Nous reconnaissons le flux USF cytométrie Core Facility. Nous tenons à remercier le Dr Denise Cooper pour le partage des ressources. Nous aimerions également remercier Maya Cohen, Laura Pendleton et Diana Latour pour leur aide dans la mise en place et le tournage de cette vidéo. NN soutenu par la NSF FG-LSAMP pont à la bourse de doctorat DRH # 0929435. Ce travail a été financé par l&#39;American Cancer Society Research Grant # institutionnel 93-032-13/Moffitt Cancer Center attribué à TG.

Avant de commencer, préparer les solutions suivantes: 3% de coloration des médias (SM): -3% De sérum bovin foetal (FBS) dans 1X tampon phosphate salin (PBS) MACS tampon (Mo): - 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans 1XPBS 1. Les rates de récolte provenant de souris <ol><li> Voie sous-cutanée d&#39;injecter 6-8 semaines d&#39;âge C57BL / 6 souris (Harlan) avec 1,5 x 10 5 murins Panc02 cellules en suspension dans 100 ul de PBS 1x (porteur de tumeurs; TB). Les souris témoins (Naïve) de recevoir 100 1XPBS ul. </li><li> Environ quatre semaines après l&#39;injection, les souris euthanasier par asphyxie de dioxyde de carbone. </li><li> Rates de récolte de la souris par dissection aide de pinces et ciseaux, puis peser à l&#39;aide d&#39;un équilibre. Placer les rates séparé, étiqueté tubes de 50 ml coniques contenant 1 x PBS. </li></ol> 2. Générer un Fourches unicellulairen des leucocytes de la rate Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique et les cellules et d&#39;anticorps conservés sur la glace. <ol><li> Assembler le tamis de dissociation cellulaire par l&#39;insertion du tamis à mailles dans l&#39;ouverture de la coupelle vers le bas. Ensuite, insérez la bague de retenue dans la zone filetée avec le côté rainuré et d&#39;utiliser le porte-clés pour serrer la bague de retenue, tenant ainsi à l&#39;écran en place. Placez le tamis monté dans une boîte de Pétri contenant 10 ml 1 x PBS. </li><li> Rates Piscine et pilon en verre utilisation pour moudre la rate contre le grillage de la cellule de dissociation tamis et dans la boîte de Pétri. Répétez l&#39;opération pour chaque groupe de traitement de la souris. </li><li> Suspension cellulaire filtre dans un tube de 50 ml conique à l&#39;aide d&#39;une passoire 70 um cellulaire et d&#39;une pipette de 5 ml sérologique. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml 1 x tampon de lyse RBC par la rate. Pipet et vigoureusement vers le bas. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Arrêter la réaction en ajoutant 20 ml de 1 x PBS. Pipet et vigoureusement vers le bas. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 20 ml de PBS stérile 1 x. Pipet et vigoureusement vers le bas. </li><li> Compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémacytomètre et resuspendre à la concentration désirée en SM 3% de telle sorte que 50 pl est équivalente à 5x10 5-1x10 6 cellules (1x10 7 cellules / ml - 2x10 7 cellules / ml). </li></ol> 3. Cell-surface de coloration / immunophénotypage des MDSC par cytométrie en flux <ol><li> Étiquetez les puits d&#39;une plaque de 96 puits fond en V pour le contrôle et les échantillons expérimentaux et des taches simples pour les contrôles de rémunération (n ° Teinté, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC et DAPI). </li><li> Ajouter 5x10 5-1x10 6 cellules équivalentes à 50 pl / puits de splénocytes à leurs puits respectifs dans le 96-V-même la plaque inférieure. Centrifugerplaque à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Préparer &quot;Mix Master&quot; (MM) de la souris BD Bloquer Fc (rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal) dilué dans SM 3%, dans un microtube de 1,5 ml sur la glace. Comme point de départ, utilisez 1 ug Fc Bloquer dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits. </li><li> Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure en mettant rapidement inverser la plaque sur et à l&#39;arrière, sur un conteneur à déchets ou dans l&#39;évier sans interruption des culots cellulaires. </li><li> Vortex, centrifuger brièvement MM Bloquer Fc pendant 5 secondes et ajouter 50 ul à tous les granulés dans le 96-V-même la plaque inférieure. Bien mélanger en douceur pipetant, laissant des échantillons dans leurs puits. Incuber la plaque pendant 15 min dans l&#39;obscurité sur la glace. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Préparer &quot;Mix Master&quot; (MM) de fluorochrome-anticorps conjugués dilués dans SM 3% dans un microtube de 1,5 ml sur la glace, tandis que les échantillons incuber avec le bloc Fc. Anticorps doit être adaptéepour déterminer les dilutions optimales pour les procédures de coloration. Comme point de départ, combiner une dilution 1:25 de Mac-1-FITC et dilution 1:20 de Gr-1-APC dans SM 3% pour un volume final de 50 ul, par échantillon. </li><li> Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment. </li><li> Vortex, centrifuger brièvement MM d&#39;anticorps conjugués coloration fluorescente pendant 5 secondes et ajouter 50 ul de contrôle et de pastilles expérimentales. Bien mélanger en douceur pipetant. Pour une seule tache compensations, ajoutez une dilution 1:25 de Mac-1-FITC, dilution 1:20 de Gr-1-APC et 75 ng / ml de DAPI, dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits à leurs puits respectifs. Ajouter 50 ul SM 3% à souillé bien (aucune tache). Bien mélanger et incuber les cellules dans 96 puits à fond en V plaque pendant 30 min dans l&#39;obscurité sur la glace. </li><li> FACS étiquettes des tubes (5 ml, 12 mm x 75 mm tubes en polystyrène fond rond) pour correspondre à chaque puits de la plaque de 96 puits à fond en V. Ajouter 200 ul SM 3% à chaque FACSTube. </li><li> Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min et retirez surnageants. Laver granulés par addition de 100 ul SM 3% à chaque pastille et bien mélanger délicatement par aspiration et refoulement. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. Répétez l&#39;étape laver une fois de plus. </li><li> Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment. Remettre en suspension chaque culot dans 100 SM 3% ul et bien mélanger. </li><li> Transférer 100 ul culot remis en suspension à partir de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure à leur tube FACS respectivement étiquetés. </li><li> Avant l&#39;analyse des flux cytométrie, ajouter 75 ng / ml de DAPI à contrôler et échantillons expérimentaux et de contrôle unique de compensation DAPI tache. </li><li> Effectuer flux d&#39;acquisition de données par cytométrie de pourcentages MDSC. Effectuer une compensation utilisant le négatif (pas de contrôle tache) et les contrôles simples positifs. Mettre en place un dot plot qui affiche la diffusion vers l&#39;avant (FSC) par rapport à côté (SSC) en échelle logarithmique afin que les populations de leucocytes deintérêt peut être identifié. Dessiner une grande porte sur tous les leucocytes, à l&#39;exclusion des débris et des bouquets avec le plus bas vers l&#39;avant et la diffusion latérale. De cette porte parent, créez un tracé nouveau point qui affiche SSC par rapport DAPI et porte sur DAPI-(live) des cellules. Sélectionnez cette population nouvellement fermé et créer un nuage de points qui affiche Mac-1 par rapport Gr-1 et la porte sur votre positif double (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC. </li></ol> 4. Enrichissement magnétique de GR-1 + de leucocytes <ol><li> Aliquotes 1x10 7 autres leucocytes non colorés dans des tubes FACS étiquetés de façon appropriée et centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. </li><li> Préparer MM de Gr-1-PE anticorps dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 7 cellules, utilisez une dilution 1:10 de Gr-1-PE anticorps dans 50 Mo ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l&#39;échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li&gt; <li> Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant. </li><li> Préparer MM de l&#39;Anti-PE microbilles dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 7 cellules, utiliser une dilution 1:04 de l&#39;anti-PE microbilles dans 200 MB ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l&#39;échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 ml de SB. Filtrez dans une passoire 70 um dans une nouvelle, marquée tube de 50 ml conique. </li><li> Préparer et le Premier MACS Auto Pro Separator. Recharge toutes les bouteilles avec les solutions appropriées et de vider la bouteille de déchets, si nécessaire. Activer instrument sur et examiner l&#39;état de récipients de fluide et de colonne (s) après l&#39;initialisation. Tous les symboles doivent être de couleur verte. Dans le menu, sélectionnez &quot;Séparation&quot; de la partie supérieurebarre de menu puis &quot;Lavez maintenant&quot; de la barre de menu inférieure. Sélectionnez &quot;Rinçage&quot; de l&#39;option pop-up suivi de &quot;Run&quot; pour démarrer le processus d&#39;amorçage. Une fois le processus d&#39;amorçage est terminé avec succès, l&#39;instrument affichera alors qu&#39;il est &quot;prêt pour la séparation&quot; dans le menu Status. </li><li> Choisissez convient portoir réfrigéré pour les tailles de tubes et les placer tube de 50 ml conique avec des cellules marquées magnétiquement dans la ligne A, 50 ml tube conique pour la collecte de la fraction négative à la ligne B et 15 ml tube conique pour la collecte de fraction positive dans la ligne C. </li><li> Choisissez &quot;POSSEL_S&quot; programme de séparation des cellules pour la sélection positive des cellules cibles marquées en mode sensible à partir d&#39;échantillons. Cellules cibles marquées magnétiquement sont retenus sur la colonne automates; cellules non marquées sont libérés dans le tube de prélèvement fraction négative dans B. Sur la ligne de rétraction automatique de l&#39;aimant, les cellules cibles marquées seront libérés dans le tube de prélèvement positif à la ligne C du tube crémaillère. </li></ol>+ de leucocytes enrichies <ol><li> Recount Gr-1 + et Gr-1 - fractions en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre. Resuspendre les cellules à concentration souhaitée dans le milieu de coloration 3% alors que 50 ul est équivalent à 5x10 5-1x10 6 cellules (1x10 7 cellules / ml - 2x10 7 cellules / ml) et le transfert de 50 pi à conséquence étiquetés tubes FACS. </li><li> Préparer un MM de Mac-1 seulement, à une dilution 1:25 dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par échantillon. Colorer les cellules et de préparer simples compensations taches de Gr-PE, Mac-1 FITC et DAPI pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. Ajouter 200 pi 3% SM et le colorant DAPI viabilité comme décrit précédemment. </li><li> Effectuer flux d&#39;acquisition par cytométrie de données pour déterminer Gr-1 + et Gr-1 - pourcentages et aussi comparer les pourcentages MDSC enrichissement pré-et post-autoMACS. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Ici, nous montrons r<html> résultats eprésentant pour l&#39;enrichissement autoMACS de Gr-1 + leucocytes à partir du mélange, la rate naïfs pour FACS ultérieures de tri du MDSC (Figure 1). 1x10 6 leucocytes naïfs ont été colorées avec Mac-1-FITC et Gr-1-APC anticorps pour identifier les pourcentages MDSC en utilisant un instrument BD LSRII, avant tri autoMACS. 1x10 7 leucocytes naïfs ont ensuite été colorées avec des anticorps anti-Gr-1-PE anticorps et PE-Microbilles pour l&#39;enrichissement de la Gr-1 + leucocytes en utilisant un séparateur autoMACS Pro. Post-autoMACS enrichissement, GR-1 pourcentages en Gr-1 + et Gr-1 - fractions recueillies ont été évaluées en utilisant la cytométrie de flux. 1x10 6 Gr-1 + de leucocytes ont été enlevés et colorées avec Mac-1-FITC anticorps à analyser et à comparer les pourcentages de MDSC enrichi, mis en commun des leucocytes naïfs à la non-enrichi, mis en commun porteuses de tumeurs leucocytes par cytométrie de flux. fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. L&#39;enrichissement autoMACS de Naïve Gr-1 + leucocytes pour FACS MDSC de tri. Les rates ont été récoltées à partir de souris porteuses de tumeurs pancréatiques et naïf et transformé en mono-cellulaires suspensions. Cytométrie en flux de surface de leucocytes colorés avec naïfs Mac-1 et Gr-1 fluorescente-conjugués d&#39;anticorps, avant l&#39;enrichissement autoMACS (A). L&#39;analyse par cytométrie en flux de Gr-1 + (B) et Gr-1 - (C) des fractions post-autoMACS enrichissement de Gr-1 + cellules de mise en commun leuckocytes naïfs colorées avec Gr-1-PE et des anticorps anti-PE microbilles. L&#39;analyse par cytométrie en flux du MDSC et Gr-1 + pourcentages post-autoMACS enrichissement de Gr-1 + de cellules de mise en commun des leucocytes naïfs (D) par rapport aux non-enrichis leucocytes communs de souris porteuses de tumeurs (E) (souris naïves, n = 5 ; souris porteuses de tumeurs, n = 3). MDSC et GR-1 pourcentages sont déclenchés dans les tracés de contours représentatives et des histogrammes.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Il s&#39;agit d&#39;une méthode détaillée pour le traitement et immunophentyping populations MDSC qui est applicable à différents tissus lymphoïdes de modèles animaux différents. En particulier, l&#39;enrichissement autoMACS peut être utilisé pour l&#39;isolement des différents populations de leucocytes comprenant Gr-1 épuisement des splénocytes 4, la purification de sous-ensembles à partir de splénocytes myéloïdes et les ganglions lymphatiques 5, isolement de la moelle osseuse neu...

