אנו מודים למוסטפה סאלח ולג&#39;יי טוריגני על קריאה ביקורתית של כתב היד וסטיבן האן וסטיבן הניקוף על הדרכה ותמיכה במהלך הפיתוח של CHEC-seq ויישומה למתווך המתווך. SG נתמך על ידי מענקים NIH R01GM053451 ו R01GM075114 ו GEZ נתמך על ידי קרנות ההפעלה של אוניברסיטת אינדיאנה.

1. הדור של זנים שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור זן שמרים הנושאת את גורם הריבית מתויג עם MNase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את קלטת תיוג MNase מן הרצוי וקטור ( טבלה 1 ) באמצעות תערובת התגובה שצוין ( טבלה 2 ) ותנאי רכיבה ( טבלה 3 ). מערבבים 5 μL של התגובה PCR ו 1 μL של 6X DNA לטעון צבע. הפעל כל aliquot PCR על 0.8% agarose ג&#39;ל ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 2.3 kb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את קלטת תיוג מוגבר לתוך זן של בחירה באמצעות שינוי סטנדרטי ליתיום אצטט 22 ולבצע הבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת את האינטגרציה הנכונה של קלטת התיוג עם המושבה PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תערובת התגובה שצוין ( טבלה 4 ) עבור מספר המושבות להיות מוקרן. שמור על הקרח עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חלק מכל מושבה להיות tesTed לתוך החלק התחתון של צינור PCR באמצעות קיסם קיסרי או קצה pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוגל המושבות הרים ב כוח גבוה במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של תערובת PCR ( טבלה 4 ) לכל מושבה microwaved ו pipet מעלה ומטה כדי לערבב. בצע את ה- PCR באמצעות תנאי האופניים שצוין ( טבלה 5 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את μL 50 של תגובה PCR ו 10 μL של 6X DNA לטעון צבע ישירות בצינור כל PCR. הפעל 10 μL של כל מדגם על ג&#39;ל agarose 1% ב 120 V במשך 40 דקות. גודל המוצר הצפוי הוא ~ 700 bp. הערה: אם תרצה, לאמת ביטוי מתאים של חלבון היתוך MNase באמצעות סופג המערבי. A ~ 20.6 קילודלטון שינוי המשקל המולקולרי של חלבון מתויג צפוי. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת זן MNase חינם על ידי שיבוט מבוסס הומולוגיה של היזם של הגן של עניין לתוך pGZ136 (טבלה 1) ואת השינוי ואת הבחירה כמו בשלב 1.1.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלטרנטיביVely, להרכיב את היזם של הגן של עניין ו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS לתוך וקטור פלסמיד, להפוך ולבחור כמו בשלב 1.1.2, ולהגדיל את הלחץ במצב סלקטיבי המתאים לתחזוקה של הפלסמיד. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצהריים / ערב של היום לפני הניסוי ChEC, לחסן 3 מ&quot;ל שמרים- peptone-dextrose (YPD) או בינוני סלקטיבי המתאים עם מושבה אחת של זן הנושא את MNase- מתויג גורם. דגירה זו תרבות לילה (180 סל&quot;ד רועד, 30 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר של יום הניסוי ChEC, לדלל את התרבות לילה לתוך 50 מ&quot;ל של מדיום לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600 ) של 0.2-0.3. דגירה זו תרבות (180 סל&quot;ד רועד, 30 מעלות צלזיוס) עד שהוא מגיע OD 600 של 0.5-0.7. כאשר התרבות מתקרב OD 600 מתאים, להגדיר בלוק חום או אמבט מים ל 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל להפשיר המאגר תוספים ( Ta6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של המאגר תוספים פלוס ( טבלה 6 ) לכל תרבות. שמור על המאגר ב RT במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות microfuge המכיל 90 μL של פתרון להפסיק ( טבלה 7 ) ו 10 μL של 10% SDS עבור כל נקודת זמן כדי לאסוף. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת דוגמאות ב 0 s, 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות, ו 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות למזוג לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב 1500 xg וטמפרטורת החדר (RT) במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים resuspend ביסודיות 1 מ&quot;ל של מאגר A ולהעביר את התאים resuspended לצינור microfuge. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend ביסודיות תאים 1 מ&quot;ל של הצפת על ידי pipetting למעלה ולמטה. גלולה resuspended תאים microfuge ב 1500 xg ו RT במשך 30 s. חזור על שלב זה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים resuspend ביסודיות μL 570 של מאגר א הוסף 30 μL של digitonin 2%(0.1% ריכוז סופי) כדי לאפשר permeabilization של התאים, וכן להפוך לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Permeabilize בלוק חום או אמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet התגובה למעלה ולמטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים. הסר aliquot 100 μL של תאים permeabilized כמו שליטה שלילית לצינור microfuge המכיל פתרון להפסיק ו SDS (שלב 2.4) ו מערבולת בקצרה לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.1 μL של 1 M CaCl 2 (2 מ&quot;מ ריכוז סופי) לתאים