חומרים ביולוגיים הם מולקולות אמפתיות פעילות על פני השטח המיוצרות על ידי מיקרואורגניזמים שיש להם את היכולת להפחית את מתח הפנים של הנוזל ואת המתח הבין-פיזיאלי בין שני שלבים שונים. האופי האמפתי של מולקולות אלה מאפשר להן ליישר את עצמן בממשק שבין שני שלבים שונים, ולהגביר את הסולוביזציה של פאזה אחת לאחרת. חומרים ביולוגיים צוברים תשומת לב רבה בהשוואה למקבילותיהם הכימיות בגלל יתרונות שונים שהם מציעים.
אלה כוללים ספציפיות גבוהה יותר, רעילות נמוכה יותר, מגוון מבני גדול יותר, קלות הכנה, התמקרות ביולוגית גבוהה יותר, תאימות סביבתית גבוהה יותר שלהם ופעילותם בתנאים קיצוניים של סביבה. בסרטון זה אנו מדגימים את השיטות המעורבות בסינון, אפיון ויישום של חומרים ביולוגיים, המיוצרים על ידי זנים שונים של רודוקוקוס, ליסיניבאצילוס ופאניבקילוס. אנו ממחישים עוד יותר את השיטות להערכת היישום של שילוב של חומרים ביולוגיים, המיוצרים על ידי שלושת הזנים המיקרוביאליים הללו בהתאוששות של שאריות שמן על ידי טכניקת עמודי ארגז חול.
העבודה בוצעה בהנחייתם של ד"ר פראטי סריבסטבה וד"ר מנוג' קומאר. לצורך צמיחתם של מיקרובים, חסנו את הצלוחיות המכילות מאות מיליליטרים של ציר לוריה אוטוקלבי, על ידי הוספת מיליליטר אחד של תרבית זרעים שגדלה בן לילה לבקבוקון בתוך ארון זרימת האוויר הלמינרי. דגירה של הצלוחיות באינקובטור סיבובי בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך שבעה ימים.
לאחר השלמת תקופת הדגירה, לקצור את הצלוחיות, ולהעביר את מרק התרבות לצינורות הצנטריפוגה. צנטריפוגה את התרבות ב 4, 500 G במשך 20 דקות בצנטריפוגה מקוררת בארבע מעלות צלזיוס. יוצקים בעדינות את הסופרנטנט נטול התאים לתוך טרייה, והשתמשו בו בבדיקות סינון לייצור חומרים ביולוגיים.
להקרנת ייצור החומרים הביולוגיים על ידי בדיקת קריסת טיפה, קחו מגלשת זכוכית נקייה וציפו את פני השטח של המגלשה ב-200 מיקרוליטרים של שמן. כעת הוסיפו למרכז השמן 20 מיקרוליטרים של חומר-על נטול תאים, והשאירו אותו ללא הפרעה למשך שתיים-שלוש דקות. אם הטיפה קורסת, דרג את ה-supernatant positive עבור נוכחות של חומר ביולוגי.
בבדיקת התפשטות נפט, יש ליטול 20 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים בצלחת פטרי ולהוסיף 200 מיקרוליטרים של נפט גולמי על פני המים. כעת הוסיפו למרכז השמן 20 מיקרוליטרים של חומר-על נטול תאים, והשאירו אותו ללא הפרעה למשך דקה אחת. אם אזור סליקה נוצר כתוצאה מעקירת שמן, דרג את ה- supernatant חיובי עבור נוכחות של biosurfactant.
בבדיקת אינדקס תחליב, יש להוסיף ארבעה מיליליטרים של בנזין וסופרנטנט נטול תאים כל אחד לתוך צינור זכוכית נקי. ואז מה התערובת במרץ במשך שלוש דקות ולהשאיר אותה ללא הפרעה במשך 24 השעות הבאות. למדידת מתח הפנים של הסופרנטנט נטול התאים, נקו את כלי הזכוכית עם הנוזל שיש לקבוע את מתח הפנים שלו.
מוסיפים את הנוזל לכלי ומעלים את הכלי על מחזיק הכלי. פתח את מחזיק הבדיקה והעלה עליו את הגשושית. באמצעות הבקר הידני התאימו את גובה הפלטפורמה, כך שהגשושית תהיה במרחק של שניים עד שלושה מילימטרים מפני השטח של הנוזל.
לאחר מכן עבור לתוכנות ופעל לפי השלבים המוזכרים במאמר כדי למדוד את מתח הפנים. לאחר השלמת המדידה, הנמיכו את גובה הפלטפורמה ופתחו את הנעילה ושחררו את הגשושית ואת כלי השיט מהמכשיר. לצורך מיצוי של חומר ביולוגי, התאימו את ה-pH של סופרנטנט ללא תאים לשניים, באמצעות שתי חומצות הידרוכלוריות רגילות.
אחסנו את התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, מוסיפים נפח שווה של תערובת מתנול כלורופורם, ומערבבים במרץ במשך 20 דקות. השאירו את התערובת ללא הפרעה כדי שתתרחש הפרדה חופשית.