<table border="1"><tbody><tr><td> REACTIF </td><td> SOCIÉTÉ </td><td> Catalogue </td><td> COMMENTAIRES </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline 1X </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / Mg 2 + / rouge de phénol libre </td></tr><tr><td> L&#39;albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Laissez dissoudre BSA intacte dans du PBS; Environnement stérile </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> Inactivé par la chaleur; Environnement stérile </td></tr><tr><td> Rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal (Fc Bloquer) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Anti-souris CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> StérileEnvironnement </td></tr><tr><td> Anti-souris Ly6G (Gr-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Anti-souris Ly6G (Gr-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> Environnement dilution en série stérile </td></tr><tr><td> Dissociation cellulaire Sieve </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1kt </td><td> Autoclave avant utilisation </td></tr><tr><td> 70-um crépine </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Tampon de lyse 1X RBC </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> Chaud à la température ambiante avant utilisation; Environnement stérile </td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> 50ml contubes iCal </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm tubes en polystyrène fond rond </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> Connu sous le nom tubes FACS; Environnement stérile </td></tr><tr><td> 96 puits à fond en V plaques </td><td> Corning </td><td> 3897 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> Bleu de Trypan </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> PE Microbilles </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> Environnement stérile </td></tr><tr><td> AutoMACS Pro Separator </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes autoMACS </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS course tampon </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

