דון מסרק

<html> 1. אנזימתי deglycosylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינורות PCR כדי להקטין את איבוד המים בשל התאדות. תווית אחת מערכת של צינורות 1-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה חיץ G7 10X, 10X החיץ גליקופרוטאין denaturing, ושל 10% NP-40 ו לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב את תוכנו. שמור בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האנזים בקבוקונים המכילים על הקרח. נסו למזער את ההפשרה / ההקפאה מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את תכולת הבקבוקון hCGβ (150 מיקרוגרם) ב 600 μl של DH 2 O ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל של חיץ 1X G7 על ידי דילול המניות 10X ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 0.5 μl של PNGase F במאגר μl 25 G7 1X ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת exoglycosidase (EG לערבב) על ידי שילוב של 2 μl כל α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1 Galactosidase-3, ו α1-3, 6 Galactosidase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צינורות PCR כמצוין: </li></ol>AK &quot;&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube / מדגם # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> גליקופרוטאין 10X Denaturing הצפת </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינורות, מערבבים בעדינות ומניחיםthermocycler, לסגור את המכסה לפגל את החלבונים על ידי דוגרים 10 דקות 94 ° C, ואחריו להחזיק 4 מעלות צלזיוס (באמצעות צינורות PCR ב thermocycler מאוד ומונע אידוי בדגימות נפח קטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מן thermocycler ו צנטריפוגות כדי להסיר כל התעבות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ריאגנטים הבאים כמצוין: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמה # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> מאגר ה-G7 10X </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 &amp; mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 1:50 דיל. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Deglycosylation Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> לערבב EG </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> התגובה סך vol. </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l &lt;/ Td&gt; <td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td></tr></tbody></table><ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינורות באמצעות PCR כובעים חדשים (להשליך את אלה המשמשים מאז הם לא מתאימים כמו שצריך אחרי מחזור אחד הדגירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את הצינורות על ידי הקשה 4 פעמים ואז לסובב את התוכן כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות thermocycler ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לאחר מכן לקרר את דגימות עד 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE של דגימות deglycosylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 130 μl טרי חיץ 3X הפחתת SDS טוען ידי הוספת 4 μl של DTT 1.25M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12.5 μl של החיץ מוכן 3X SDS הפחתת העמסה לטעום כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינורות עם כובעים חדשים לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות thermocycler על 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 30 μl של המדגם כל 10 μl של הסמן חלבון על ג&#39;ל טריס-גליצין 10-20%. שמור את שארית המדגם עבור חלק 3.1. טען 10μl של דה מרקר ColorPlus חלבון Prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese את הג&#39;ל על 130 וולט בטמפרטורת החדר עד הכניסה לצבוע קרוב לתחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ג&#39;ל סיימה ריצה, להסיר את הג&#39;ל של השחקנים ולמקם אותו בתוך קופסת פלסטיק קטנה עם מספיק Coomasie כתם כחול על מנת לכסות את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל למשך שעה 1 עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל שלוש פעמים במשך 30 דקות ב 50 מ&quot;ל של תמיסת destain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונות באמצעות transilluminator אור לבן או סורק. לחלופין, ג&#39;ל יכול להיות מיובש בין דפי צלופן בתוך מסגרת. </li></ol> 3. Pro-Q אמרלד 300 לגילוי של חלבונים glycosylated ב SDS-PAGE ג&#39;לים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל הג&#39;ל