permeabilized להפעיל MNase ולהפוך כמה פעמים במהירות או מערבולת בקצרה לערבב. מיד להחזיר את התגובה המעורבת ב 30 מעלות צלזיוס ולהתחיל טיימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן כדי לאסוף, pipet התגובה מעלה ומטה כדי להבטיח הפצה אפילו של תאים, ולאחר מכן להסיר aliquot 100 μL של תאים permeabilized לצינור microfuge המכיל פתרון לעצור SDS ו מערבולת בקצרה לערבב. עבור כל גורם חדש ניתח, לקחת 0 (לא הוסיף CaCl 2 ), 30 s, 1 דקות, 2.5 דקות, 5 דקות ו 10 דקות נקודות זמן. הערה: ניסויים ChEC עם גורמים לדקלם במהירות DNA ב 30 מעלות צלזיוס יכול להתבצע בטמפרטורות נמוכות יותר להאט MNase מחשוף קינטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל נקודות הזמן נאספו, להוסיף 4 μL של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​proteinase K לכל מדגם, מערבולת בקצרה לערבב, ו דגירה על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של 25: 24: 1 פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl על כל מדגם, מערבולת במרץ לערבב, צנטריפוגה במהירות מקסימלית RT ב microfuge למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל שלב מימית (~ 150 μL) לצינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם של גליקוגן 500 μL של אתנול 100%. וורטקס במרץ לערבב ו להאיץ על קרח יבש במשך 10 דקות או עד הפתרון הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה דנ&quot;א זירז במהירות מקסימלית ו 4 מעלות צלזיוס microfuge למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatants למזוג ולשטוף כדורי עם 1 מ&quot;ל של אתנול RT 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוריד אתנול, הסרת שאר על ידי הפיכת אדבק בעדינות בצינורות על מגבת נייר. דגימות ספין בקצרה באמצעות צנטריפוגה benchtop ולהשתמש פיפטה כדי להסיר אתנול שיורית, נזהר לא להפריע גלולה. אוויר יבש כדורי עבור ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד כדורי ייבוש, לעשות תערובת אב resuspend כדורי מיובשים ב 29 μL של Tris, pH 8.0 + 1 μL של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase כל אחד. Digest RNA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 μL של 6X DNA לטעון צבע עם 5 μL של כל מדגם ולהפעיל על ג&#39;ל agarose 1.5% ב 120 V במשך 40 דקות. </li></ol> 3. בחירת גודל הערה: המטרה של בחירת גודל היא להסיר שברי multobase של DNA גנומי מן המדגם להיות רצף ולהעשיר שברי ~ 150 bp (בערך בגודל של DNA גרעיני) או קטן יותר. ב נתונים רצף, שברי &lt;400 BP מועשרים, עם שיא ראוי לציון סביב בגודל של DNA נוקלאוזומלי (~ 150 BP) ו שיא או הפצה רחבה של שברי subnucleosalal. &lt;Ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מדגם, להוסיף 75 μL של שלב מוצק immobilization (SPRI) חרוזים ב פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון 23 ו pipet למעלה ולמטה 10 פעמים לערבב. דגירה החרוז: תערובת DNA ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה חרוז SPRI, להכין צינורות microfuge המכיל 96 μL של 10 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 ו 4 μL של 5 Na NaCl עבור כל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות במעמד מגנטי לאסוף חרוזים בצד הצינור. אפשר את החרוזים לאסוף בצד של הצינור במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים כל supernatant לצינור חדש המכיל Tris ו NaCl (שלב 3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של 25: 24: 1 פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl על כל מדגם, מערבולת לערבב, ו צנטריפוגה במהירות מקסימלית RT ב microfuge למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל שלב מימית צינור חדש. הוסף 30 מיקרוגרם של גליקוגן 500 μL של אתנול 100%. לזרז DNA על קרח יבש במשך 10 דקות או עד הפתרון הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pellet preciדנ&quot;א pitated במהירות מקסימלית ו 4 מעלות צלזיוס microfuge למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatants למזוג ולשטוף כדורי עם 1 מ&quot;ל של 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול למזוג, להסיר את שארית ידי היפוך בעדינות הקשה על צינורות על מגבת נייר. דגימות ספין בקצרה באמצעות צנטריפוגה benchtop ולהשתמש פיפטה כדי להסיר אתנול שיורית, נזהר לא להפריע גלולה. אוויר יבש כדורי עבור ב RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולות מיובשות μL 25 של Tris, pH 8.0. קביעת ריכוז המדגם באמצעות assay רגישות גבוהה. עבור ניסויים TF CHEC, 10-100 ng DNA הוא שגרתי התאושש לאחר בחירת גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ספריות רצף. פרוטוקולי הכנה לספריה שאינם מסתמכים על בחירת גודל, כפי שתואר לעיל 24 , רצוי לאפשר רצף של מגוון גדול של גדלים שבר (25-500 bp). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריות רצף במצב משויך סוף. מינימום של 25 בסיסים של רצף על כל קצה נדרש קריאה באיכות גבוההמיפוי. בין 1 ל 2 מיליון קורא מספק כיסוי מספיק עבור מדגם ChEC. הערה: ניתוח נתונים ChEC-seq הוא הליך מורכב מעבר להיקף של מאמר זה. מידע מפורט על ניתוח נתונים ניתן למצוא בפרסומים קודמים 1 , 21 , ואת סקריפטים מותאמים אישית המשמשים לניתוח זמינים ב GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) יכול לשמש גם עבור ניתוח שורת הפקודה של נתונים ChEC-seq. </li></ol>

