אנו מכירים cytometry זרימה USF Core Facility. ברצוננו להודות לד&quot;ר דניס קופר על שיתוף משאבים. אנו רוצים גם להודות מאיה כהן, לורה פנדלטון ודיאנה לאטור על עזרתם בהקמת והסרטה של ​​סרט זה. NN נתמך על ידי גשר NSF FG-LSAMP כדי אחוות דוקטורט HRD # 0929435. עבודה זו מומנה על ידי האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מרכז המחקר גרנט # סרטן 93-032-13/Moffitt הוענק TG.

לפני שמתחילים, להכין את הפתרונות הבאים: 3 מכתים% Media (SM): עוברי -3% בסרום שור (FBS) ב 1X מאגר מלוחים פוספט (PBS) מאגר MACS (MB): - 0.5% אלבומין סרום מ שור (BSA) ב 1XPBS 1. קציר spleens של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת עורי להזריק 6-8 בשבוע של C57BL גיל / 6 עכברים (הרלן) עם 1.5 x 10 5 Murine Panc02 תאים תלויה 100 μl 1x PBS (גידול נושאת; TB). עכברים שליטה (נאיבי) מקבלים 100 1XPBS μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 4 שבועות הזרקת הודעה, להרדים עכברים ידי מחנק פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spleens קציר מעכברים ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים ושוקלים באמצעות איזון. Spleens מקום ב נפרד, שכותרתו 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי המכילים 1 X PBS. </li></ol> 2. צור מתא בודד Suspension של Leukocytes מ spleens הנהלים כל יש לבצע בסביבה סטרילית מתחת למכסה המנוע בטיחות ביולוגית תאים ונוגדנים שמרו על הקרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התא דיסוציאציה מסננת ידי הוספת מסך רשת לתוך פתח הספל לתחתית. לאחר מכן, הכנס את הטבעת שמירה לאזור הליכי עם הצד מחוררת ולשימוש המפתח טבעת להדק את הטבעת שמירה, ובכך מחזיק את המסך במקום. מניחים את המסננת התאספו בצלחת פטרי שמכילה 10 מ&quot;ל 1 X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spleens ביליארד וזכוכית ועלי שימוש לטחון spleens על המסך רשת של תאים דיסוציאציה מסננת לתוך צלחת פטרי. חזור על הפעולה עבור כל קבוצת טיפול של עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא ההשעיה מסנן לתוך צינור מ&quot;ל 50 חרוטי באמצעות תא 70 מיקרומטר מסננת פיפטה 5 מ&quot;ל סרולוגית. סרכזת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend גלולה של 5 מ&quot;ל 1 חיץ RBC x תמוגה לכל הטחול. Pipet למעלה ולמטה במרץ. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לעצור את התגובה על ידי הוספת 20 מ&quot;ל של 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ. סרכזת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 20 מ&quot;ל סטרילי 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות trypan כחול hemacytometer ו resuspend בריכוז הרצוי SM 3% עד 50 μl שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 -7 תאים / מ&quot;ל - 2x10 7 תאים / מ&quot;ל). </li></ol> 3. על פני קרום התא מכתים / Immunophenotyping של MDSC באמצעות cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג את הבארות של צלחת 96-V גם למטה לבקרה דגימות הניסוי וכתמים בודדים עבור פקדים פיצויים (לא כתם, NS, Mac-1-FITC, Gr-1-APC ו DAPI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5x10 5-1x10 6 תאים שווה ערך ל μl 50 / היטב splenocytes לבארות שלהם בצלחת V-96-התחתונה גם כן. סרכזתצלחת ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &quot;מיקס מאסטר&quot; (מ&quot;מ) של עכבר BD Fc בלוק (אנטי עכבר עכברוש CD16/32 נוגדן חד שבטי) מדולל SM 3%, בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל על הקרח. כנקודת מוצא, השתמש 1 מיקרוגרם Fc בלוק ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לפי היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב על ידי צלחת היפוך במהירות מצד אל צד, על מיכל הפסולת או כיור ללא הפרעה של כדורי סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, בקצרה