ב 2.1), עומס יתר של הדגימות על הג&#39;ל טריס-גליצין 10-20%. טען 10 &amp; mu; L של דה מרקר חלבון ColorPlus Prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הג&#39;ל פועל לפרק את מגיב Pro-Q אמרלד עם DMF ולהכין את תקן מלאי, שטפי ואת חמצון פתרונות אמרלד Pro-Q 300 כתם הבאים במדריך מוצר המסופק עם הערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אלקטרופורזה תושלם, להסיר את הג&#39;ל מתוך יצוק למקם אותו בתוך קופסת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הג&#39;ל על ידי הוספת 100 מ&quot;ל של הפתרון לתקן ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל עם 100 מ&quot;ל של הפתרון לשטוף עבור 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בהתרגשות גוי. חזור על לשטוף עם פתרון לשטוף טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמצן את הפחמימות על ידי דוגרים את הג&#39;ל עם תסיסה עדינה במשך 30 דקות ב 25 מ&quot;ל של חמצון פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל כמתואר בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הוא ג&#39;ל כביסה להכין טרי Pro-Q אמרלד 300 כתם על ידי הוספת 500 μl של הפתרון Pro-Q 300 מגיב אמרלד מומס צעד 3.2 ל 25 מ&quot;ל שלמכתים חיץ המסופק בערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל על ידי הוספת 25 מ&quot;ל של הכתם מוכן בשלב 3.8 ו דוגרים בחושך עם תסיסה עדינה במשך 90 עד 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שני השלבים המתוארים לשטוף צעד 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונות עם transilluminator UV ב 300nm. השתמש בסמן 80 kDa, אשר מסומן עם Pro-Q אמרלד גרין, לחפוף את התמונה UV לתמונה אור לבן של הג&#39;ל המציגה את הסולם prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את התמונות של הג&#39;ל מוכתם Coomasie בשלב 2.10 עם ג&#39;ל האזמרגד Pro-Q מוכתם משלב 3.11. </li></ol> 4. נציג תוצאות השינויים הגירה חלבון לאחר deglycosylation האנזימטית מוצגות באיור 2. השווה את מדגם הביקורת (לוח א &#39;, מסלול 1) עם הטיפול F PNGase (הסרת N-glycans, מסלול 2), מערבבים Deglycosylation (PNGase F; פלוס אנדו ו exoglycosidases להסיר O-glycans, מסלול 3). הפחתה נוספת לאבגודל נתפס לאחר עיכול עם glycosidases נוספים (מסלול 4). מלבד שינוי המוני, להקות להיות חדה כמו glycans יוסרו. הלהקה פועלת תחת סמן 17 kDa (כוכבית) מייצג את (MW: 16 KDA) deglycosylated מלא hCGβ פוליפפטיד. להקות אחרות שאולי נובעות deglycosylation שלם או את החלבונים מזוהה מרובים הנוכחי במדגם hCGβ (ראה מסלול 1). Lanes 5-7 (שולטת) להראות את להקות המתאימים glycosidases. מכתים גליקופרוטאין ידי אמרלד גרין מוצג בלוח זה ב מגיב oxidizes וכתמים כל glycans נוכח מולקולת חלבון. לכן עוצמת האות יורדת ככל hCGβ הוא deglycosylated enzymatically (מסלול 1 לנתיב 4). האות שיורית במסלולים 3 ו -4 להעיד על נוכחות של מוטיבים glycan, אשר עמידים בפני אנזימים בשימוש. Glycosidases נוספים המשמשים במסלול 4 להסיר שאריות כמה סוכר נוסף: ההגירה חלבון זהה, אבלירידה קלה בעוצמה של מכתים ניתן לראות. Moieties סוכר עמיד לא נכחו כל מיני חלבון: כמה להקות לא היו מזוהים על ידי אמרלד גרין (נעדר בתמונה UV, בסוגריים), המציין שהם deglycosylated בהרחבה. נתונים נוספים תומכים למסקנה hCGβ glycosylated הוא הטרוגני. הלהקה נמוך על מסלול 2 (חץ) הוא קלוש על התמונה אמרלד גרין, בעוד הלהקה העליון על מסלול 2 הוא בהיר, המציין כי הרבה קבוצות glycans עדיין קיימות. נתונים אלו מחזקים את המסקנה כי hCGβ רקומביננטי לידי ביטוי בתאים העכבר מכיל glycoforms מספר 9. אלה glycoforms שונים הן בשל ההטרוגניות הטבועה glycosylation שם כמה פוליפפטידים לא מקבלים glycan בכל אתר הסכמה ו / או כמה glycans מורחבות וחלקם אפילו על אותו חלבון לא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> באיור 1.Glycosylation דפוסים אופייניים המופרשים או גליקופרוטאינים על פני קרום התא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> 2. איור SDS-PAGE ג&#39;לים מראה deglycosylation האנזימטית של hCGβ. לוח מראה כתמים כחולים Coomasie תוך לוח B מראה את התוצאות של Pro-Q אמרלד 300 עבור להדמיה של חלבונים glycosylated. מספר דוגמאות: 1, שליטה hCGβ; 2, PNGase F העיכול; 3, מערבבים העיכול Deglycosylation: 4, מערבבים Deglycosylation פלוס עיכול exoglycosidases, דגימות 5-7 הם שולטת מגיב (O-Glyc, O-Glycosidase; GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Fucosidase גל / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, neuraminidase; PNGase; F PNGase)

