החוקרים נתמכים על ידי כוכב * של סינגפור. בנוסף, עמיתי ירושלים נתמך על ידי מלגה * STAR הלאומית למדע, לוריאל למען נשים במדע הלאומי ואת אחוות לי קואן יו פוסט דוקטורט מלגה. YR נתמך על ידי NIH המקודדים מענקים (R01 HG004456-01 ו-R01 HG003521 01). החוקרים גם להכיר את צוות videography של 8 הפקות פיקסלים, סינגפור, במיוחד מר קלווין איסיי, מר צ&#39;אנג קאי שיאנג ומר שרווין גן לצילום הקלעים, גב &#39;Siti רחים עבור עריכת וידאו ו גב&#39; מישל עבור Teo קריינות.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Chia-PET היא שיטה שפותחה כדי לזהות ארוכי טווח אינטראקציות ויסות שעתוק. אחד הגורמים הקריטיים הקובעים את איכות ספריית Chia-PET הוא איכות החומר שבב. פרוטוקול רואים בסרט משלבת את השימוש EGS ו פורמלדהיד לחצות קישור תאים. השימוש של פורמלדהיד, בשילוב עם מגיב cross-linking 2 נושאת זרוע spacer עוד עשוי לסייע מחייב של חלבונים אשר לא יכול היה להיות מחויב פורמלדהיד לבד 3,11,15. בנינו ספריות בשיטה זו אשר הוכיחו אתרי הקישור חזקים ארוכי טווח אינטראקציות 9. עם זאת, cross-linking ותנאי שבב צריך להיות מותאם עבור כל גורם של עניין, וזה חשוב לא יתר על המידה crosslink כמו יותר מדי cross-linking תגרום קשיים הפיצול על ידי sonication, ואולי ואולי לגרום אינטראקציות הכרומטין מזויף . הכרומטין אינטראקציותמזוהה על ידי Chia-PET יש תוקף בשיטה אחרת, כמו הכלאה באתרו הקרינה 4. אנו ממליצים על מינימום של 100 ng חומר הכרומטין. בעוד בנינו ספריות באיכות טובה מ 50 ng של חומר הכרומטין, ראינו כי כמויות גדולות של חומר המוצא אפשרה בניית Chia-PET ספריות עם פחות מ 16 מחזורים PCR, amplicons ובכך לצמצם ויתירות של כל ספרייה. זה מתואם עם יתירות נמוכה יותר תגיות ממופה ייחודיים גם אחוז גבוה של נתונים שימושיים, ובכך שהיא מאפשרת אינטראקציה מקיפה יותר הכרומטין מפה עם מסלולים פחות של רצף. נפח ארוז הסופי של חרוזים בצינור זה צריך להיות 50 μl של 100 μl של חרוזים מגנטיים Sepharose בהתאמה. אם נפח חרוז ארוז הוא פחות מ כאמור, להביא לנפח ארז מינימום עם חרוזים מגנטיים או Sepharose דומה מראש פינה ריקים כדי להקטין את איבוד של ה-DNA נושאות חרוזזה בשלבים הבאים. המקוצרות טיפים או גדול ליבות עצות יש להשתמש pipetting חרוזים Sepharose. שינויים הבאים שולבו לאחר שפורסם קודם לכן Chia-PET פרוטוקול 5. ראשית, חרוזים מגנטיים ז שימשו כדי להקטין את איבוד מדגם במהלך שוטף. בנוסף, זיהינו שאינם ספציפיים להקות עם משוערים של 100 BP ו 138-BP להיות amplicons של עצמי ligated למוצרי linkers וחצי ו / או מתאמים. לפיכך, צמצמנו את ריכוז biotinylated למוצרי linkers וחצי ו 454 GS20 מתאמי למזער שאינם ספציפיים להקות במהלך הגברה PCR. נפח קשירת הקרבה ירד מ 50 מ&quot;ל ל 10 מ&quot;ל כדי להקטין את איבוד מדגם במהלך השלבים הבאים טיהור וגם לחסוך בעלויות מגיב. כמו כן הגדילה את זמן הדגירה לשתק Chia-PET-DNA כדי חרוזים כדי להבטיח לכידת מקסימלי של ה-DNA Chia-PET על חרוזים streptavidin. במהלך שלב קשירת הקרבה, ligations chimeric thaלא לא מייצגים אמת אינטראקציות ב vivo הכרומטין נוצרות באופן בלתי נמנע באופן בלתי ספציפי אקראי. לכן, כדי להעריך את איכות נתוני הניסוי Chia-PET בכלל, בשיעור של chimerism מוערך משימוש שני שונים linkers וחצי עם נוקלאוטיד ברקודים ספציפי TAAG ו ATGT 5. לאחר רצף תפוקה גבוהה, Chia-PET רצפי מנותחים 1 להרכב ברקוד רצפים מקשר נגזר קשירת מוצרים ספציפיים שאינם ספציפיים מוצרי קשירת ניתן להבחין 8. אחוז מפלצות הידועים (כלומר heterodimers linkers א.ב.) הנמצאים בבית שלנו, MCF-7 RNA פולימראז II Chia-PET ספריות הוא פחות מ 15%. Chia-PET רצפים מסווגים לאחר מכן לשתי קטגוריות, כלומר עצמית קשירת חיות מחמד, קשירת בין חיות. עצמי קשירת חיות מחמד לקבל קשירת עצמית circularization של שברי הכרומטין תוך קשירת בין חיות מחמד נגזר אניnter-קשירת בין שני קטעי דנ&quot;א שונים. זו האחרונה היא אז המשנה לחלק לשלוש קטגוריות שונות המבוססות על מרחק גנטי של כל תג על כרומוזום זהה (intrachromosomal קשירת בין PETS) או ששני תגיות ממופים שני כרומוזומים שונים (interchromosomal קשירת בין PETS). פיתחנו Chia-PET כלי תוכנה החבילה למיין את 8 קטגוריות שונות. זו תתבסס על שברי דנ&quot;א הנמצאים בספרייה. באופן כללי, שברים שבב קטן יותר ייתן רזולוציה גבוהה יותר מנותקים אלה השנייה RNA פולימראז Chia-PET הספריות הוא כ 4 