חומרים ושיטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני שמרים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הזנים המשמשים במחקר זה מבוססים על רקע BY4742. זן השליטה SILAC (מחצלת, his3, leu2, ura3, lys2 ו arg4: G418) נעשתה על ידי הזדווגות arg4 זן המחיקה (מחצלת, his3, ura3, leu2 ו arg4: G418) כדי BY4742 (מאט אלפא, his3, leu2, ura3 ו lys2), ואת haploids meiotic התקבלו על ידי לנתיחה הטטרדה. לכן, את המתח שליטה auxotroph עבור ליזין ארגינין. זן הפיתיון נעשה על ידי רקומבינציה הומולוגיים PCR בתיווך באמצעות וקטור pBS1479. לכן, תג epitope השתמשו במחקר זה הוא טיהור זיקה טנדם (TAP) תג (3). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SILAC: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן השליטה SILAC היה גדל בתקשורת הנשירה מינימלי בתוספת 98% L-ליזין-4 ,4,5,5-D4 (0.03 g / L, קיימברידג&#39; איזוטופ) ו 98% L-ארגנין-13 C 6 (0.036 גרם / L, קיימברידג&#39; איזוטופ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן הפיתיון היה גדל במדיום עשיר קבוע עם נורמלי חומצות אמינו איזוטופי. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב ראשון של טיהור TAP [פרוטוקול זה מותאם ממעיין הקרה הרבור מעבדה כמובן ידנית (4)] ** בלילה שלפני מרגמה טיהור שלך מראש צמרמורת, ועלי ב -80 ° C במקפיא. כמו כן, מראש צמרמורת הגביע ב -20 ° C ** בצע מאגרים אלה ממש לפני השימוש (עבור L 1 של התרבות): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 מ&quot;ל NP-40 חיץ עם PIC 25 μl (1 / 2000), 50 μl של DTT 1M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;ל של חיץ NP-40 עם 1 / 200 PIC, 50 μl של 1M DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ל של TeV-C חיץ עם PIC 1 / 2000, 10 μl של 1 M DTT </li></ul></li></ol> SILAC והכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 1L כל זן את הפיתיון השליטה זן בנפרד OD 600 = 1.0-1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תרבות 500ml צינורות Nalgene צנטריפוגות. מאזן את העומס ותאי גלולה ב 2580X g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג מדיה resuspend גלולה עם 50 מ&quot;ל של קר DH 2 O תוך העברת התאים 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגות. גלולה תאים. ** ניתן להקפיא את גלולה ב -80 ° C ** </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ** ** חשוב להתאים את התרבות זן לשלוט לתרבות הפיתיון המתח 01:01 על ידי גלולה משקל יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל תא גלולה ב 10 מ&quot;ל של חיץ NP-40 עם קוקטייל 1 / / 2000 מעכבי פרוטאז (PIC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שתי התרבויות תא decanting ישירות על ידי שפופרת אחת לשנייה. שחיקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את נוזלי N 2 לתוך מרגמה מראש צינן את ולאפשר לו להתאדות לגמרי. הוסף 2 מ&quot;ל של תאים מרגמה בתנועה מעגלית. יוצקים מעט נוזלי N 2 להקפיא את התאים. טוחנים את התאים עד התאים להיות אבקה דקה. חזור על התהליך עד שכל התאים הקרקע. ** אל תאפשר התאים להפשיר. הוסף נוזלי N 2 בעת הצורך ** </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את אבקת כוס מי קרח ו להפשיר בטמפרטורת החדר. כאשר הקצוות מתחילים להפשיר, להוסיף 20 מ&quot;ל של חיץ NP 40-PIC עם 1 / 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת lysate גולמי של 40 מ&quot;ל צינורות Nalgene. ספין על xgfor 39,000 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, לקחת 300 μl של חרוזים Sepharose 2B (GE). לשטוף את החרוזים 300 μl של חיץ NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 פעמים. Resuspend את החרוזים חיץ 300 μl כך שהם slurry 01:01. טרום ניקוי התא lysate </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לצינור חדש ולהוסיף את החרוזים 2B Sepharose. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, לקחת 300 μl של IgG Sepharose 6 חרוזים (GE). לשטוף את החרוזים 300 μl של חיץ NP-40 (1 / 2, 000 PIC) 3 פעמים. Resuspend את החרוזים חיץ 300 _l כך שהם slurry 01:01. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה את החרוזים. מעבירים את supernatant לצינור חדש. ** שמור aliquot של lysate התא עבור המערבי סופג מאוחר יותר ** הכבילה למעסיק חרוזים IgG sepharose </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החרוזים 2B Sepharose על ידי צנטריפוגה. מוסיפים את החרוזים IgG (הכין בעבר slurry 1:1). הפרד את התוכן לשני צינורות עבור מחייב יותר יעיל. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את החרוזים. ** שמור aliquot סיעת מאוגד ** </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חרוזים חיץ 10 NP-40 מ&quot;ל (1 / 2, 000 PIC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים עם 3 מ&quot;ל TeV-C חיץ (1 / 2, 000 PIC). ** שמור aliquot של החרוזים. זה ישקף את היעילות של ** מחייב משחררי מן החרוזים IgG ידי מחשוף פרוטאז TeV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של AcTEV למאגר 1ml של TeV-C (עם PIC 02/01 000,). לאחר ערבוב, להפריד את התוכן לשני צינורות 1.5 מ&quot;ל Eppendorf יותר ערבוב יעיל. לדגור על פלטפורמה מסתובבת בחדר קר הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים העברת eluate לצינור 1.5-מ&quot;ל טריים. שטפו את החרוזים עם 0.5 מ&quot;ל נוספים של TeV-C חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את elaute בצינור אחד. היית צריך 1.5 מ&quot;ל של eluate בסך הכל.** שמור aliquot של eluate TeV ** חומצה Trichloroacetic (TCA) precipatation (לניתוח ספקטרומטריית מסה מבוססות, אנו ממליצים להשתמש EtOH / משקעים אצטט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם aliquots 25% TCA עם 100% TCA. כדי לעשות זאת, להפריד את eluate 1.5 מ&quot;ל לתוך 2 צינורות של μl 750 כל אחד. הוסף 250 μl של 100% TCA אל הצינור. הפתרון שלך צריך להפוך חלבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על קרח למשך 30 דקות עם vortexing תקופתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במהירות מקסימלית בצנטריפוגה שולחן בראש בחדר קר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם 500 μl של אצטון קר כקרח המכיל 0.05 N HCl ו - ספין של 5 דקות במהירות מקסימלית (חדר קר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם 500 μl של אצטון קרים כקרח ספין 5 דקות על מקסימום (חדר קר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות אצטון גלולה יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים כסף, resuspend את הכדור ב 50 μl של חיץ מדגם SDS 1X. EtOH / אצטט precipatation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מיקרוגרם של גליקוגן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל דגימות 5X עם EtOH 100% להסתגל 50 מ&quot;מ נ&quot;ך 3 COO עם מלאי M 2.5, pH 5.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stand הפתרון 2hr </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה זירז חלבון על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות על 12,000 X גרם בטמפרטורת החדר. </li></ol> NP-40 חוצץ (עבור 200 מ&quot;ל) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> במלאי ריכוז </td><td> להוסיף </td></tr><tr><td> 10 mM נתרן זרחתי חיץ (pH 7.2) </td><td> 0.1 מ &#39; </td><td> 20 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1% NP-40 </td><td> 100% </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;מ NAF </td><td> 1 M </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.1 mM Na 3 VO 4 </td><td> 10 mM </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> נפח עד 200 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> ADD לפני השימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 1, 000 של 1 M DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 2, 000 של PIC (קוקטייל מעכבי פרוטאז) </li></ol> TeV-C חוצץ (עבור 50 מ&quot;ל) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> במלאי ריכוז </td><td> להוסיף </td></tr><tr><td> 25 מ&quot;מ טריס (pH 8.0) </td><td> 100 מ&quot;מ </td><td> 12.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 3.75 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.1% NP-40 </td><td> 100% </td><td> 50 _l </td></tr><tr><td> 0.5 mM EDTA </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 50 __l </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> נפח עד 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> ADD לפני השימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 1, 000 של 1M DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 / 2, 000 של PIC </li></ol>