<ol>
	<li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation:+nature,+distribution,+enzymatic+formation,+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds.">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li><li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease.">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li><li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins.">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li><li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding,+form+and+function.">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li><li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit.">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li><li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF.">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li><li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+&#945;1-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue.">Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached &#945;1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li><li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity.">Novel endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li><li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li><li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes.">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li><li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine.">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of Glycobiology. , (2008).</li></ol>

המחברים הם מועסקים על ידי ניו אינגלנד Biolabs, המייצר חומרים כימיים רבים המשמשים במאמר זה.

השיטה המתוארת כאן על ידי שימוש deglycosylation האנזימטית SDS-PAGE יכול לספק מידע רב ערך על מצב glycosylation של חלבון של עניין, בעוד glycan ספציפי ריאגנטים להקל על הפרשנות של הנתונים. פרוטוקול זה מיועד המחקרים הראשוניים של glycosylation חלבון זה מתאים במיוחד עבור הפרשה ואת גליקופרוטאינים בממברנה של בתאי יונקים: האנזימים נבחר במקרה הזה יהיה דווקא להסיר את כל N-glycans, ו או N-glycans פלוס ואת סוכרים הנפוצים ביותר הארכת ויוצרים הליבה של O-glycans. Glycosidases יש את היתרון הנוסף של להיות קלה, בהשוואה לשיטות deglycosylation כימיים, תוך שמירה על שלמות עמוד השדרה הן סוכרים וחלבונים. כדי להבהיר את תפוסת (אשר חומצות אמינו הן glycosylated), היקף glycosylation, או על מנת לקבוע את המבנה העדין של glycans, טכניקות מתוחכמות יותר, כגון מ &#39;ספקטרומטריית התחת, כרומטוגרפיה נוזלית או NMR נדרשים. בגלל הפשטות שלו, מספר צעדים בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם, להחליף ו / או בשילוב כדי להתאים לצרכים ניסיוניים שונים. עם זאת, על מנת להשיג תוצאות כי ניתן לפרש בבירור חשוב להבין את נקודות החוזק שלו ואת המגבלות. ראשית, סגוליות וטוהר glycosidases הם קריטיים: אנזימים היטב מאופיין רק נבדק להשתחרר פרוטאזות ופעילויות מזהמים אחרים יש להשתמש. למרבה הצער, אין תקן יחידת אנזים הגדרה glycosidases: המשתמש צריך לקבוע את התחליף המתאים על פי מפרט של היצרן. שנית, בחירה זהירה של זיהוי צורך: א) מכתים ריאגנטים חלבון שימושיים רק אם תוצאות deglycosylation בשינוי משמעותי מסה מולקולרית. תוצאה כזו ברורה כפי שמוצג כאן לא מתקבל תמיד. במקרים אחרים, שראינו mi נורמליgration לאחר deglycosylation (רחוק משקל מולקולרי חזה, או אפילו הגירה איטי יותר). תופעה זו אינה מובנת היטב, אך ניתן לומר כי כל שינוי הגירה ראיות כי החלבון כבר deglycosylated. ב) זיהוי סוכר עם נוגדנים מציבה אתגרים ייחודיים הגבלת התחולה שלהם. זה כבר קשה מאוד כדי ליצור כללי אנטי glycan נוגדנים, הם גדלים בדרך כלל נגד יעד glycan מורכבים, אשר מגבילה את השימוש בהם. יתר על כן, מספר חד שבטיים נוגדנים נגד glycan להציג תגובתיות לחצות רצויים 10. ג) לקטינים (חלבונים עם סוכר זיקה מהותית) מתאימים היטב לאיתור סוכר, ובנוסף הם נותנים תובנה על מבנה glycan. עם זאת, לא כולם יש סגוליות צר; רבים מאופיינים באופן חלקי בלבד (כלומר, הם יכלו זיקות לא ידוע). בתור מכתים חיובי תוצאה מספקת לקטינים, אינדיקציה לא הוכחה, נוכחותם של given סוכר. ד) ערכות כימית תיוג (מבוסס על periodate חמצון של סוכרים) הן את שיטת הבחירה להכתים את כל גליקופרוטאינים, ומתאים וכך גם לעקוב deglycosylation. כאשר עיבוד מדגם לא ידוע, זהו תרגול טוב כדי לכלול שולטת גליקופרוטאין. Fetuin הוא N זמינים - ו - O-גליקופרוטאין, גונדוטרופין כוריוני (הן יחידות משנה) היא גם בחירה טובה. שור אלבומין (BSA) יכול לשמש כביקורת שלילית. עם זאת, יש לציין כי חלק לא glycosylated חלבונים להגיב עם מעט אמרלד Pro-Q 300, במיוחד כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים. Non-glycosylated סטנדרטים משקל מולקולרי, כגון סמן את החלבון prestained שימוש בפרוטוקול זה, יש את היתרון של הצגת להקות חדה. רק במקרה אחד של החלבונים האלה (80 KDA) תגובתי Pro-Q אמרלד 300. לכן, ייתכן שהמשתמש רוצה להפעיל סולם רגיל גליקופרוטאין במקום, כמו קנדי ​​מ-Cane Invitrogeהערה לבסוף, זיהוי פשוט ג&#39;ל של גליקופרוטאינים nucleocytosolic (אשר שונה עם אחד O-GlcNAc) אפשרי עם שימוש של נוגדנים חד שבטיים, יחד β-N-Acetylglucosaminidase שליטה סגוליות 11. התיאור של טכניקה זו היא מעבר היקפו של מאמר זה, אבל זה צריך להיות כאמור glycosidases הם כלי שימושי לחקר גליקופרוטאינים אחרים glycoconjugates רבים הנמצאים בתאים. טיפול מקיף של כל הצורות הידועות של glycosylation ניתן למצוא במהדורה השנייה של &quot;יסודות של glycobiology&quot;; מקוון חינם בכתובת מדף הספרים צמח השדה (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> האדם β גונדוטרופין כוריוני </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> מנורות ה-PCR </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0704 </td><td> מסופקים עם חוצצי </td></tr><tr><td> Deglycosylation חלבון מערבבים </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P6039 </td><td> מסופקים עם חוצצי </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0734 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> α1-2 Fucosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0724 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> α1-3, 6 Galactosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0731 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> β1-3 Galactosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0726 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> מאגר 10X ה-G7 (500 סודיום פוספט mM) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> גליקופרוטאין הצפת 10X Denaturing (5% SDS, 400 מ&quot;מ DTT) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> 3X SDS טוען חיץ (187.5 mM טריס-HCl pH 6.8, SDS 6%, 30% גליצרול, ברום 0.03%ophenol כחול) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B7703 </td><td> מסופקים עם 1.25M DTT </td></tr><tr><td> ColorPlus Prestained מרקר חלבון </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% טריס-גליצין Multigel </td><td> קוזמו ביו ושות </td><td> DCB-414893 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרופורזה קלטת יחידה </td><td> קוזמו ביו ושות </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> Power Supply אלקטרופורזה EPS 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q אמרלד 300 גליקופרוטאין כתמים Kit </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> בריליאנט בלו R </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP System </td><td> תא Biosciences </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification and characterization of protein glycosylation using specific endo- and exoglycosidases

