אנו רוצים להודות הדמיה Nikon מרכז בבית הספר לרפואה בהרווארד, במיוחד ג&#39;ניפר ווטרס, לארה Petrak וסלמון וונדי, לאימונים השימוש של מיקרוסקופים timelapse שלהם. אנו רוצים גם להודות רוזה נג ו אחים בסר לדיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 5695837 (למ &#39;Iwanicki) ו GM064346 כדי JSB, על ידי מענק מטעם ד&quot;ר מרים ושלדון אדלסון למחקר רפואי קרן (כדי JSB).

1. סרטן השחלות Cell אליפטית גיבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RFP-לבטא בתאי סרטן השחלות הם בתרבית בינוני בסיס 10% (תא מותאם אישית התרבות בינוני המכיל תערובת 50:50 של 199 ו MCDB105, 10% מומת בסרום שור עוברית 1% עט סטרפטוקוקוס). להביע RFP בתאי סרטן השחלות שהוסרו מהן תוויות, transfect תאים עם פלסמיד המכיל RFP ובחר את התאים המבטאים RFP. לחלופין, וקטורים ויראליים ניתן להשתמש כדי להביע את זמני חלבוני ניאון, או התאים יכולים להיות מראש דגירה עם אדום ניאון תא גשש צבע (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני היווצרות spheroids סרטן השחלות, יש צורך להכין הדבקה נמוכה 96 עגולים גם תרבות הכלים התחתון. כדי לייצר את הידבקות נמוך צלחות תרבות, 30μl מרובה המה (6mg polyhydroxyethylmethacrylate ב 1 95% EtOH מ&quot;ל) פתרון נוסף גם כל אחד 96 גם צלחת קורנינג התרבות התא. 96 צלחות גם מודגרת ב 37 ° C ללא humidified חממה להתאדות אתנול, אניeaving הסרט של פולי, המה על כן כל אחד. הסרט מרובה המה מונע תאים מצרף לתחתית הבאר, מה שאילץ את התאים לגדול ההשעיה 18. [לחלופין, נמוך במיוחד תרבות מצורף צלחות (Corning) יכול לשמש במקום מרובה המה הכלים מצופים.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדבקה נמוכה תרבות לוחות מוכנים, trypsinize צלחת של תאים סרטניים בשחלות, גלולה התאים צנטריפוגות השולחן (Heraeus) בשעה RCF 900 במשך 3 דקות, aspirate supernatant מחדש להתלות על בסיס בינוני 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של תאים כאלה שיש 100 תאים לכל 50μl של המדיום בסיס 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl של השעיה על תנאי באופן אחיד את התא מדולל היטב בכל מנה גם poly-96 המה התרבות מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 96 צלחת יפה 37 ° C התרבות התא בחממה במשך 16 שעות (זה משך הזמן יש להגדיל או להקטין בהתאם לכמות הזמן שלוקחקו תא מסוים כדי ליצור spheroids תאיים או תנאי הניסוי הרצוי) כדי לאפשר תאים סרטניים בשחלות להתקבץ יחדיו, ויוצרים אליפטית תאיים אחד טוב כל אחד. כמה תאים סרטניים יכולים לעבור אפופטוזיס במהלך תקופה זו, ולכן חשוב לבחור את הזמן לפני הגיוס של אפופטוזיס. </li></ol> 2. תא mesothelial monolayer גיבוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה תרבית תאים, מעיל מראש את הבארות של מנה 6 גם MatTek זכוכית התחתונה עם fibronectin על ידי הוספת 2ml של fibronectin 5μg / פתרון מ&quot;ל PBS היטב כל מאכל ו דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. איכות אופטית של שנות תחתית זכוכית במנות MatTek לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GFP-לבטא בתאי mesothelial הם בתרבית בינוני בסיס 10%. Trypsinize צלחת של תאים mesothelial, ספין למטה צנטריפוגות השולחן (Heraeus) ב 900RPM במשך 3 דקות, לשאוב supernatant, מחדש להתלות על בסיס בינוני 10%.תאים mesothelial משמש כאן כבר הביע GFP כאשר הם התקבלו, אבל התאים mesothelial שהוסרו מהן תוויות יכול להיות מיוצר על ידי transfecting עם GFP פלסמיד המכיל cDNA, או preincubating התאים ירוק ניאון תא גשש צבע (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 30 דקות fibronectin (בשלב 2.1), לשטוף את הבארות של המנה MatTek עם 2ml PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate PBS ואת צלחת 6 x10 5 תאים לכל mesothelial היטב היטב כל מאכל MatTek 6 היטב. דגירה מנה MatTek ב 37 ° C התרבות התא בחממה במשך הלילה, כדי לאפשר את התאים mesothelial לצרף צלחת ויוצרים monolayer. </li></ol> 3. תא mesothelial עמילות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet לאסוף את סרטן השחלות spheroids מן הצלחת 96 פולי, המה גם מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate בינוני מאחד גם מנה MatTek 6 היטב המכיל monolayer תא mesothelial. לשטוף פעם אחת עם 2ml PBS. להוסיף את כל spheroids את מ 96 גם עמ &#39;מאוחר 1 גם מנה MatTek (~ מספר 3x של spheroids כי הם הולכים להיות צילמו לחשבון לנחיתה spheroids מצד מנה שלא ניתן הדמיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת MatTek על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך widefield מסוגל לבצע זמן לשגות הדמיה למשך לפחות 8 שעות. השתמש הבמה ממונע לעמדות תמונה מרובים מנה, עם מספר רב של אירועים העיבור אליפטית, בניסוי אחד. אנו משתמשים TI-E Nikon היפוך ממונע widefield Fluorescence זמן לשגות מיקרוסקופ עם מערכת משולבת פוקוס מושלם נמוך [20x-0.75 צמצם המספרי (NA)] הגדלה / הפרעה במכורים אנונימיים דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) אופטיקה, transilluminator הלוגן ניקון עם 0.52 NA מרחק עבודה ארוך (LWD) הקבל, ניקון מהירה (&lt;100-אלפית שנייה מיתוג זמן) עירור ופליטה מסננים (GFP אקס 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), סאטר מהר המועברות ואור epifluorescence נתיב חכם עצומותהמאוחדות, שלב ליניארי בקידוד Nikon ממונע, Hamamatsu ORCA-AG מקורר תשלום מצמידים (CCD) למכשיר מצלמה, שהותקן הדגירה מיקרוסקופ חדר עם בקרת טמפרטורה CO 2, ניקון ש&quot;ח אלמנטים AR תוכנה גרסה 3, בידוד TMC רעידות השולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את סרטן השחלות spheroids סלולריים יישב לתחתית צלחת ולצרף monolayer תא mesothelial. איסוף ה-GFP, RFP ותמונות שלב 20 + אליפטית / monolayer אינטראקציות, כל 10 דקות, במשך 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכרז-לבטא סרטן השחלות spheroids סלולריים יפלוש לתוך monolayer GFP-להביע את התא mesothelial יצירת חור monolayer. לאחר 8 שעות, למדוד את הגדלים של החורים על ידי מעקב אחר החורים השחורים בתמונות GFP שימוש באלמנטים תוכנה (או תוכנה מתאימה, כגון J תמונה). לנרמל את גודל החור לגודל אליפטית הראשונית על ידי חלוקת גודל החור של 8 שעות על ידי גודל של אליפטית בתמונה RFP המתאים בזמן אפס. ב לשעבר זהמספיק, גודל החור נמדד פעם אחת בלבד, אבל ניתן למדוד מספר פעמים במהלך הניסוי 8 שעות כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה של העיבור. </li></ol> 4. נציג תוצאות בדוגמה זו, השווינו את היכולת אישור mesothelial OVCA433 של סרטן השחלות spheroids תאים בעלי ביטוי מוחלש של תלין-1 לשלוט OVCA433 spheroids. OVCA433 spheroids של כל קבוצה נוספו צלחת MatTek המכיל זצ&quot;ל monolayers התא mesothelial. שישה spheroids של כל קבוצה היו צילמו כל 10 דקות במשך שמונה שעות (איור 4, 3 סרט, סרט 4). החורים שנוצרו בשכבה ידי spheroids הפצת נמדדו שש עמדות של כל קבוצה היו בממוצע. איור 4 מראה כי השטח הממוצע אישור שנוצר על ידי תלין 1 spheroids מציאה היה קטן יותר באופן משמעותי בשטח ממוצע שנוצר על ידי spheroids שליטה, טוען כי תלין נדרש אישור mesothelial ידי OVCA433 סרטן השחלות spheroids. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> באיור 1. סרטן השחלות גרורה. גידולי השחלות ראשיים לפתח גם מן האפיתל פני השחלות או החצוצרות. תאים סרטניים / אשכולות לנתק מן הגידול הראשוני ולאסוף בחלל הצפק. תאים סרטניים יכולים מצטבר כדי ליצור spheroids תאיים. Spheroids מכן לצרף את monolayers התא mesothelial המצפים את חלל הצפק. התאים mesothelial ייכללו מתחת אליפטית השחלות המצורפת סרטן, המאפשר spheroids כדי לקבל גישה קרום במרתף שמתחת. 1. סרט השחלות סרטן גרורות. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">לחצו כאן לצפייה בסרט</a> . <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> איור 2. </strאונג&gt; mesothelial קו התאים את פני השטח של רקמת הצפק האדם אינם נכללים תחת סרטן השחלות שתלים סלולריים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> איור 3. Assay עמילות mesothelial. סרטן השחלות spheroids נוצרות על ידי דוגרים 100 RFP-לבטא בתאי סרטן השחלות לכל היטב מרובה המה צלחת מצופה 96 עגול גם בתחתית התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. פולי, המה מונע על התאים מפני היצמדות מנה תרבות, ומאפשר לתאים לרחף לדבוק זה בזה כדי ליצור קבוצה אחת בכל טוב. Monolayers התא mesothelial מוכנים ידי ציפוי 6x10 5 תאים לכל mesothelial היטב צלחת fibronectin מצופה 6 MatTek דוגרים היטב את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. Spheroids מועברים לאחר מכן מנה MatTek עם monolayer mesothelial ושתי אוכלוסיות תאים הם צילמו כל 10 דקות במשך 8 שעות באמצעות TI-E ניקון אניnverted ממונע widefield Fluorescence זמן לשגות מיקרוסקופ ותוכנה אלמנטים. סרט 2. Assay עמילות mesothelial. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">לחצו כאן לצפייה בסרט</a> . <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> איור 4. הנחתה של הביטוי 1 תלין על OVCA433 spheroids פוחתת היכולת אישור mesothelial. OVCA433 spheroids (אדום) עם ובלי ביטוי נחלש תלין של 1 הורשו לצרף ולפלוש לתוך monolayer mesothelial ZT (ירוק). שתי אוכלוסיות תאים היו צילמו כל 10 דקות במשך 8 שעות באמצעות TI-E Nikon היפוך ממונע widefield Fluorescence זמן לשגות מיקרוסקופ ותוכנה אלמנטים. הגרף מראה כי תלין 1 הנחתהמקטין באופן משמעותי את אישור התא mesothelial (העלילה Quantile עם הפסים הירוקים בכל האמצעים). סרט 3. בקרה OVCA433 spheroids (אדום) פולשים לתוך monolayer mesothelial (ירוק). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">לחץ כאן לצפייה בסרט</a> . סרט 4. הנחתה של הביטוי 1 תלין על OVCA433 spheroids (אדום) יורד mesothelial (ירוק) היכולת אישור. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">לחץ כאן לצפייה בסרט</a> .