קילו. בנוסף, אינטראקציות הכרומטין אמיתיים ניתן להבחין בין רעש אקראי על ידי ספירת מספר קשירת בין PETS באשכול אינטראקציה, כלומר, קבוצה של מספר PET גבוהה הוא אמר שיש סבירות גבוהה יותר להיות אינטראקציה אמיתית הכרומטין 8 . לסינון תוצאות חיוביות שגויות שלנולעלות מ עוגנים מועשר שיכול ליצור קשירת בין PETS במקרה אקראי, במסגרת ניתוח סטטיסטי יש גם פותח על מנת להסביר את היווצרות אקראית של כל קשירת בין PETS בין שני עוגנים 8. לסיכום, הטכניקה Chia-PET מאפשר מיפוי רשתות אינטראקציה הכרומטין בקנה מידה עולמי. יישום שבב ב Chia-PET מאפשר הפחתת המורכבות ספריה רעשי רקע. כמו כן, שבב מוסיף הספציפיות כדי אינטראקציות הכרומטין, המאפשר בחינה של אינטראקציות הכרומטין ספציפיים הקשורים גורמי תעתוק מסוימים 5.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 4-20% שיפוע TBE ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> שלב ב &#39;, 6.3 </td></tr><tr><td> 5 x-DNA T4 האנזים מאגר עם PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> שלב ב &#39;, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> שלב ב &#39;, 6.8 </td></tr><tr><td> Agilent דנ&quot;א 100 Assay </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> שלב ב &#39;, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent רגישות גבוהה DNA Assay </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> סרכזת מסננים תחתית (Spin-X) </td><td> קורנינג &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> שלב ב &#39;, 3.7 ו - 6.9 </td></tr><tr><td> Reader Dark Transilluminator </td><td> קלייר כימית מחקר </td><td> DR46B </td><td> שלב ב &#39;, 6.8 </td></tr><tr><td> Sonifier דיגיטלי נייד משבש </td><td> ברנסון </td><td> 450D-0101063591 </td><td> שלב א &#39;, 4.3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 מגנט (מרוכז חלקיקים מגנטיים) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> שלב ב &#39;, 7.5.1 שלב, לכל חרוזים מגנטיים כביסה צעדים </td></tr><tr><td> DynaMag-15 מגנט (מרוכז חלקיקים מגנטיים) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> שלב א &#39;, 5 ו 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (מרוכז חלקיקים מגנטיים) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> שלב ב &#39;, 6.5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA פולימראז אני </td><td> חוד </td><td> M0209 </td><td> שלב ב &#39;, 5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </TD&gt; <td> שלב א &#39;, 7.5.1 שלב ב&#39;, 4.3 ו - 6.5 </td></tr><tr><td> Illumina הדור cBot Cluster מערכת </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> שלב ב &#39;, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina הגנום Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> שלב ב &#39;, 7.5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primers </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> שלב ב &#39;, 5.4 (במידת הצורך) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico ביוטק </td><td> RM-2L </td><td> שלב ב &#39;, כל incubations עם סיבוב </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR מערכת </td><td> רוש </td><td> 04 640 268 001 </td><td> שלב א &#39;, שלב ב 7.5.3, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR הירוק אני MasterMix </td><td> רוש </td><td> 03 752 186 001 </td><td> שלב ב &#39;, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 streptavidin Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> שלב ב &#39;, 5.2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> מגנטית (Dynabeads) חלבון G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> שלב א &#39;, 5.1.1 ו 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract בצפיפות גבוהה (2ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> שלב א &#39;, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract בצפיפות גבוהה (50 מ&quot;ל) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> שלב ב &#39;, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> חוד </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase ONE