Glycosylation, תוספת של סוכרים קשורים קוולנטית, הוא שינוי חשוב שלאחר translational של חלבונים יכול להשפיע באופן משמעותי על תהליכים כגון הידבקות התא, סחר מולקולרית, אישור, ואת הולכת אותות 1-4. ב אאוקריוטים, את השינויים glycosylation הנפוץ ביותר במסלול הפרשה הן תוספות ב asparagine שאריות הקונצנזוס (N-linked); או סרין או תראונין שאריות (O-linked) (איור 1). ייזום סינתזה של N-glycan נשמרת מאוד אאוקריוטים, בעוד מוצרי קצה יכולים להשתנות במידה רבה בין המינים, רקמות שונות, או חלבונים. Glycans חלקם יישארו ללא שינוי (&quot;גבוה מנוז N-glycans&quot;) או עיבוד נוסף של Golgi (&quot;מורכב N-glycans&quot;). המגוון הגדול נמצא עבור O-glycans, אשר מתחיל עם משקע משותף (GalNAc) N-Acetylgalactosamine בתאים חיים, אך נבדלים אורגניזמים נמוכה 1. אף אוזן גרון &quot;&gt; ניתוח מפורט של glycosylation של חלבונים הוא תחום בפני עצמו ודורש משאבים רבים ומומחיות כדי לבצע כראוי. עם זאת מגוון רחב של אנזימים זמין להסיר סוכרים (glycosidases) מאפשר לקבל מושג כללי על המצב של glycosylation . חלבון במעבדה הגדרה סטנדרטית כאן אנו מדגימים את השימוש glycosidases לניתוח גליקופרוטאין מודל:. רקומביננטי גונדוטרופין כוריוני אנושי בטא (hCGβ), אשר מחזיקה שני N-glycans וארבעה O-glycans 5 הטכניקה פשוטה דורשת רק מכשור וחומרים מתכלים טיפוסי, והוא יכול להתאים בקלות ניתוח של דגימות גליקופרוטאין מרובים. מספר אנזימים יכול לשמש במקביל מחקר גליקופרוטאין. PNGase F הוא מסוגל להסיר כמעט את כל סוגי N-linked glycans 6,7. עבור O-glycans, אין אנזים זמין לדבוק יכול oligosaccharide שלמים מתוך הדואר עמוד השדרה חלבון. במקום זאת, O-glycans הם גזומים ידי exoglycosidases לליבה קצר, אשר לאחר מכן להסיר בקלות על ידי Glycosidase-O. מערבבים Deglycosylation חלבון מכיל PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase, ו β-N-Acetylglucosaminidase. הוא משמש בו זמנית להסיר N-glycans וכמה O-glycans 8. לבסוף, מערבבים את Deglycosylation נוספו בתערובת של exoglycosidases אחרים (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו β1 Galactosidase-3), אשר מסייעים להסיר מונוסכרידים עמידים אחרת זה יכול להיות נוכח בטוח O-glycans. SDS-PAGE/Coomasie הכחול משמש כדי להמחיש הבדלים הגירה חלבון לפני ואחרי הטיפול glycosidase. בנוסף, סוכר ספציפי שיטה מכתים, ProQ אמרלד-300, מראה אות פחתה כפי glycans הם succeהוסר ssively. פרוטוקול זה מיועד לניתוח של כמויות קטנות של גליקופרוטאין (0.5-2 מיקרוגרם), למרות deglycosylation האנזימטית וניתן לשנותם עד כדי להכיל כמויות גדולות יותר של חלבון לפי הצורך.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases at JoVE.com

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג&#39;ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

identification-characterization-protein-glycosylation-using-specific

Research

JoVE Journal

Biology

36.4K Views.  New England Biolabs. שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג'ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.

Video: Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing לזיהוי ואפיון חיידקים

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.