אנו מודים בראד Lackford לקריאה ועריכה של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, המכונים הלאומיים לבריאות תוכנית המחקר המיפוי Z01ES102745 (ל GH).

1. Oct4GiP עכבר ES Cell תחזוקה תאים Oct4GiP נמסרו באדיבות ד&quot;ר אוסטין סמית. הם הופקו מתוך עכברים שנשאו 129/Ola Oct4-GFPiresPac transgene 4,5. הם שמרו על ג&#39;לטין מצופים צלחות תרבית רקמה במדיום ESGRO מלאה בתוספת משובט ציון (Millipore), או בינוני M15: DMEM (Invitrogen) השלימו עם 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x ללא חומצות אמינו חיוניות (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), ו -10 מיקרומטר β-mercaptoethanol. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל צלחות עם 0.1% ג&#39;לטין (Sigma) בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות (0.1 מ&quot;ל ג&#39;לטין פתרון / cm 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oct4GiP צלחת התאים ג&#39;לטין מצופים צלחות ב ~ 2 x 10 4/2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול התאים כל יומיים עם טריפסין 0.05%. </li></ol> 2. siRNA transfection בתאים Oct4GiP Assay כתב Oct4GiP היא convenien ביותרנשאו את tly בתחתית ג&#39;לטין מצופה שטוח 96 - או 384 צלחות היטב (Corning או BD) במדיום M15. הליך הכולל מתואר באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> siRNA-השומנים מתחמי הרכבה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 96-גם צלחות, להרכיב-siRNA השומנים מתחמי ב U-96-התחתונה גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל אחד טוב, לערבב 10 OptiMEM μl (Invitrogen) ו 0.3 Lipofectamine μl 2000 (Invitrogen) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 siRNA pmol לתערובת שומנים בדם OptiMEM ו דגירה למשך 15 דקות. SiRNA: יחס שומנים בדם הוא 100 pmol: 6ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את siRNA-השומנים מתחמי ב OptiMEM של צלחת U-התחתונה לצלחת שטוחה ג&#39;לטין התחתון מצופה עם פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 384 גם הצלחות, להכין את siRNA-השומנים באמצעות מתחמי 0.1 Lipofectamine μl 2000 ו 2 siRNA pmol ב OptiMEM 10 μl. </li></ol></li></ol> הערה: ריכוז siRNA האחרוןtransfections הוא 50 ננומטר. ביצוע הביולוגי 3-4 משכפל את כל transfection siRNA. הגדרת תערובות אמן של siRNA-השומנים מתחמי בצלחת U-התחתונה ו aliquot לתוך צלחת ג&#39;לטין מצופה שטוח התחתונה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oct4GiP ציפוי התא transfection: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 96-גם צלחות, לאסוף את התאים Oct4GiP ו resuspend אותם במדיום M15 טרי 9 x 10 4 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של השעיה תא זה גם באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה התא עם מראש aliquoted-siRNA שומנים מתחמי ב גם על ידי pipeting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. שינוי עצות transfections siRNA שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection ב 384 צלחות היטב, תאים resuspend Oct4GiP עד 6 x 10 4 תאים / מ&quot;ל ו - 30 aliquot תא μl ההשעיה זה היטב. </li></ol></li></ol> הערה: צפיפות אופטימלית ציפוי התא הוא בדרך כלל 3 x 10 ס&quot;מ / 5 תאים 2, אבל מ &#39;איי דורש אופטימיזציה נוספת siRNAs כי להשפיע באופן דרמטי צמיחת תאים או יכולת הקיום. צפיפות נמוכה ציפוי תוביל הישרדות התא העניים במהלך transfection. צפיפות גבוהה ציפוי תוביל רקע גבוהה בשל בידול מפגש גבוהה הנגרמת התא. אם ציפוי הצורך, בדיקת צפיפות בין 2-4 x 10 ס&quot;מ / 5 תאים 2. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני השינוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן באמצעות הרב ערוצית aspirator (Corning) או ואקום שרביט (VP-Scientific). יש להיזהר שלא לשרוט את התאים בחלק התחתון של הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את התאים עם המדיום הסלולרי טרי ES (100 μl לצלחת 96-30 μl היטב על צלחת 384 היטב), תוך שימוש רב ערוצי פיפטה כל יום. </li></ol></li></ol> 3. FACS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא דיסוציאציה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה ימים לאחר transfection, הסר בינוני באמצעות הרב ערוצית aspirator (Corning) או ואקום שרביט (VP-Scientific). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 96-גם צלחות, שטפו תאים פעם אחת עם 100μאני PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl טריפסין 0.25% זה גם באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5minutes בהתרגשות מדי פעם, וגם מבחינה ויזואלית לבדוק על מנת להבטיח ניתוק מוחלט של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 90 μl של PBS עם FBS 10% להשבית טריפסין ו לנתק את התאים לתוך ההשעיה תא בודד על ידי pipetting חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 384 גם הצלחות, לנתק את התאים עם טריפסין 10 להרוות μl עם 30 PBS μl עם FBS 10%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS ניתוח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הקרינה GFP על נתח LSRII FACS BD מצויד ביחידת HTS או מנתח אחר מצויד באופן דומה FACS (כגון Accuri או Intellicyt). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במצב תפוקה גבוהה על HTS ולנתח 10 μl ההשעיה התא. הגדרת הסף הספירה 1.0 x 10 4 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח הסף PMT כדי ללכוד תאים של העלילה קדימה מול תופעות פיזור. שער לאוכלוסייה תא חי ב forwארד נגד תופעת פיזור העלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת העלילה היסטוגרמה עבור ערוץ ה-GFP. הגדר את השער בערוץ ה-GFP, כך ~ 10% של התאים נראה GFP שלילית בתאים transfected מדומים או שליטה siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע ה-GFP שלילית% תאים כל טיפול: תאים% הבדיל =% תאים GFP-שלילי. השווה את התאים% הבדיל בין הניסוי-and-siRNA השליטה transfections באמצעות 2 זנב מבחן t, וציון הלהיטים חיובית עם ערכי P-&lt;0.01. </li></ol></li></ol> 4. נציג תוצאות Oct4, Nanog, ו Sox2 שלושה גנים ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על התא ES עצמית חידוש 6,7,9-11. איור 2 מראה כי assay כתב Oct4GiP יכול בקלות לזהות את הבידול הנגרמת על ידי להשתיק את הגורמים הללו ב Oct4GiP גזע עובריים לתאים. איור 2 א מראה לתאי גזע עובריים הם Oct4GiP GFP חיובי כאשר שמרו כמו ES<html> תאים. איור -2 מציגה את העלילה קדימה לעומת פיזור לצד ההיסטוגרמה של ערוץ ה-GFP של תאים Oct4GiP transfected עם שליטה או Oct4 למוצרי siRNAs. יש לשער על תאים חיים בעלילה פיזור קדימה לעומת הצד, כמו תאים מתים ופסולת הם GFP-שלילי יגדיל את הרקע. מצד שני, כפיל אפליה להוציא גושי תאים אפשריים אין צורך תמיד. בפקד-siRNA תאים transfected, הרוב המכריע של התאים צריך להיות ה-GFP חיובי. אם ברור GFP שלילי אוכלוסיות קיימות בפקד-siRNA בארות transfected, התאים Oct4GiP החל או הליך transfection אולי נפרץ והתוצאה לא תהיה לפירוש. איור 2 ג מראה גרף עמודות של תאים% הבדיל (תאים% הבדיל = GFP שלילי תאים%) של שליטה, Oct4-, Nanog למוצרי ו Sox2-siRNA תאים transfected. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. תמציתי של assay כתב Oct4GiP. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> איור 2. Assay Oct4GiP הכתב יכול לזהות תאים ES בידול הנגרמת על ידי Nanog, Oct4 או Sox2 ההשתקה. א) E14Tg2a (wild-type, קו שחור) ו Oct4GiP (קו ירוק) תאים נותחו על ידי FACS. היסטוגרמה של הערוץ-GFP מראה כי תאים Oct4GiP הם GFP חיובי. ב &#39;) היו תאים Oct4GiP transfected ב 96-גם צלחות עם שליטה או Oct4-siRNA ו FACS ניתח 4 ימים לאחר transfection. קדימה לעומת פיזור מגרשים לוואי היסטוגרמות של ערוץ ה-GFP של תאים transfected מוצגים. C) תאים Oct4GiP היו transfected עם Control-, Nanog-, Oct4, או Sox2-siRNA. התאים% הבדיל נקבע מ% GFP שלילי תאים 4 ימים לאחר transfection, והיה זממו כמו ממוצע + / - טעות התקן של הממוצע (n = 4).f = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