<ol>
	<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733 (2015).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells.">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li><li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast.">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).</li><li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+promoters+give+rise+to+false+positive+'Phantom+Peaks'+in+ChIP-seq+experiments.">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models.">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li><li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast.">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li><li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets.">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).</li><li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries.">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).</li><li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses.">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution.">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li><li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints.">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li><li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin.">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li><li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1.">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042 (2014).</li><li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dam+it's+good!+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions.">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li><li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins.">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins.">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules.">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li><li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup-PI:+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast.">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li><li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+Ca2++by+yeast+vacuoles.">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li><li>Gr&#252;nberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters.">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective,+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li><li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+regulatory+factors+by+immunoprecipitation+from+native+chromatin.">Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin.</a> Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities.">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies.">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li><li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells.">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li><li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants.">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li><li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints.">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li><li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells.">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li><li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines.">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).</li><li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Calcium+in+Neurons.">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells.">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li><li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הראינו כי ChEC יכול למפות שיעורים שונים של חלבונים שמרים על הכרומטין, ולצפות כי יהיה זה ישים באופן רחב על משפחות שונות של TFs אחרים הכרומטין מחייב גורמים בשמרים. CHEC-seq הוא יתרון בכך שהוא אינו דורש crosslinking, solobilization הכרומטין, או נוגדנים. לפיכך, ChEC נמנע חפצים עשויים להיות נוכח X- שבב- seq, כגון חפץ היפר ChIPable 3 , 4 , ו CHIP יליד, כגון שליליות שווא בשל solobilization חלבון שלם 14 . החיסרון העיקרי של CHEC-seq, כמו עם כל שיטות היתוך אנזימטית, היא הדרישה חלבון היתוך. זה יכול להיות מושגת