סרכזת MM Fc חסום למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לכל כדורי בצלחת V-96-התחתונה גם כן. מערבבים היטב בעדינות pipetting למעלה ולמטה, והשאיר הדגימות בבארות שלהם. דגירה הצלחת במשך 15 דקות בחושך על הקרח. סרכזת צלחת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &quot;מיקס מאסטר&quot; (מ&quot;מ) של fluorochrome-מצומדות נוגדנים בדילול ב SM 3% בצינור microcentrifuge 1.5ml על הקרח, בעוד דגימות דגירה עם בלוק FC. נוגדנים יש טיטרציהכדי לקבוע דילולים אופטימליים מכתים ההליכים. כנקודת מוצא, לשלב דילול של 1:25 Mac-1-FITC ו 1:20 דילול של Gr-1-APC ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לדגימה גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, בקצרה סרכזת מ&quot;מ ניאון מצומדות נוגדנים צביעה למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לשלוט כדורי ניסיוניים. מערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. עבור יחיד כתם פיצויים, להוסיף דילול של 1:25 Mac-1-FITC, 1:20 דילול של Gr-1-APC ו 75 ng / mL של DAPI, ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 דולר גם לבארות, בהתאמה. הוסף 50 μl SM 3% ל בלא כתם היטב (לא הכתם). מערבבים היטב דגירה תאים 96-גם צלחת V-התחתונה למשך 30 דקות בחושך על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS תווית צינורות (5 מ&quot;ל, 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ קלקר עגולים צינורות למטה) כדי מתאימות גם כל צלחת גם 96-V-התחתונה. הוסף 200 μl SM 3% לכל אחד FACSצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת צלחת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות ולהסיר supernatants. לשטוף את כדורי על ידי הוספת 100 SM 3% μl לכל גלולה ומערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. סרכזת צלחת 12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. חזור על שלב לשטוף שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל. Resuspend כל גלולה ב SM 100 3% μl ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl גלולה resuspended מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב צינור FACS שכותרתו בהתאמה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח תזרים cytometry, להוסיף 75 ng / ml DAPI לשלוט דגימות ניסויים ובקרה DAPI אחת פיצוי הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע cytometric זרימת נתונים רכישת אחוזי MDSC. לבצע באמצעות פיצוי שלילי (אין שליטה כתם) ואת בקרות חיוביות בודדות. הגדר את העלילה נקודה המציג פיזור קדימה (FSC) לעומת הצד (SSC) בהיקף התחבר כדי אוכלוסיות של ליקוציטעניין ניתן לזהות. צייר שער גדול על כל leukocytes, למעט פסולת גושים עם קדימה הנמוך ביותר ולפזר בצד. מהשער אב זה, ליצור עלילה נקודה חדשה המציגה SSC לעומת DAPI והשער על DAPI-(Live) תאים. בחר אוכלוסיה מגודרת החדש וליצור עלילה נקודה המציג Mac-1 לעומת GR-1 ושער חיובית כפולה על שלך (Mac-1 + GR-1 +) MDSC. </li></ol> 4. העשרה המגנטי של GR-1 + Leukocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x10 aliquot 7 leukocytes בלא כתם הנותרים לתוך צינורות FACS שכותרתו כראוי צנטריפוגות ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן MM של נוגדנים Gr-1-PE בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 1:10 של נוגדנים Gr-1-PE ב -50 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ&quot;מ אנטי-PE microbeads בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 01:04 נגד PE microbeads ב 200 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל&quot;ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של SB. לסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש, שכותרתו 50 מ&quot;ל חרוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ראש