<ol>
	<li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+differentiation:+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine.">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations:+lessons+from+embryonic+development.">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li><li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal.">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li><li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+potency+by+spontaneous+fusion.">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4.">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li><li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+of+Oct-3/4+defines+differentiation,+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells.">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li><li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+cloning+of+Nanog,+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells.">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li><li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3/4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+embryonic+stem+(ES)+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor.">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li><li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+embryonic+stem+cell+state.">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li><li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2.">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li><li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells.">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li><li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture.">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Assay כתב Oct4GiP אנו מתארים לעיל ניתן למדוד כמותית את מידת ההתחדשות העצמית לעומת בידול. לעומת משיטות אחרות, כגון 12 מורפולוגיה מבוסס ושגשוגם / מבחני כדאיות מבוסס, הוא מציע רגישות גבוהה ותפוקה, כמו גם מדידה ישירה יותר של המדינה תא ES. לכן זה גם מתאים בקנה מידה גדול מסכי וניתוח epistasis גנטית. אכן, ואחרים השתמשו בהצלחה assay כתב Oct4GiP של הגנום כולו מסכי RNAi 3,8. כמו מבחני בכל זאת, יש לה גם מגבלות. זה רק יכול לשמש כדי לחקור את הגנים המווסתים במישרין או בעקיפין Oct4 פעילות היזם, והוא עשוי לזהות שקר גנים המשפיעים על ביטוי ה-GFP, יציבות, או פונקציה שלאחר תעתיק. לכן, מבחני נוספות או מסכים משניים, כגון צביעה phosphatase אלקליין 13 (Millipore, SCR004) ו מכתים immunofluorescence או כמותי RT-PCR של סמנים pluripotency 3,8,12,14 נדרשים לאשר את התוצאות שהתקבלו בשיטה זו. Assay כתב Oct4GiP מסתמך על השתקת הגן יעיל. SiRNAs יעילים transfections siRNA יעילים הם המפתח להצלחה של assay. למרות שאנו רק תיאר השימוש assay כתב עם transfections siRNA, assay יכולה גם להתבצע עם transfections דנ&quot;א לשתיקה או גנים overexpress של עניין. Transfection יעילות ה-DNA הוא בדרך כלל נמוך מזה של siRNAs ולקצר את כוחו של פנוטיפ. חוץ מזה מה שתואר בפרוטוקול זה, assay כתב Oct4GiP ניתן לשנות לזיהוי ואפיון גנים המווסתים שלילית עצמית והתחדשות גם כן. במקרה זה, התאים ניתן transfected עם siRNAs ותרבותיים בתנאים בידול. השתקת של הרגולטורים השליליות של התחדשות עצמית תגביר את עצמי חידוש ולקיים ביטוי ה-GFP, אשר יכול להיות דetected ידי FACS דומה כמתואר בפרוטוקול הנוכחי. מלבד תאים הכתב Oct4GiP, אחרים תא הכתבים קווי באמצעות תא גזע עובריים יזמים ספציפיים, כגון Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) ו-GFP Rex1 19 תאים, יש גם שנוצר. הם יכולים גם לשמש כדי לחקור תא ES עצמית חידוש ותחזוקה באמצעות אותה אסטרטגיה. עם זאת, כי יש הבדל בולט בפעילות וספציפיות של תא גזע עובריים אלו מקדמי סמן גנטי, אלה שורות תאים הכתב מתנהגים באופן שונה מבחינת רמת רקע רגישות ויהיה ובכך משלימים זה את זה. לבסוף, באמצעות אחרים שושלת ספציפיים גזע עובריים הכתב שורות תאים, האסטרטגיה שלנו ניתן לשנות ללמוד הגורל, המפרט של תאים ES ו להקל על השימוש בתא ES כמו במודל חוץ גופית לפיתוח מוקדם היונקים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> ESGRO בינוני כיתה מלאה בתוספת משובט </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (גלוקוז גבוהה 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (להפחית בינוני סרום) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 units/1ml 7) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (לא חיוניות חומצות אמינו) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> נוקלאוזידים 100x לתא ES </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> M7522-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ES-מוסמך בסרום שור עוברית </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> SiRNA הבקרה: דופלקס siRNA מיקוד גחלילית בלוציפראז (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) מסונתז על ידי Dharamcon.