preparation of myeloid derived suppressor cells (mdsc) from naive and pancreatic tumor-bearing mice using flow cytometry and automated magnetic activated cell sorting (automacs)

MDSC sont une population hétérogène de macrophages, les cellules dendritiques immatures et des granulocytes qui s&#39;accumulent dans les organes lymphoïdes dans des conditions pathologiques, y compris les infections parasitaires, l&#39;inflammation, le stress traumatique, réaction du greffon contre l&#39;hôte, le diabète et le cancer 1-7. Chez la souris, MDSC expresse Mac-1 (CD11b) et Gr-1 (Ly6G et Ly6C) antigènes de surface 7. Il est important de noter que MDSC sont bien étudiés dans divers porteurs d&#39;une tumeur hôtes où ils sont sensiblement élargies et réprimer les anti-tumoraux des réponses immunitaires par rapport à leurs homologues naïfs 7-10. Toutefois, en fonction de l&#39;état pathologique, il ya différentes sous-populations de MDSC avec des mécanismes distincts et les cibles de la répression 11,12. Par conséquent, des méthodes efficaces pour isoler des populations viables MDSC sont importants dans l&#39;élucidation de leurs différents mécanismes moléculaires de la suppression in vitro et in vivo. Récemment, le Ghansah groupe a signalé l&#39;expansion de la MDSC dans un modèle murin du cancer du pancréas. Notre porteur de tumeurs MDSC afficher une perte de l&#39;homéostasie et augmentation de la fonction suppressive par rapport à naïve MDSC 13. Pourcentages MDSC sont beaucoup moins dans les compartiments lymphoïdes de souris naïves vs porteur de tumeurs. Il s&#39;agit d&#39;une mise en garde majeure, qui empêche souvent les analyses comparatives précises de ces MDSC. Par conséquent, l&#39;enrichissement de Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) améliore la pureté, la viabilité et réduit considérablement le temps de tri. Toutefois, l&#39;enrichissement de la Gr-1 + leucocytes de souris porteuses de tumeurs est facultative car ceux-ci sont en abondance pour FACS rapides de tri. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons une méthode très efficace de immunophénotypage MDSC et enrichissante Gr-1 + leucocytes de la rate de souris naïves pour le tri MDSC en temps opportun. Immunocompétents souris C57BL / 6 sont inoculés avec murin Panc02 CElls voie sous-cutanée alors que les souris naïves recevoir 1XPBS. Environ 30 jours après l&#39;inoculation; rates sont récoltées et transformées en une seule cellule suspensions en utilisant un tamis de dissociation cellulaire. Les splénocytes sont ensuite globules rouges (RBC) lysées et une aliquote de ces leucocytes sont colorés en utilisant conjugués au fluorochrome des anticorps contre Mac-1 et Gr-1 à des pourcentages immunophénotype MDSC par cytométrie en flux. Dans une expérience parallèle, les leucocytes entiers de souris naïves sont colorées avec fluorescente conjugués GR-1, incubées avec des anticorps PE-microbilles et sélectionné de façon positive à l&#39;aide un système automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) Pro Separator. Ensuite, une aliquote de GR-1 + de leucocytes sont colorés avec Mac-1 anticorps pour identifier les l&#39;augmentation des pourcentages MDSC par cytométrie en flux. Maintenant, ces Gr1 + de leucocytes enrichis sont prêts pour tri par FACS du MDSC à être utilisé dans les analyses comparatives (naïve vs porteur de tumeurs) in vivo et in vitro </em&gt; tests.