הסר את הפנים העליונות, המכילות מים ומתנול, והשאר את הפנים התחתונות המכילות חומר ביולוגי כדי להתאדות במכסה אדים. לאחר אידוי הפאזה האורגנית, יש לפענח מחדש את חומר הביו-surfactant בצבע דבש בשלושה מיליליטרים של כלורופורם, ולהשתמש בתערובת זו לאפיון וזיהוי של החומר הביולוגי. לאפיון כרומטוגרפי של הביו-surfactant המופק, יש לזהות 20 מיקרוליטרים של חומר ביולוגי על לוחות TLC.
לאחר ייבוש הצלחות, הניחו את צלחת ה-TLC בתוך התא הרווי בתערובת כלורופורם מתנול והפעילו את ה-TLC. לזיהוי שומנים, מוסיפים כמה גרגירים של יוד לחדר הטרי ומרווים את החדר במשך חמש עד 10 דקות. מקם את ה- TLC בתוך החדר והתבונן בפיתוח כתמים צהובים.
לזיהוי חלבונים ופחמימות, יש לרסס את צלחת ה-TLC ללא מימן או אניסלדהיד, ולחמם ב-110 מעלות צלזיוס ולהתבונן בפיתוח צבע. לניתוח NMR, הכנס את הצינור למפרש. התאם את גובה הצינור באמצעות צינור מותאם.
מקם את צינור ה- NMR, יחד עם מרחיב במכונת MR ובצע את השלבים המוזכרים במאמר כדי לקבל ספקטרום NMR. לניסוי משופר בהתאוששות שמן, קחו עמוד זכוכית ואטמו את השקע התחתון בצמר זכוכית וחרוזי זכוכית. גבה את העמוד עם אדמת סנדי באופן כזה שניתן להוסיף נוזל כלשהו בחלק העליון של הקרקע.
הר את העמוד על המחזיק והוסף כמה חרוזי זכוכית על גבי האדמה. הצפת את העמודה ב-50 מיליליטרים של תמיסת מלח ואסוף את הזרימה כדי לקבוע את הנפח הירוד. הסר את התמלחת מהעמודה על ידי אילוץ הנפט הגולמי לעבור דרכו.
אסוף את נפח התמלחת והשמן היוצאים מהעמודה כדי לקבוע את נפח רוויית השמן הראשונית. לאחר 24 שעות, הציפו את העמודה ב-10 נפחים גרועים של תמלחת, ואספו את השמן שיוצא מהעמודה כדי להעריך את התאוששות הנפט המשנית. השמן שנותר בעמודה לאחר התאוששות השמן המשני מתאים לשמן השיורי.
עכשיו להכין תערובת של biosurfactants על ידי הוספת biosurfactant שחולץ לכוס זכוכית. ולהוסיף את biosurfactant ואת התערובת לטור, ולהשאיר אותו ללא הפרעה במשך 24 השעות הבאות. לאחר 24 שעות, מדוד את כמות השמן והמים שרמזו מחוץ לעמודה כדי לקבוע התאוששות שמן נוספת או משופרת.
סופרנאטים נטולי תאים של שלושת הזנים המיקרוביאליים קיבלו ציונים חיוביים לנוכחות של חומרים ביולוגיים, שכן הם גרמו לקריסת טיפה, התפשטות שמן ויצירת תחליב. האישור על ייצור החומרים הביולוגיים ניתן על ידי מדידת מתח הפנים של המרק נטול התאים. עקב צמיחתם של רודוקוקוס וליסיניבצילוס, מתח הפנים של המדיום פחת מ-59 ל-45 מ"נ למטר.
בשל הצמיחה של paenibacillus, מתח הפנים של המדיום ירד מ 59 ל 28.4 mN למטר. מבחני יציבות תחליב הראו כי החומרים הביולוגיים המיוצרים על ידי שלושת הזנים המיקרוביאליים הפגינו יציבות רבה בתנאים מגוונים וסביבתיים. מדדי האמולסיה לא הראו שינוי משמעותי כאשר טמפרטורת הדגירה, ה-pH וריכוז המלח של המרק נטול התאים השתנו.
אפיון DLC של החומר הביולוגי המופק הראה כי חומרים ביולוגיים המיוצרים על ידי כל שלושת הזנים היו גליקוליפדים. זיהוי כימי של חומרים ביולוגיים הראה כי רודוקוקוס וליזינבאצילוס הפיקו את אותו חומר ביולוגי, שזוהה כרומנוליפיד, עם מסה של כארבעה 80 דלטונים. Paenibaccilus לעומת זאת, מייצר rhamnolipid המכיל שלוש שרשראות ליפידים עם מסה של כ 802 daltons.
השילוב של חומרים ביולוגיים היה מסוגל לשחזר 56.5% מהשמן השיורי מעמוד החול. נבדק ייצור ביו-surfactant מזני הרדוקוק, lsyinibaccilus ו-paenibacillus, והזנים קיבלו ציון חיובי לייצור ביו-surfactant. החומרים הביולוגיים שיוצרו אופיינו והזדהו כרומנוליפידים.
מאחר שהשילוב הביו-surfactant הצליח לשחזר 56% מהשמן השיורי בטכניקת חבילת חול, ניתן להשתמש בשילוב הביו-surfactant ביישומי שדה כדי לשחזר את שאריות הנפט שנלכדו בתוך מאגרי הנפט.