Ribonuclease </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> שלב ב &#39;, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA פולימראז II (8WG16) נוגדנים חד שבטיים </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> שלב א &#39;, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge צינורות צנטריפוגות (פוליפרופילן) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> שלב א &#39;, 3.1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge צינורות טפלון צנטריפוגות (FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> שלב ב &#39;, 4.3 </td></tr><tr><td> Phusיון נאמנות גבוהה מיקס מאסטר </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> שלב ב &#39;, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (קוואנט-IT) מגיב dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> שלב א &#39;, 7.5.2 </td></tr><tr><td> תחתית עגולה פוליסטירן Test Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> שלב א &#39;, 4.1 </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות (מלא, ללא EDTA) </td><td> רוש </td><td> 11873580001 </td><td> שלב א &#39;, 1.6 ואילך </td></tr><tr><td> Proteinase K פתרון (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> שלב א &#39;, 4.4, 7.5.1 שלב ב &#39;, 4.1 </td></tr><tr><td> האנזים T4 DNA </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> שלב ב &#39;, 2.2, 3.9 ו - 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA האנזים חוצץ (חוד) </td><td> חוד </td><td> B0202S </td><td> שלב ב &#39;, 3.3 ו - 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA פולימראז </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>שלב ב &#39;, 1.2 </td></tr><tr><td> T4 DNA Polynucleotide קינאז </td><td> חוד </td><td> M0201 </td><td> שלב ב &#39;, 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS ערכת V5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> העוצרים עבור Illumina הגנום Analyzer IIx מערכת </td></tr><tr><td> TruSeq PE אשכול ערכת v2-cBot-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> להיות לשימוש עם מערכת Illumina cBot הדור אשכול </td></tr><tr><td> SYBR ירוק אני </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> שלב ב &#39;, 6.3 ו - 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock מיני נייד אלקטרופורזה מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> שלב ב &#39;, 6.3 ו - 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td colspan="2"> רצף </td><td> תגובות </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinylated חצי linkers (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;GG CCG CGA / iBiodT / ATC tta TCC AAC 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פנימי ביוטין DT (9) </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &#39;GTT GGA ט.א.א. גת ATC GC 3 &quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinylated חצי linkers B (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פנימי ביוטין DT (9) </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG תאת ATC GC 3 &quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים </td></tr><tr><td rowspan="2"> ללא biotinylated חצי linkers (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;GGC CGC גת ATC GGA TCC AAC 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC גת ATC GC 3 &quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 מתאם (200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;המרכז לאמנות עכשווית TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5&#39;CTG AGA החטיבה GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG החטיבה GGA TGA גת GG 3 &quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 מתאם ב &#39;(200ng/μl) </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;CTG AGA CAC GCA ACA GGG גת AGG CAA GGC ACA החטיבה GGG ATA GG 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &quot;CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AGN N 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN מתאמי </td><td> ראש </td><td> 5 &quot;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים ראה שלב ב &#39;, 5.4 </td></tr><tr><td> בוט </td><td> 5 &quot;phos - גת CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&quot; </td><td> 250 nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים פוספורילציה סוף &#39;5 ראה שלב ב&#39;, 5.4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (קדימה) פריימר (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;AAT גת ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (הפוכה) פריימר (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA גת CGG TCC ATC TCA TCC CTG מס רווחי הון GTC 3&quot; </td><td> 250 nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> QPCR פריימר 1.1 (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;AAT גת ACG GCG ACC ACC GAG AT 3&quot; </td><td> 10nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> QPCR פריימר 2.1 (10 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5 &quot;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&quot; </td><td> 10nmole בהיקף PCR כיתה </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 רצף צבע יסוד (100 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 &quot; </td><td> 100nmole בקנה מידה HPLC מטוהרים </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 רצף צבע יסוד (100 מיקרומטר) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT GCG TGT CTC AG 3 &quot; </td><td> 100nmole בקנה מידהHPLC מטוהרים </td></tr></tbody></table> לוח של oligos ומתאמים. Oligos סדר משולב של ה-DNA טכנולוגיות (IDT) ולהכין linkers ומתאמים באותו אופן כפי שתואר קודם לכן 10. חצאי linkers ומתאמים עשוי להיות מוכן מראש ולאחסן למשך מספר חודשים ב -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

הגנום מאורגנים תלת ממדי מבנים, אימוץ מסדר גבוה תצורות בתוך מיקרון בגודל מקומות גרעיני 7, 2, 12. ארכיטקטורות אלה אינן אקראיות, הכרוכה אינטראקציות בין היזמים הגן ואלמנטים רגולטוריים 13. הכריכה של גורמי תעתוק ל רצפים רגולטוריים מסוימים מביא רשת של ויסות שעתוק ותיאום 1, 14. ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) פותחה כדי לזהות אלו מסדר גבוה מבנים הכרומטין 5,6. התאים הינם קבועים לוקוסים אינטראקציה נתפס על ידי קוולנטיים חלבון דנ&quot;א חוצה קישורים. כדי למזער את הלא ספציפית רעש להפחית את המורכבות, כמו גם להגדיל את הספציפיות של ניתוח האינטראקציה הכרומטין, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש כנגד גורמים חלבונים ספציפיים כדי להעשיר את שברי הכרומטין של עניין לפני קשירת הקרבה. קשירת לערב חצאי linkers לאחר מכן יוצר קשרים קוולנטיים בין זוגות של קטעי ה-DNA קשורים זה לזה בתוך מתחמי הכרומטין בודדים. ההגבלה משני צדי MmeI האנזים אתרים את חצאי linkers לאפשר מיצוי של לזווג תגיות מקשר-Tag בונה הקצה (חיות מחמד) על העיכול MmeI. כמו חצאי linkers הם biotinylated, מבנים אלה חיות מחמד הם מטוהרים באמצעות streptavidin-מגנטיים חרוזים. חיות המחמד מטוהרים הם ligated עם הדור הבא של מתאמי ריצוף ו קטלוג של שברי אינטראקציה מופק באמצעות הדור הבא sequencers כגון Analyzer הגנום Illumina. מיפוי וניתוח ביואינפורמטיקה מתבצע מכן לזהות שבב מועשר אתרים מחייב שבב מועשר אינטראקציות הכרומטין 8. הפקנו סרטון להפגין היבטים קריטיים של פרוטוקול Chia-PET, במיוחד הכנת צ&#39;יפ, איכות שבב משחק תפקיד מרכזי בתוצאה של הספרייה Chia-PET. כמו הפרוטוקולים הםארוך מאוד, רק השלבים הקריטיים הם רואים בסרט.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא שיטה<em&gt; דה נובו</em&gt; זיהוי של אינטראקציות הכרומטין, להבנה טובה יותר של שליטה תעתיק.

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

chromatin-interaction-analysis-with-paired-end-tag-sequencing-chia

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

30.5K Views.  Agency for Science, Technology and Research, Singapore. ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא שיטה דה נובו זיהוי של אינטראקציות הכרומטין, להבנה טובה יותר של שליטה תעתיק.

Video: Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).