במהירות נביטה שמרים, אבל הוא יותר מייגע metazoans. מגבלה נוספת של CHEC-seq היא כי זה לא יכול להיות מיושם כמו הוא עבור פרופיל של שינויים היסטון. עם זאת, ניתן להתאים את תחום החיבור לשינוי ל- MNase ולהביע, לאפשר hאיזון שינוי מיפוי עם CHEC-seq. ברוח זו, שבב- seq באמצעות epitope- מתויג היסטון שינוי תחומים מחייב שימש למפות דפוסי רחב הגנום של שינוי היסטון 26 . השימוש בשליטה MNase חופשי חשוב בהקמת הספציפיות של תוצאות ChEC-seq. זן MNase חופשי נושאת MNase מתויג עם 3xFLAG ו וירוס סימיאן 40 לוקליזציה גרעיני האות (SV40 NLS) תחת שליטתו של האמרגן אנדוגני עבור הגן של עניין. היא דומה באופן קונספטואלי לבקרת הסכר הבלתי מנוצלת ששימשה במחקרים של DMID 27 ובקרות לחיתוך לא ספציפי בשל נגישות הכרומטין. כמו שליטה MNase חינם עבור TF CHEC-seq, שילבנו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS מונע על ידי מקדם REB1 ב loca ura3 1 . עבור המתווך ChEC-seq, הבנו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS תחת שליטה של ​​האמרגן MED8 ב פלזמה שאינה משולבתוקטור מתוחזק בינוני סלקטיבי 21 . בשני המקרים, מעט מאוד מחשוף על ידי MNase חינם נצפתה. לפיכך, זן שליטה יחיד שבו 3xFLAG-MNase-SV40 NLS מונע על ידי מקדם חזקים יחסית צריך להיות מתאים עבור רוב הניסויים. כאשר מתכננים ניסוי ChEC, שיקול מבניים של חלבון של עניין עשוי להיות חשוב. לדוגמה, מצאנו כי צירוף MNase אל C- הטרמינל של Reb1 נתן תבנית מחשוף אסימטרי סביב מוטיבים Reb1, בעוד הביטוי של Reb1 עם N- מסוף MNase נתן דפוס מחשוף סימטרי 1 . אנו מייחסים דפוסים שונים אלה מחשוף למבנה של Reb1. דנה מחייב את התחום של Reb1 ממוקם ב C- מסוף; לפיכך, ה- C- הטרמינל הוא מובנה וקרוב DNA, הגבלת טווח התנועה של MNase ורק המאפשר C- המחשוף מסוף. לעומת זאת, הטרמינל C של Abf1 הוא בלתי מובנה יחסית ולכן יכול לפעול להגדלהלהגיע MNase, המאפשרים מחשוף משני צידי אתרי הכריכה Abf1. במקרה של Rap1, עוד שמרים GRF, מצאנו כי קיצור המקשר בין C- מסוף MNase בין 33 ל 8 aa היה מספיק כדי להפחית באופן חמור מחשוף, אולי בשל המרחק המוצע של החלק C- מסוף של Rap1 מ דנ&quot;א 28 . שיקול מבני כזה עשוי להיות חשוב גם כאשר ינסו למפות את הכריכה של חלבונים הנמצאים במכלול גדול. עבור ניתוח CHEC-seq של המתווך מחייב את הגנום שמרים 21 , בחרנו יחידות משנה אשר C- Termini נבחנו מבנית להיות חשופים, ולא נקבר בתוך המתחם. מתוך שלוש היחידות המתמזגות ל- MNase, אחת מהן לא הדביקה את הדנ&quot;א בצורה חזקה, דבר המצביע על כך שאילוצים סטריים, או אינטראקציות עם גורמים אחרים המחייבים דנ&quot;א, הפחיתו את מחשוף הדנ&quot;א. מצאנו כי CHEC-seq מזהה 4-12 פעמים פסגות יותר עבור שמרים GRFs Abf1, Rap1, ר1 מאשר צ &#39;יפס שונים גישות כאשר כל נקודות הזמן נחשבו יחד 1 . אתרים אלה יכול להיות מחולק לשני סוגים המבוססים על קינטיקה mNase מחשוף. ניתוח נתונים CHEC-seq עבור שמרים GRFs חשף שני סוגים שונים של אתרים מחייב 1 . הראשון, המכונה &quot;מהיר&quot;, הציג מחשוף מקסימלי &lt;1 דקות לאחר תוספת סידן בדרך כלל המכיל התאמות חזקות מוטיבים קונצנזוס ידוע. השני, המכונה &quot;איטי&quot;, לקח כמה דקות כדי להגיע רמות ניכר של מחשוף ו היו מדולדלים של מוטיבים התאמות. שני הכיתות של האתרים היו, בממוצע, מועשר עבור מחייב במערכי שבב, אם כי הם לא בהכרח נקראים פסגות במחקרים אלה צ&#39;יפ. רוב האתרים עבור גורם נתון היו אתרים איטיים. אנו משערים כי אתרים מהירים הם מייצגים של זיקה גבוהה זיקה גורם מחייב אתרים, בעוד אתרים איטיים מייצגים לוקלי transiently שנדגמו במהלך סריקת האתר מחייב. האובServation של שני סוגים של אתרי מחייב מופרדים על ידי הקינטיקה של מחשוף MNase עשוי להסביר את התצפית ב datasets שבב רבים שבב כי מספר גדול של פסגות עבור גורם נתון עם קביעה מבוססת היטב DNA מחייב אינם מכילים מוטיב קונצנזוס 29 : פורמלדהיד crosslinking, מבוצע במשך 10-15 דקות ברוב פרוטוקולי שבב, יכול שוב ושוב ללכוד אינטראקציות חולף או אופורטוניסטי של גורם עם הגנום, המוביל האינפלציה של האות. ואכן, השוואה של צ&#39;יפ אקסו והדמיה תא חי עולה כי זה המקרה 2 . יש לציין כי לא ראינו ירידה דרמטית בזמן תלויית אותות של מתווך CHEC-seq 21 , עם אות מגשר CHEC-seq קבוע יחסית מ -30 שניות ל -20 דקות. בהתחשב בתצפיות אלה, אנו ממליצים לבצע קצר ChEC-Seq משך להתאושש גבוהה אמון אתרים מחייבים. אנו צופים כי CHEC-seq יכול להיות מותאם שאינם שמריםמערכות. הריכוז של סידן חופשי בתאים יונקים unstimulated הוא 50-300 ננומטר 30 , 32 , הרבה מתחת לסף עבור הפעלה יעילה MNase. הצעד המגביל להקמת CHEC-Seq במערכות מטאזאוניות הוא אפוא הדור של חלבונים היתוך, אשר נשאר הרבה יותר מייגע מטאזית מאשר תאים שמרים. עם זאת, תיוג אנדוגני של גנים מטאזואנים הוקל מאוד על ידי הופעתה של הנדסה גנומית מבוסס CRISPR 33 , ולכן הגבלה זו צריכה להיות overmonted בקלות. לחלופין, חלבונים היתוך MNase יכול לבוא לידי ביטוי ברמות נמוכות מ פלסמידים. גישה זו הייתה מוצלחת למדי עבור Damid ב תסיסנית 34 , 35 ו 36 תאים אנושיים ולכן עשוי גם להקל על CHEC-seq בתאי metazoan.

