Linien in der schematischen angegeben. Obere Platten: Bei der konfokalen Bilder auf der Ebene der Haare Zellkernen, scheint sich Ad-GFP-Signal in den Zwischenräumen zwischen Haarzellen und nicht mit dem Haar Zellmarker Myosin 7a überlappen. Untere Reihe: In konfokale Schnitte auf der Ebene der tragenden Zellkerne, kolokalisiert Ad-GFP-Signal mit der tragenden Zellmarker Sox-2. Ad-GFP-Infektion führt zu einer GFP-Expression in Stützzellen nur, und kein Haar Zellen infiziert. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Adenoviralen Infektion nicht mit dem Tod der Haarzellen oder Stützzellen führen. Utricles wurden mit Ad-GFP bei 4 × 10 8 PFU / ml infiziert. Primordialschläuche wurden mit Antikörpern gegen Myosin 7a (Haar-Zell-Marker) und Sox2 (mit Unterstützung für Zell-Marker) beschriftet. Haarzelle und Unterstützung Zellzahlen waren gleich zur Kontrolle Primordialschläuche und Ad-GFP infiziert Primordialschläuche.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sensorischen Haarzellen sind anfällig für den Tod von einer Vielzahl von Belastungen, einschließlich Altersstruktur, Knalltrauma, und der Exposition gegenüber ototoxischen Medikamenten, einschließlich der Aminoglykosid-Antibiotika und der Antineoplastikum Cisplatin verursacht. Bei Säugetieren Haare Zelltod führt zu permanentem Hörverlust und / oder Störung Gleichgewicht. In-vitro-Modellsysteme sind entscheidende Werkzeuge für das Studium an der Bestimmung der zellulären und molekularen Mechanismen, d...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medium 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Feinen Pinzette (# 55)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Feinen Pinzette (# 5)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetten (# 3)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillin G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fötales Rinderserum</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc Mini-Tablett</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex-Entkalker</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumborhydrid</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (polyklonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (monoklonal)</td&gt;<td&gt; Developmental Studies Hybridoma der Bank</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmodulin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabelle 1</strong&gt;. Reagenzien und Instrumente in Utriculus Kultur und Adenovirus-Infektion eingesetzt.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Hinweis: Ad-GFP wird normalerweise durch Vector Biolabs an einer Börse Titer von 1x10 zur Verfügung gestellt<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Wir baten um ein benutzerdefiniertes Verstärkung, um die Lager-Virus bei einem Titer von 1,2 x 10 liefern<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection

Schwerhörigkeit und Gleichgewichtsstörungen werden oft durch den Tod von mechanosensorischen Haarzellen, die die Sinneszellen im Innenohr verursacht werden. Da es keine Zelllinie, die zufriedenstellend für Säuger-Haarzellen setzt Forschung Haarzellen auf Hauptorgan Kulturen. Die in vitro-Modellsystem von reifem Säuger Haarzellen am besten charakterisierte verwendet Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen (1) 1-6. Der Utriculus ist ein Gleichgewichtsorgan, und die Haarzellen des Utriculus sind ähnlich in Struktur und Funktion der Haarzellen im Hörorgan, das Corti-Organ. Die erwachsenen Maus Utriculus Vorbereitung stellt eine reife Sinnesepithel für Studien über die molekularen Signale, die das Überleben, Homöostase und Tod dieser Zellen zu regulieren. Mammalian Haarzellen der Cochlea sind terminal differenziert und werden nicht regeneriert, wenn sie verloren sind. In Nicht-mammalischen Wirbeltiere, auditive oder vestibuläre Haarzelle der Tod durch robuste Regeneration, die Gehör und Gleichgewicht Funktionen 7, 8 wieder gefolgt. Haare Zellregeneration wird durch Glia-wie Stützzellen, die die basolateralen Oberflächen der Haarzellen in der Sinnesepithel 9, 10 Kontakt vermittelt. Stützzellen sind auch wichtige Mediatoren der Haarzelle Überleben und Tod 11. Wir haben vor kurzem eine Technik für die Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche Verwendung von Adenovirus entwickelt. Verwendung von Adenovirus Typ 5 (dE1/E3), ein Transgen enthält GFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors zu liefern, finden wir, dass Adenovirus-spezifisch und effizient infiziert Stützzellen. Unterstützende Zellinfektion ein Wirkungsgrad von ca. 25-50%, und Haarzellen nicht infiziert sind (Abbildung 2). Wichtig ist, finden wir, dass adenovirale Infektion von Stützzellen nicht in die Toxizität für Haarzellen oder Stützzellen führen, da Zellzahlen in der Ad-GFP-infektieren Primordialschläuche denen entsprechen, die in nicht-infizierten Primordialschläuche (Abbildung 3). So Adenovirus-vermittelten Genexpression in Stützzellen des kultivierten Primordialschläuche ist ein leistungsstarkes Tool, um die Rollen von Stützzellen als Vermittler der Haare das Überleben der Zelle, Tod und Regeneration zu studieren.

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Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Mechanosensorischen Haarzellen sind die Sinneszellen des Innenohres. Der am besten charakterisierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell-System von Säugetieren reifen Haarzellen nutzt Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen. Wir präsentieren die Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus, und wir zeigen Adenovirus-vermittelte Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche.

Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.7K Aufrufe.  Medical University of South Carolina. Mechanosensorischen Haarzellen sind die Sinneszellen des Innenohres. Der am besten charakterisierte In-vitro- Modell-System von Säugetieren reifen Haarzellen nutzt Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen. Wir präsentieren die Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus, und wir zeigen Adenovirus-vermittelte Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche.

Serie: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Erwachsenen Maus DRG Explant und distanzierte Zellmodelle um Neuroplastizität und Antworten auf ökologische Beleidigungen einschließlich Virusinfektion zu untersuchen

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion

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