<ol>
	<li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).</li><li>Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).</li><li>Burleson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electron+Microscopic+Study+of+the+Invasion+of+Ascites+Tumor+Cells+into+the+Abdominal+Wall.">An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall.</a> Cancer Res. 25, 490-497 (1965).</li><li>Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+explants+of+peritoneum+and+endometrium:+a+novel+model+of+the+early+endometriosis+lesion.">Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion.</a> Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).</li><li>Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+growth+patterns+of+human+peritoneal+mesothelial+cells:+comparison+between+advanced+epithelial+ovarian+cancer+and+non-ovarian+cancer+sources.">Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources.</a> J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Intra-abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).</li><li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix.+An+in+vitro+model+system+for+studying+tumor+cell+adhesion+and+invasion.">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion.</a> Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).</li><li>Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+3D+culture+model+to+elucidate+the+role+of+mesothelial+cells,+fibroblasts+and+extra-cellular+matrices+on+adhesion+and+invasion+of+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum.">Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum.</a> Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).</li><li>Ksiazek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion:+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin.">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).</li><li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitronectin+and+its+receptors+partly+mediate+adhesion+of+ovarian+cancer+cells+to+peritoneal+mesothelium+in+vitro.">Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro.</a> Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).</li><li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesothelial+vitronectin+stimulates+migration+of+ovarian+cancer+cells.">Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells.</a> Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .</li><li>Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+and+beta1+integrin+mediate+ovarian+carcinoma+cell+adhesion+to+peritoneal+mesothelial+cells.">CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells.</a> Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).</li><li>Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+human+ovarian+adenocarcinoma+IGROV1+cells+to+endothelial+cells+is+partly+mediated+by+the+alphav+integrins-vitronectin+adhesive+system+and+induces+an+alteration+of+endothelial+integrity.">Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity.</a> Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).</li><li>Leroy-Dudal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmigration+of+human+ovarian+adenocarcinoma+cells+through+endothelial+extracellular+matrix+involves+alphav+integrins+and+the+participation+of+MMP2.">Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2.</a> Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).</li><li>Iwanicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells:+a+potential+model+for+ovarian+carcinogenesis.">Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).</li><li>Roberts, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+molecular+and+cellular+events+during+neoplastic+progression:+a+mouse+syngeneic+ovarian+cancer+model.">Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model.</a> Neoplasia. 7, 944-956 (2005).</li><li>Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+assay+system+for+transendothelial+tumor+cell+invasion:+significance+of+E-selectin+and+alpha+3+integrin+in+the+transendothelial+invasion+by+HT1080+fibrosarcoma+cells.">A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).</li><li>Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+studying+heterotypic+cell-cell+interactions+and+tissue+specimen+cultures+under+controlled+microenvironments.">Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments.</a> Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).</li><li>Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-extravasation+model+--+selection+of+highly+motile+and+metastatic+cancer+cells.">3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).</li><li>Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+I+contributes+to+the+generation+of+resting+cortical+tension.">Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension.</a> Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).</li><li>Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+colon+carcinoma+cells+requires+expression+of+E-selectin+by+endothelial+cells+and+activation+of+stress-activated+protein+kinase-2+(SAPK2/p38)+in+the+tumor+cells.">Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).</li><li>Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+and+micromechanics+of+tumor+cell+chemotactic+protrusion,+locomotion,+and+extravasation.">In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation.</a> Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