מיפוי של אתרי קשירה של גורמי שעתוק (TFs), remodelers הכרומטין, ושאר גורמים הקשורים הרגולציה הכרומטין הוא המפתח להבנת כל התהליכים מבוססי הכרומטין. בעוד הכרומטין immunoprecipitation ו-תפוקה גבוהה רצף (שבב- seq) גישות שימשו כדי לקבל תובנות חשובות רבות בביולוגיה הגנום, יש להם מגבלות בולטות. אנחנו לאחרונה הציג שיטה חלופית, כינה מחשוב אנדוגני הכרומטין תפוקה גבוהה רצף (CHEC-seq) 1 , כדי לעקוף את החסרונות. שבב- seq מבוצע לרוב עם צעד פורמלין מראש crosslinking (X-CHIP-seq) כדי לשמר אינטראקציות DNA- חלבון. עם זאת, מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו על כך ש- X-CHIP-seq לוכד אינטראקציות דנ&quot;א חולפות או בלתי ספציפיות ל- DNA , 2 , 3 , 4 , 5 &lt;Sup&gt;, 6 , 7 , 8 , והוליד אתרי חיוב חיוביים כוזבים. בנוסף, sonication, נפוץ לשבר הכרומטין בניסויים X- שבב seq, מועדף מזמרה אזורים של הכרומטין פתוח, המוביל התאוששות מוטה של ​​שברי אלה אזורים 9 , 10 . Sonication גם מניב תערובת הטרוגנית של אורכי שבר, בסופו של דבר הגבלת רזולוציה האתר מחייב, אם כי תוספת של צעד עיכול exonuclease יכול לשפר באופן משמעותי את ההחלטה 11 , 12 . שיטות צ&#39;יפ מקוריות כגון אזורים כבושים של גנומים מזיקה מטוהרים באופן טבעי בכרומטין (ORGANIC) 13 אינם משתמשים ב- crosslinking וברומטית של כרומטין עם noclease microococcal (MNase), המקלים על הטיות אפשריות הקשורות עם crosslinking פורמלדהיד ו sonication. למרות זאת,מסיסותם של חלבונים רבים הקשורים בכרומטין בתנאים הקלים יחסית הנדרשים להפקת הכרומטין היא גרועה, דבר שעלול להוביל למגוון דינמי מופחת ו / או לתשלילי שווא 14 . בעוד שחידושים שונים של שבב- seq משמשים בדרך כלל למיפוי גנומי רחב של אינטראקציות DNA-חלבון, מספר טכניקות מיפוי המבוססות על היתוך של חלבונים בעלי עניין באנזימים שונים לשינוי דנ&quot;א יושמו גם הם. גישה אחת כזו היא DNA adenine methyltransferase זיהוי (Damid) 15 , שבו חלבון מחייב הכרומטין של עניין הוא התמזגו גנטית לסכר ואת היתוך זה בא לידי ביטוי בתאים או בבעלי חיים, וכתוצאה מכך מתילציה של רצפים GATC הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור החלבון. Damid הוא יתרון בכך שהוא אינו מסתמך על immunoprecipitation ולכן נמנע crosslinking, נוגדנים, או solubilization הכרומטין. זה מתבצע גם in vivo . למרות זאת, את הרזולוציה של Damid מוגבל סולם קילובז ואת פעילות methylating של חלבון היתוך דאם הוא מכונן. שיטה שנייה המבוססת על היתוך אנזימטי היא קריאה כרטיס 16q, אשר מעסיקה היתוך של גורם של עניין טרנספוזיס, בימוי אינטגרציה ספציפית לאתר של טרנספוזונים. כמו Damid, קורא כרטיס seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן יש יתרונות דומים, עם יתרון נוסף של רזולוציה מוגברת. עם זאת, קורא כרטיס- Seq עשוי להיות מוגבל על ידי רצף הטיות של transposases והוא גם סומך על נוכחות של אתרי הגבלה קרוב אתרי ההכנסה טרנספוסון. שיטה שלישית היתוך אנזימטית, שפותחה במעבדה Laemmli, הוא chromatin אנדוגני מחשוף (CHEC) 