<ol>
	<li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization.">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .</li><li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics.">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 .</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 .</li><li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Yeast+Genetics.">Methods in Yeast Genetics.</a> , 123-125 .</li></ol>

Aliquots הציל במהלך ההליך טיהור צריכה לכלול (1) מראש פינה lysate התא, (2) חלק מחויב, (3) חלק מאוגד, ו (4) חלק eluted. אנו ממליצים על ניתוח תוכן של חלבון aliquots לעיל על ידי המערב סופג באמצעות נוגדן אנטי מכתים TAP או כסף כדי לשקף את היעילות מחייב משחררי הניסוי. דוגמאות של ג&#39;ל מוכתם כסף כתם מ?...

identification of protein complexes with quantitative proteomics in s. cerevisiae

ליפידים הם אבני הבניין של ממברנות הסלולר המתפקדים מחסומים ועל מידור של תהליכים תאיים, ולאחרונה, כפי חשוב מולקולות איתות תאיים. עם זאת, בניגוד חלבונים, שומנים הם מולקולות הידרופוביות קטנות תעבורה בעיקר על ידי נתיבי nonvesicular תיאר גרוע, שהם שיערו להתרחש בכל מגע אתרים קרום (MCSs). MCSs הם אזורים שבהם reticulum endoplasmic (ER) עושה מגע פיזי ישיר עם אברון משתפת פעולה, למשל, פלזמה הממברנה (PM). החלק המיון של ER-PM MCSs הוא מועשר ב שומנים לסנתז אנזימים, טוען כי סינתזה השומנים מופנית לאותם אתרים רומז כי MCSs חשובים תנועה השומנים. שמרים הוא מודל אידיאלי ללמוד ER-PM MCSs בגלל השפע שלהם, עם למעלה מ 1000 אנשי קשר לכל תא, טבע נשמרת שלהם כל אאוקריוטים. חשיפת חלבונים המהווים MCSs הוא קריטי כדי להבין כיצד תנועה שומנים נעשית בתאים, וכיצד הם פועלים כמו מולקולות איתות. מצאנו כי ER נקרא Scs2p למקם את ER-PM ו MCSs חשוב היווצרותם. אנו מתמקדים בחשיפת השותפים המולקולרי של Scs2p. זיהוי של קומפלקסים חלבונים מסורתי מסתמך על הראשון לפתרון דגימות חלבון מטוהרים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה, ואחריו עיכול ג&#39;ל של להקות החלבון ואנליזה של פפטידים על ידי ספקטרומטריית מסה. זה לעתים קרובות מגביל את לימוד בקבוצה קטנה של חלבונים. כמו כן, קומפלקסים חלבונים נחשפים denaturing או לא תנאים פיזיולוגיים במהלך ההליך. כדי לעקוף את הבעיות הללו, יישמנו בקנה מידה גדול טכניקה proteomics כמותיים כדי לחלץ נתונים משוחדת לכמת. אנו משתמשים תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) לשלב גרעינים איזוטופ מצרך חלבונים זן פקד לא מתוייגת. כמויות שוות של התרבות מתויג לא מתוייגת, תרבות SILAC שכותרתו מעורבבים יחד lysed על ידי שחיקה של חנקן נוזלי. לאחר מכן, אנו לבצע הליך טיהור זיקה לנתץ קומפלקסים חלבונים. לבסוף, אנו לזרז את המדגם חלבון, שהוא מוכן לניתוח על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי / ספקטרומטריית מסה טנדם. והחשוב מכל, חלבונים זן הבקרה מסומנים על ידי האיזוטופ הכבד יהיה לייצר שינוי מסה / מטען, כי ניתן לכמת נגד חלבונים ללא תווית בזן את הפיתיון. לכן, מזהמים, או מחייב נוקבים ניתן לבטל בקלות. על ידי שימוש בגישה זו, זיהינו חלבונים הרומן מספר למקם את ER-PM MCSs. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הגישה שלנו.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae at JoVE.com

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

identification-protein-complexes-with-quantitative-proteomics-s

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University of British Columbia - UBC. כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

Video: Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...