&quot;Assay עמילות mesothelial&quot; המובא כאן עושה שימוש זמן לשגות מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר אינטראקציות של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial, בפירוט במרחב ובזמן רב. בעבר, מספר קבוצות 8-14 השתמשו מבחני נקודות קצה להראות כי תאים סרטניים בשחלות לצרף ולפלוש אל monolayers התא meso...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> OVCA433 סרטן השחלות תאים </td><td></td><td></td><td> מתנת ד&quot;ר דניס שלאמון </td></tr><tr><td> ZT תאים mesothelial </td><td></td><td></td><td> מתנת ד&quot;ר טאן אינס </td></tr><tr><td> בינוני 199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> יישומים תא בע&quot;מ </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS חום מומת </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> עט סטרפטוקוקוס </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> 96 צלחות גם </td><td> קורנינג שחקן המשנה </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tR&gt; <td> Polyhydroxyethylmethacrylate (פולי המה) </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 192066-25 גרם </td><td> פתרון מרובה המה לפזר אבקת 6mg מרובה המה ב 1ml של EtOH 95% </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> לדלל עד 95% ב DH 2 0 </td></tr><tr><td> תרבית תאים מכסה המנוע </td><td> Nuaire </td><td> נו-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> רקמת התרבות חממה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> חממה מרובה המה צלחות </td><td> Labline מכשירים </td><td> אימפריאל III 305 </td><td></td></tr><tr><td> השולחן צנטריפוגות </td><td> Heraeus </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 מנה גם הזכוכית התחתונה </td><td> MatTek קורפ. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> סיגמא </td><td> F1141-במינון של 1 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Timelapse מיקרוסקופ: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td></td><td> TI-E הפוכה ממונע מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות עם מערכת משולבת פוקוס מושלם </td></tr><tr><td> עדשה </td><td> ניקון </td><td></td><td> 20X-0.75 המספרי apeture </td></tr><tr><td> הלוגן transilluminator </td><td> ניקון </td><td></td><td> 0.52 NA עבודה ארוך מרחק הקבל </td></tr><tr><td> עירור ופליטה מסננים </td><td> Chroma עוברים מסננים בודדים Nikon הדיור </td><td></td><td> GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 </td></tr><tr><td> מועבר Epifluoresce נתיב האור </td><td> סאטר </tד&gt; <td></td><td> חכמים תריסים </td></tr><tr><td> יישור קווי בקידוד ממונע הבמה </td><td> ניקון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מקורר טעונה מצמידים מכשיר המצלמה </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> הדגירה מיקרוסקופ חדר עם בקרת טמפרטורה CO 2 </td><td> שהותקן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> בידוד רעידות השולחן </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ש&quot;ח אלמנטים תוכנה </td><td> ניקון </td><td></td><td> גרסה 3 </td></tr></tbody></table>

in vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis

סרטן השחלות הוא הגורם המוביל של 5 מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית 1. למרות התגובה הראשונית חיובית לטיפולים, 70 עד 90 אחוז של נשים עם סרטן השחלות מפתחים גרורות חדשות, הישנות הוא לעיתים קרובות קטלני 2. זהו, אם כן, יש צורך להבין כיצד גרורות משניים להתעורר על מנת לפתח טיפולים טובים יותר עבור סרטן השחלות ביניים ומאוחר הבמה. גרורות סרטן השחלות מתרחש כאשר תאים ממאירים להתנתק מאתר הגידול הראשוני ולהפיץ ברחבי חלל הצפק. התאים המופץ יכול ליצור אשכולות תאיים, או spheroids, כי יהיה גם להישאר פנויות, או שתל על איברים בתוך חלל הצפק 3 (איור 1, סרט 1). כל האיברים בתוך חלל הצפק מכוסים שכבה אחת, רציפה של תאים mesothelial 4-6 (איור 2). עם זאת, תאים mesothelial נעדרים מתחתגידול המוני הצפק, כפי שעולה מחקרים מיקרוסקופ אלקטרונים של האדם חלקים הכרותות רקמת הגידול 3,5-7 (איור 2). הדבר מצביע על כך התאים mesothelial אינם נכללים תחת מסת הגידול על ידי תהליך לא ידוע. קודם ניסויים במבחנה הראו כי תאים ראשוניים סרטן השחלות לצרף ביעילות רבה יותר את תאי מטריקס מאשר תאים mesothelial 8, ומחקרים מאוחרים יותר הראו כי תאים ראשוניים mesothelial הצפק למעשה לספק מחסום הידבקות בסרטן השחלות תאים ופלישה (לעומת הידבקות ופלישה על מצעים שלא כוסו עם תאים mesothelial) 9,10. זה מראה כי תאים mesothelial לפעול כמחסום נגד גרורות סרטן השחלות. המנגנונים תאית ומולקולרית שבו תאים סרטניים בשחלות לפרוץ את המחסום הזה, לא לכלול mesothelium יש, עד לאחרונה, נותר לא ידוע. כאן אנו מתארים את ההמתודולוגיה של ה ב assay חוץ גופית, כי מודלים של אינטראקציה בין סרטן השחלות spheroids תאים תאים mesothelial in vivo (איור 3, סרט 2). פרוטוקול שלנו מותאמת השיטות שתוארו קודם לכן לניתוח סרטן השחלות תאים אינטראקציות עם monolayers mesothelial 8-16, ו תוארה לראשונה בשנת הדוח מראה כי תאים סרטניים בשחלות לנצל ההפעלה integrin תלוי של שרירן וכוח המתיחה על מנת לקדם את הוצאת תאים mesothelial מתחת 17 אליפטית הגידול. מודל זה מנצל את זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לעקוב אחר שתי אוכלוסיות תאים בזמן אמת, מתן מידע במרחב ובזמן על אינטראקציה. על תאים סרטניים בשחלות לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), בעוד התאים mesothelial לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). RFP-להביע את סרטן השחלות spheroids סלולריים לצרף monolayer GFP-להביע mesothelial. התפשטות spheroids, לפלוש, ולהכריח את התאים mesothelial בצד יצירת חור monolayer. חור זה דמיינו כחלל שלילי (שחור) בתמונה GFP. האזור של החור לאחר מכן ניתן למדוד כמותית כדי לנתח את ההבדלים בין פעילות אישור שליטה אוכלוסיות הניסוי של סרטן השחלות ו / או תאים mesothelial. Assay זה דורש רק מספר קטן של תאים סרטן השחלות (100 תאים לכל אליפטית צילומי 20-30 spheroids בכל מצב), אז זה אפשרי לבצע את assay באמצעות יקרות דגימות תאים סרטניים ראשוניים. יתר על כן, assay זה ניתן להתאים בקלות לסינון תפוקה גבוהה.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Assay אישור mesothelial המתוארת כאן מנצלת את התאים שכותרתו fluorescently ואת זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו להמחיש כמותית למדוד את יחסי הגומלין של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial. Assay מתווך זה מדגים את השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

in-vitro-mesothelial-clearance-assay-that-models-early-steps-ovarian

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

14.4K Views.  Harvard Medical School. Assay אישור mesothelial המתוארת כאן מנצלת את התאים שכותרתו fluorescently ואת זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו להמחיש כמותית למדוד את יחסי הגומלין של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial. Assay מתווך זה מדגים את השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות.

Video: In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

גרורה ניסויית Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

רב מודלי הדמיה של אנגיוגנזה מודל עכברים עירום של גרורות סרטן השד עצם באמצעות דימות תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת נפחית ו אולטראסאונד

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

מודלים של גרורות עצם

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...