17 . ב CHEC, היתוך בין חלבון הקשורים הכרומטין MNase מתבטא בתאים, ועל תוספת סידן כדי להפעיל MNase, DNA הוא ביקע הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור מתויגגורם ( איור 1 ). בשילוב עם דרום סופג, ChEC שימש לאפיין מבנה הכרומטין וחלבון מחייב במספר loci הפרט בשמרים 17 , 18 , ו כבר בשילוב עם ניתוח microarray ברזולוציה נמוכה כדי לחקור את האינטראקציה של רכיבים נקבובית גרעינית עם שמרים הגנום 19 . ChEC מציעה הטבות דומות כמו DUMID ו Calling כרטיס SEQ, ואת הפתרון שלה הוא כמעט בסיס בסיס זוג כאשר ניתח על ידי הרחבה פריימר 19 . ChEC הוא גם controllable: חצץ DNA חזק על ידי MNase תלוי תוספת של סידן millimolar, להבטיח כי MNase אינו פעיל בריכוז סידן חינם חינם שנצפה בתאים שמרים חיים 20 . בעבר, אנו presulated כי שילוב של CHEC עם תפוקה גבוהה רצף (ChEC-seq) יספק מפות ברזולוציה גבוהה של אתרי הקישור TF. ואכן, ChEC-seq שנוצר מפות ברזולוציה גבוהה של שמרים ניצני כללי כללי הרגולציה (GRFs) Abf1, Rap1, ו Reb1 על פני הגנום 1 . יש לנו גם ליישם בהצלחה ChEC-seq אל המתווך מודולרי מודולרי, משומר, תמלול תמלילי גלובלי חיוני 21 , להרחיב את תחולתם של CHEC-seq כדי מתחמי בגודל megadalton שאינם ישירות ליצור קשר עם ה- DNA עשוי להיות קשה למפות על ידי שבב- שיטות מבוססות. CHEC-seq היא שיטה רבת עוצמה הן עבור אימות עצמאי של תוצאות שבב- seq ו הדור של תובנות חדשות לתוך הרגולציה של תושבי הכרומטין תהליכים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד ליישום שיטה זו בשמרים ניצני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

מיפוי רחב של גנום של אינטראקציות DNA- חלבון הוא קריטי להבנת רגולציה גנטית, שיפוץ הכרומטין, ותהליכים אחרים הכרומטין תושב. פורמלדהיד crosslinking ואחריו immunoprecipitation הכרומטין ותפוקה גבוהה רצף (X-CHIP-Seq) שימש כדי לקבל תובנות רבות ערך לתוך ביולוגיה הגנום. עם זאת, X-Chip-seq יש מגבלות בולטות הקשורות crosslinking ו sonication. NIP צ&#39;יפ ימנע את החסרונות הללו על ידי השמטת crosslinking, אבל לעתים קרובות התוצאות התאוששות לקויה של חלבונים הקשורים הכרומטין. בנוסף, כל השיטות מבוססות שבב כפופות לשיקולי איכות נוגדנים. שיטות אנזימטיות למיפוי אינטראקציות דנ&quot;א של חלבון, הכוללות היתוך של חלבון בעל עניין לאנזים המשנה-דנ&quot;א, שימשו גם למיקוד אינטראקציות DNA-חלבון. לאחרונה שילבנו שיטה כזו, מחשוב אנדוגני הכרומטין (ChEC), עם רצף תפוקה גבוהה כמו CHEC-seq. ChEC-seq מסתמך על היתוך של הכרומטין- AssocIated חלבון של עניין micrococcal nuclease (MNase) כדי ליצור מחשוף DNA ממוקד בנוכחות סידן בתאים חיים. CHEC-seq אינו מבוסס על immunoprecipitation ולכן עוקף חששות פוטנציאליים עם crosslinking, sonication, solobilization הכרומטין, איכות נוגדנים תוך מתן מיפוי ברזולוציה גבוהה עם אותות רקע מינימלי. אנו מאמינים כי ChEC-seq יהיה עמית חזק ל- CHIP, ויספק אמצעי עצמאי שבאמצעותו יאמת את ממצאי ה- CHIP-seq ויגלה תובנות חדשות לגבי הרגולציה הגנומית.