אוטומטי MACS מפריד Pro. מילוי בקבוקים עם כל הפתרונות המתאימים ולרוקן בקבוק פסולת, במידת הצורך. הפעל על מכשיר ולבחון מעמדה של נוזלים מכלי ועמודה (ים) לאחר אתחול. כל הסמלים צריך להיות ירוק. בתפריט, בחר &quot;הפרדה&quot; מן העליון<html> שורת התפריטים ואחריו &quot;לשטוף עכשיו&quot; משורת התפריטים נמוכה יותר. בחר &quot;לשטוף&quot; מן האפשרות מוקפץ ואחריו &quot;הפעלה&quot; כדי להתחיל את תהליך תחול. לאחר תהליך תחול הושלמה בהצלחה, המכשיר לאחר מכן להציג כי הוא &quot;מוכן ההפרדה&quot; תחת תפריט מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר צינור מתאים מדף מצונן עבור גדלים צינור ומקום 50 מ&quot;ל צינור חרוטי עם תאים שכותרתו מגנטית ברציפות, 50 מ&quot;ל צינור חרוטי עבור אוסף חלק שלילי ב שורה 15 צינור חרוטי מ&quot;ל לאיסוף חלק חיובי בשורה ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;POSSEL_S&quot; הפרדת תאים תוכנית סלקציה חיובית של תאים היעד המוגדרים במצב רגיש דגימות. תאים היעד שכותרתו מגנטית נשמרות על עמודה האוטומטים, התאים שהוסרו מהן תוויות משתחררים לתוך צינור חלק שלילית האוסף ב &#39;בשורה על הכחשה אוטומטי של המגנט, התאים היעד שכותרתו ישוחררו לתוך צינור איסוף חיובי C שורה של הצינור מתלה. </li></ol>&gt; 5. לאחר מיון ניתוח GR-1 + Leukocytes מועשר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספר GR-1 + ו-GR-1 - שברים באמצעות trypan כחול hemacytometer. תאים Resuspend בריכוז הרצוי בינוני מכתים 3%, כך 50 μl הוא שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 7 תאים / מ&quot;ל - 2x10 7 תאים / מ&quot;ל) ולהעביר 50 μl לצינורות FACS שכותרתו בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ&quot;מ Mac-1 בלבד, בדילול 1:25 ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 לדגימה. כתם תאים ולהכין פיצויים כתם יחיד של GR-PE, Mac-1 ו FITC DAPI לניתוח cytometry הזרימה. הוספת 200 SM 3% μl וצבע DAPI הכדאיות כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע הרכישה cytometric זרימת נתונים כדי לקבוע GR-1 + ו-GR-1 - אחוזים וכן גם להשוות את אחוזי MDSC העשרת לפני ואחרי-autoMACS. </li></ol> 6. נציג תוצאות כאן אנו מראים R<html> תוצאות epresentative עבור העשרת autoMACS של GR-1 + leukocytes מ, spleens אספו נאיביות עבור FACS הבאים המיון של MDSC (איור 1). 1x10 6 leukocytes נאיביות הוכתמו Mac-1-FITC ו Gr-1-APC הנוגדנים לזהות אחוזי MDSC באמצעות מכשיר LSRII BD, לפני מיון autoMACS. 1x10 7 leukocytes הנאיביים היו מוכתמים מכן עם אנטי GR-1-PE נוגדנים PE-microbeads עבור העשרת GR-1 + leukocytes באמצעות מפריד Pro autoMACS. לאחר autoMACS העשרה, GR-1 אחוזים ב GR-1 + ו-GR-1 - שברים אסף הוערכו באמצעות cytometry הזרימה. 1x10 6 GR-1 + leukocytes הוסרו מוכתם נוגדנים Mac-1-FITC לנתח ולהשוות אחוזים של MDSC מועשר, אספו leukocytes תמימים שאינם מועשר, נקווה הגידול נושאות leukocytes ידי cytometry הזרימה. fig1.jpg &quot;/&gt; 1. איור AutoMACS העשרת נאיביות GR-1 + leukocytes עבור FACS MDSC מיון. Spleens נקצרו מעכברים הלבלב הגידול נושאות ותמים מעובד לתוך תא יחיד המתלים. Cytometry זרימה ניתוח של השטח leukocytes נאיבי מוכתם Mac-1 ו-GR-1 ניאון מצומדות נוגדנים, לפני העשרה autoMACS (א &#39;). Cytometry זרימה ניתוח GR-1 + (ב) ו - GR-1 - (ג) שברים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leuckocytes נאיביות אספו מוכתמים GR-1-PE נוגדנים נגד PE microbeads. Cytometry זרימה ניתוח MDSC ו Gr-1 + אחוזים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leukocytes נאיביות אספו (ד &#39;) לעומת הלא מועשר leukocytes אספו מן הגידול נושאות עכברים (ה) (עכברים נאיביות, N = 5 ; הגידול נושאות עכברים, N = 3). MDSC ו GR-1 אחוזים הם מגודרת בחלקות גובה ו היסטוגרמות מייצגים.