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

Pluripotency עצמית חידוש שני המאפיינים המגדירים של תאים עובריים (תאים ES). הבנת המנגנון המולקולרי שבבסיס יהיה מאוד להקל על השימוש בתאי גזע עובריים לחקר הביולוגיה ההתפתחותית, מודלים המחלה, גילוי תרופות, ו רפואה רגנרטיבית (בדיקה ב 1,2). כדי לזרז את זיהוי ואפיון של הרגולטורים הרומן של תחזוקה ES תא עצמית והתחדשות, פיתחנו assay הקרינה הכתב מבוסס למדוד כמותית את מצב עצמי התחדשות התאים עכבר גזע עובריים תוך שימוש בתאי Oct4GiP 3. התאים Oct4GiP לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של האזור המקדם Oct4 גן 4,5. Oct4 נדרש תא ES עצמית והתחדשות, והוא הביע מאוד בתאי גזע עובריים ובמהירות למטה מוסדר במהלך התמיינות 6,7. כתוצאה מכך, ביטוי של GFP ו הקרינה בתאי הכתב וקושרת בנאמנותעם זהות ES Cell 5, הקרינה המופעל מיון תאים (FACS) ניתוח יכול לשמש כדי לעקוב מקרוב אחר מצב עצמית חידוש התאים ברמת תא בודד 3,8. יחד עם RNAi, assay כתב Oct4GiP ניתן להשתמש כדי לזהות במהירות וללמוד הרגולטורים של תחזוקה ES תא עצמית חידוש 3,8. בהשוואה לשיטות אחרות עבור assaying עצמית והתחדשות, זה יותר נוח, רגיש, כמותי, של עלות נמוכה יותר. זה יכול להתבצע 96 - או 384 צלחות היטב בקנה מידה גדול מחקרים כגון תפוקה גבוהה מסכי או ניתוח epistasis גנטית. לבסוף, באמצעות אחרים שושלת ספציפיים גזע עובריים הכתב שורות תאים, assay המתואר כאן יכול גם להיות שונה כדי ללמוד מפרט הגורל במהלך התמיינות תאים ES.

Watch this Scientific Journal Video about Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal at JoVE.com

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  National Institute of Environmental Health Sciences. אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.

Video: Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...