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Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

C&#39;est une méthode rapide et complète de l&#39;immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l&#39;enrichissement de Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leucocytes de la rate de souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et cellulaire autoMACS tri pour enrichir viable Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leucocytes avant tri par FACS du MDSC pour une utilisation<em&gt; In vivo</em&gt; Et<em&gt; In vitro</em&gt; Tests.

Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

26.1K vues.  University of South Florida Morsani College of Medicine. C'est une méthode rapide et complète de l'immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l'enrichissement de Gr-1 + Leucocytes de la rate de souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et cellulaire autoMACS tri pour enrichir viable Gr-1 + Leucocytes avant tri par FACS du MDSC pour une utilisation In vivo Et In vitro Tests.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Recherche

Médecine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validation des Nanobodies et Anticorps Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytométrie en flux et microscopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. Determining the real time state of a microbial cell goes beyond live or dead categories, as microbes can exist in a dormant state, whereby cell division and metabolic activities are reduced. Given the need for detection and quantification of microbes, flow cytometry (FCM) with molecular probes provides a rapid and accurate method to help determine overall population viability. By using SYTOX Green and SYTOX Orange in the model cyanobacteria Microcystis aeruginosa to detect membrane integrity, we develop a transferable method for rapid indication of single cell mortality. The molecular probes used within this journal will be referred to as green or orange nucleic acid probes respectively (although there are other products with similar excitation and emission wavelengths that have a comparable modes of action, we specifically refer to the fore mentioned probes). Protocols using molecular probes vary between species, differing principally in concentration and incubation times. Following this protocol set out on M.aeruginosa the green nucleic acid probe was optimized at concentrations of 0.5 &#181;M after 30 min of incubation and the orange nucleic acid probe at 1 &#181;M after 10 min. In both probes concentrations less than the stated optimal led to an under reporting of cells with membrane damage. Conversely, 5 &#181;M concentrations and higher in both probes exhibited a type of non-specific staining, whereby &#39;live&#39; cells produced a target fluorescence, leading to an over representation of &#39;non-viable&#39; cell numbers. The positive controls (heat-killed) provided testable dead biomass, although the appropriateness of control generation remains subject to debate. By demonstrating a logical sequence of steps for optimizing the green and orange nucleic acid probes we demonstrate how to create a protocol that can be used to analyse cyanobacterial physiological state effectively.

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Microbial populations contain substantial cell heterogeneity, which can dictate overall behavior. Molecular probe analysis through flow cytometry can determine physiological states of cells, however its application varies between species. This study provides a protocol to accurately determine cell mortality within a cyanobacterium population, without underestimating or recording false positive results.

Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Par cytométrie en flux

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.