<ol>
	<li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection:+involvement+of+Ly6G+(Gr1(+))CD11b(+)+immature+myeloid+suppressor+cells.">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li><li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11b+Ly-6C(hi)+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li><li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11b+/Gr-1++myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress.">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li><li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses.">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li><li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease.">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li><li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models.">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li><li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8++T+cells.">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li><li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma.">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li><li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases.">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li><li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li><li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets,+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells.">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li><li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function.">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils.">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li><li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process.">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li><li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separations+by+flow+cytometry.">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li><li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry.">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li><li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters.">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li><li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li><li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells.">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li><li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment.">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li><li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures.">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li><li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+(Treg)+and+effector+T+cells+to+rapamycin.">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

זוהי שיטה מפורטת עיבוד immunophentyping אוכלוסיות MDSC כי הוא ישים הלימפה ברקמות שונות במודלים של בעלי חיים שונים. בפרט, להעשרת autoMACS יכול לשמש לבידוד של אוכלוסיות ליקוציט שונים, כולל דלדול-1 Gr של splenocytes 4, טיהור תת מיאלואידית מ splenocytes ובלוטות לימפה 5, בידוד של נויטרופי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> החברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פוספט 1X שנאגרו מלוחים </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / 2 + Mg / פנול אדום ללא </td></tr><tr><td> אלבומין סרום מ שור (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> בואו BSA לפזר ללא הפרעה PBS, סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> העובר שור סרום (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> מחממים מומת, סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> אנטי עכבר חולדה CD16/32 נוגדנים חד שבטיים (FC בלוק) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> נגד העכבר CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> סטריליסביבה </td></tr><tr><td> נגד העכבר Ly6G (גרם-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> נגד העכבר Ly6G (גרם-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> דילול הסביבה סידורי סטרילי </td></tr><tr><td> תא דיסוציאציה Sieve </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1KT </td><td> החיטוי לפני השימוש </td></tr><tr><td> 70 מיקרומטר מסננת </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> 1X RBC מאגר תמוגה </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש, סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> פטרי מנות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-757-12 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל קוןical צינורות </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל 12X75mm עגולים קלקר בתחתית צינורות </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> סביבה סטרילית, המכונה צינורות FACS </td></tr><tr><td> 96 היטב V-התחתונה צלחות </td><td> קורנינג </td><td> 3897 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> PE microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-048-801 </td><td> סביבה סטרילית </td></tr><tr><td> AutoMACS מפריד Pro </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS עמודות </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS הפעלת מאגר </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

preparation of myeloid derived suppressor cells (mdsc) from naive and pancreatic tumor-bearing mice using flow cytometry and automated magnetic activated cell sorting (automacs)