<html> במקרה של ניסוי מוצלח של ה- CHEC, אנליזה של דנ&quot;א על-ידי אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל יגלה גידול תלוי סידן ב-שבר עודף DNA, כפי שצוין על ידי מריחה ו בסופו של דבר העיכול המלא של DNA גנומי. במקרים מסוימים, סולם של להקות דומות לזה שנראה עם עיכול MNase המסורתית הוא ציין לאחר העיכול המורחבת. זה המקרה של ניתוח CHEC של Reb1, גורם רגולציה כללי שקושר נוקלאוזום, מדולדל אזורים (NDRs) ( איור 2 ). מצאנו, במקרה של GRFs, העיכול המורחב מוביל לאובדן אות במהירות על אתרי מחורצים 1 . באופן אידיאלי, מדגם עם הפחתה בגודל של הלהקה DNA הגנומי המציג גבוהה משקל מולקולרי מריחה, כגון 30 שניות ו 1 דקות נקודות עבור Reb1 ChEC, ישמש רצף כדי למנוע אובדן זמן תלויי האות . He.within-page = &quot;1&quot;&gt; ויזואליזציה של קטע מסתיים מ הניסוי Reb1 ChEC-seq מגלה העשרה חזקה של Reb1 על רקע נגזר הן זן Reb1-MNase ללא סידן הוסיף זן MNase חינם לאחר משך שווה של חינם סידן טיפול (30) ( איור 3 ). כמו כן, אנו רואים מחיצות DNA משמעותי על ידי היתוך של המתווך יחידת משנה Med8 עם MNase, אבל לא MNase חינם מונע על ידי האמרגן MED8 , 1 דקות לאחר תוספת סידן ( איור 3 ). כדי להשוות את נתוני ה- CHEC-Seq של Reb1 ל- CHIP-seq, השגנו רשימה של 1,991 פסגות Reb1 שנקבעו על ידי ORGANIC 13 . פסגות אלה היו מוטיב ממוקד עם ספירת בסוף קטע הממוצע בכל עמדה בסיס בחלון 100 BP סביב נקודת המוטיב. צפינו באסימטריה בולטת בחשוף, כשרוב החלקים מסתיים במיפוי אל הצד במעלה של המוטיב (<html> איור 4 ). <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55836/55836fig1.jpg" /> איור 1 : סכמטי של שיטת ה- CHEC-seq. כרומטין הקשורים חלבון (CAP) -Mase היתוך מתבטא תאים שמרים. החלבון נקשר לדנ&quot;א אך אינו יוצר מחשוף מעל רמות הרקע בשל הסידן החופשי הנמוך ביותר בגרעין. עם permeabilization של תאים עם digitonin ו תוספת של סידן millimolar, FAPions CAP-MNase קשור הגנום לדקלם DNA, משחרר שברי קטן. שברים אלה הם מטוהרים מכן, רצף, ממופה חזרה לגנום, נותן פסגות של קצוות מסתיים הפרוקסימלי לאתרים מחייב עבור היתוך CAP-MNase. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55836/55836fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יחד .within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55836/55836fig2.jpg" /> איור 2 : Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה של DNA מ Reb1 ChEC ניסוי. 5 aliquot μL של ה- DNA מכל נקודת זמן ChEC ניתח על ג&#39;ל 1.5% TAE-agarose לפני בחירת גודל. זה מראה עיכול פרוגרסיבי של DNA גנומי על ידי היתוך Reb1-MNase. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55836/55836fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55836/55836fig3.jpg" /> איור 3 : גנום דפדפן Snapshots של Reb1-MNase ו MNase חינם MECase ניסויים. IGV תצוגות של האות בסוף קטע עבור Reb1 חינם MNase CHEC-seq 30 s לאחר תוספת סידן ו Med8 חינם MNase CHEC-seq 1 דקות af<html> תוספת סידן לאורך קטע מייצג של הגנום שמרים. מערכי הנתונים מנורמל על ידי חלוקת מספר קצוות שברי הממופה לכל מיקום בסיס על ידי המספר הכולל של קצוות מסתיים ממופה והכפלת על ידי המספר הכולל של בסיסים ממופה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55836/55836fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55836/55836fig4.jpg" /> איור 4 : העשרה של שברים שפורסמו על ידי Reb1-MNase מסתיימת סביב אתרים אורגניים של Reb1. חלקה ממוצעת של 30 s Reb1 ו MNase חינם ChEC-Seq קטע סוף האות סביב 1,991 מוטיבים Reb1 שנקבעו על ידי אורגני 13 . הנתונים מנורמל כמו באיור 3 .<html> Lank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פלסמיד </td><td> סמן לבחירה שמרים </td><td> הערות </td><td> מספר פלסמיד </td></tr><tr><td> PGZ108 </td><td> KanMX6 </td><td> 3xFLAG-MNase תיוג, 33 aa מקשר </td><td> 70231 </td></tr><tr><td> PGZ109 </td><td> HIS3MX6 </td><td> 3xFLAG-MNase תיוג, 33 aa מקשר </td><td> 70232 </td></tr><tr><td> PGZ110 </td><td> TRP1 </td><td> 3xFLAG-MNase תיוג, 33 aa מקשר </td><td> 70233 </td></tr><tr><td> PGZ136 </td><td> URA3 </td><td> מבטא 3xFLAG-MNase-SV40 NLS תחת שליטה של ​​האמרגן REB1 </td><td> 72273 </td></tr><tr><td> PGZ173 </td><td> KanMX6 </td><td> תיוג MNase, 8 aa מקשר </td><td> 70234 </td></tr></tbody></table>Ithin-page = &quot;1&quot;&gt; טבלה 1: פרטים על פלסמידים של ChEC. כל תיוג ווקטורים מבוססים על וקטורים pFA6a ולכן הם תואמים את F2 נפוץ F1 / R1 תיוג זוגות. קלטת התיוג מורכבת ממקשר באורך המצוין, אפיטופ 3xFLAG כדי להקל על איתור על ידי סופג המערבי (למעט במקרה של pGZ173, שם המקשר כבר מקוצר כדי להסיר את התג 3xFLAG), שרשרת בוגרת של MNase (GenBank P00644 , Aa 83 - 231), ואת סמן לבחירה הצביע. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כֶּרֶך </td><td> [סופי] </td></tr><tr><td> חיץ 5x PCR </td><td> 10 מ&quot;ל </td><td> 1x (2 מ&quot;מ MgCl 2 ) </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP לערבב (2.5 מ&quot;מ כל dNTP) </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 200 מ&quot;מ (50 מ&quot;מ כל dNTP) </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ פריימר F2 </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ R1 עמ &#39;Rimer </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> PGZ108 / 109/110/172 (1-5 ng / mL) </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> 2 U / μL להתחיל חם פולימרז נאמנות גבוהה </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> / Wrote </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 32.5 מ&quot;ל </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2: תגובה תערובת עבור הגברה PCR של קלטות 3xFLAG-MNase תיוג. F2 / R1 רצפים תחל ניתן למצוא בכתובת http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טמפרטורה (° C) </td><td> זְמַן </td><td> מחזורים </td></tr><tr><td> 98 </td><td> 30 שניות </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 98 </td><td> 10 s </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 55 </td><td> 30 s </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 72 </td&gt; <td> 1 דקות 15 s </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 2 דקות </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> לָנֶצַח </td><td> לְהַחזִיק </td></tr></tbody></table> טבלה 3: תנאי רכיבה תרמיים עבור הגברה PCR של קלטות תיוג 3xFLAG-MNase. הטמפרטורה הדגירה זמן ההארכה ייתכן שיהיה צורך להתאים על בסיס פולימראז DNA בשימוש. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כֶּרֶך </td><td> [סופי] </td></tr><tr><td> חיץ 10x Taq </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td> 1x (1.5 מ&quot;מ MgCl 2 ) </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP לערבב (2.5 מ&quot;מ כל dNTP) </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 200 מ&quot;מ (50 מ&quot;מ כל dNTP) </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ בדוק פריימר </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 0.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ MNase-R או פריימר שליטה שלילית </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 0.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 5 U / מ&quot;ל ​​פולימרז Taq </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 2.5 U </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 41.5 מ&quot;ל </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 4: תערובת התגובה המושבה PCR אישור תיוג MNase. בדוק רצפים תחל ניתן למצוא בכתובת http://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastGFPOligoSequence.txt. פריימר הסימון משמש כפריימר קדימה יחד עם פריימר הפוך בתוך MNase (5&#39;-TTGTGCAGCTTCTTGGTAC-3 &#39;) ופריימר הפוך ~ 500 זוגות (bp) במורד הזרם של הגן המתאים כבקרה שלילית. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טמפרטורה (° C) </td><td> זְמַן </td><td> מחזורים </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 5 דקות </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 30 s </td><td> 35 </Td&gt; </tr><tr><td> 55 </td><td> 30 s </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 68 </td><td> דקה 1 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 68 </td><td> 5 דקות </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> לָנֶצַח </td><td> לְהַחזִיק </td></tr></tbody></table> טבלה 5: תנאי רכיבה תרמית עבור המושבה PCR אישור תיוג MNase. הטמפרטורה הדגירה זמן ההארכה ייתכן שיהיה צורך להתאים על בסיס פולימראז DNA בשימוש. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כֶּרֶך </td><td> [סופי] </td></tr><tr><td> 1 M Tris, pH 7.5 </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td><td> 15 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> 8 מ&quot;ל </td><td> 80 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 0.2 M EGTA </td><td> 50 מ&quot;ל </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> מלאו עד 100מ&quot;ל </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 6: מתכון למאגר א לפני השימוש, להוסיף מחצית מעכב מעכב פרוטאז, 50 μL של 100 מ&quot;מ PMSF (1 מ&quot;מ הסופי), 5 μL של 200 מ&quot;מ spermine (0.2 מ&quot;מ הסופי), ו 2.5 μL של 1 M Spermidine (0.5 מ&quot;מ הסופי) לכל 5 מ&quot;ל של פתרון. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כֶּרֶך </td><td> [סופי] </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 8 מ&quot;ל </td><td> 400 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 0.2 M EGTA </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> מלאו עד 100 מ&quot;ל </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 7: מתכון לפתרון עצירת 2x. שלב 90 μL של סטוP עם 10 μL של SDS 10% בצינור microfuge עבור כל נקודת זמן להילקח (ראה שלב 2.4).

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase). 

Video: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...