MDSC הם אוכלוסיה הטרוגנית של מקרופאגים בוגרים, אלא תאים דנדריטים ו גרנולוציטים המצטברים באיברים הלימפה במצבים פתולוגיים כולל זיהום טפילי דלקת, טראומה, השתל נגד מארח מחלות, סוכרת וסרטן 1-7. בעכברים, MDSC אקספרס Mac-1 (CD11b) ו Gr-1 (Ly6G ו Ly6C) אנטיגנים פני 7. חשוב לציין כי MDSC נלמדים גם בגידול נושאות צבאות שונים שם הם התרחבו באופן משמעותי ולדכא אנטי סרטניים התגובה החיסונית לעומת עמיתיהם נאיביות 7-10. עם זאת, בהתאם למצב פתולוגי, יש subpopulations שונים של MDSC עם מנגנוני ויעדים שונים של דיכוי 11,12. לכן, שיטות יעילות לבודד אוכלוסיות MDSC קיימא חשובים הבהרת המנגנונים המולקולריים השונים של דיכוי במבחנה in vivo. לאחרונה, ה-Ghansah הקבוצה דיווחה על הרחבת MDSC ב מודל הלבלב Murine סרטן. MDSC הגידול נושאת שלנו להציג הפסד של הומאוסטזיס והגדילה את הפונקציה מדכאים לעומת MDSC תמים 13. אחוזי MDSC באופן משמעותי פחות תאים הלימפה של עכברים תמימים לעומת הגידול נושאת. זוהי אזהרה גדול, אשר לעתים קרובות מעכבת ניתוחים השוואתיים מדויקים של MDSC אלה. לכן, להעשיר GR-1 + leukocytes מעכברים תמימים לפני מיון Fluorescence Cell הופעל (FACS) משפר, הכדאיות טוהר מפחית באופן משמעותי את זמן המיון. עם זאת, העשרת GR-1 + leukocytes מן הגידול נושאות עכברים היא אופציונלית כמו אלה בשפע עבור FACS מהירים מיון. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה היעילה ביותר של immunophenotyping MDSC ומעשירה GR-1 + leukocytes מן spleens של עכברים תמימים למיון MDSC מבעוד מועד. Immunocompetent עכברים C57BL / 6, מחוסן עם Murine Panc02 לספירהlls מתחת לעור ואילו עכברים תמימים לקבל 1XPBS. כ 30 ימים לפרסם חיסון; spleens נקצרים ומעובדים מתא בודד השעיות באמצעות תא דיסוציאציה מסננת. Splenocytes הן מכן כדורית דם אדומה (RBC) lysed ו aliquot של leukocytes אלה מוכתמות באמצעות fluorochrome-מצומדות נוגדנים נגד Mac-1 ו-GR-1 לאחוזים immunophenotype MDSC באמצעות cytometry הזרימה. בניסוי מקביל, leukocytes שלמים מעכברים נאיביות מגואלות ניאון מצומדות GR-1 נוגדנים, מודגרות עם PE-microbeads נבחרים באופן חיובי באמצעות מיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (autoMACS) Pro מפריד. לאחר מכן, aliquot של GR-1 + leukocytes מגואלות Mac-1 הנוגדנים לזהות את הגידול באחוזים MDSC באמצעות cytometry הזרימה. עכשיו, אלה + Gr1 leukocytes מועשר מוכנים FACS המיון של MDSC לשימוש בניתוחים השוואתיים (נאיבי לעומת הגידול נושאת) ב in vivo ו in vitro </em&gt; מבחני.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell S

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

זוהי שיטה מהירה ומקיפה של immunophenotyping מיאלואידית תאים מדכאי נגזרות (MDSC) ומעשירה GR-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukocytes מ spleens עכבר. שיטה זו משתמשת cytometry זרימה נייד AutoMACS מיון להעשיר קיימא עבור GR-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukocytes שקדמו FACS המיון של MDSC לשימוש<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני.

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

26.1K Views.  University of South Florida Morsani College of Medicine. זוהי שיטה מהירה ומקיפה של immunophenotyping מיאלואידית תאים מדכאי נגזרות (MDSC) ומעשירה GR-1 + Leukocytes מ spleens עכבר. שיטה זו משתמשת cytometry זרימה נייד AutoMACS מיון להעשיר קיימא עבור GR-1 + Leukocytes שקדמו FACS המיון של MDSC לשימוש In vivo ו במבחנה מבחני.

Video: Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

אימות של Nanobody ונוגדנים מבוסס<em&gt; In vivo</em&gt; ניסויי גידול xenograft NIRF הדמיה בעכברים באמצעות<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytometry הזרימה ומיקרוסקופי

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה (<em&gt; Aeruginosa Microcystis</em&gt;) שימוש cytometry הזרימה

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.