ברצוננו להכיר את התמיכה הכספית מתכנית Larkins מונש, כמו גם מCDF NHMRC ומענק פרויקט NHMRC. יתר על כן, ברצוננו להודות לי סו מיי Lim להצעותיה המועילות, אדווינה McGlinn לתמיכתה וצוות מונאש Flowcore (בפרט האדם Dinsdale) על עזרתם בהפקת הווידאו.

<ol>
	<li>Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotential+embryonic+stem+cells+from+murine+primordial+germ+cells+in+culture.">Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture.</a> Cell. 70, 841-847 (1992).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells.">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+iPSC+model+of+Hutchinson+Gilford+Progeria+reveals+vascular+smooth+muscle+and+mesenchymal+stem+cell+defects.">A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects.</a> Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).</li><li>Samavarchi-Tehrani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+reveals+a+BMP-driven+mesenchymal-to-epithelial+transition+in+the+initiation+of+somatic+cell+reprogramming.">Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).</li><li>Celi&#224;-Terrassa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+can+suppress+major+attributes+of+human+epithelial+tumor-initiating+cells.">Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).</li><li>Liao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cluster+302&#8211;367+enhances+somatic+cell+reprogramming+by+accelerating+a+mesenchymal-to-epithelial+transition.">MicroRNA cluster 302&#8211;367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).</li><li>Cie&#347;lik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+coordination+of+signaling+pathways+during+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition.</a> Epigenetic., &amp; Chromatin. 6, 1-22 (2013).</li><li>Golipour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+transition+in+somatic+cell+reprogramming+requires+regulators+distinct+from+the+pluripotency+network.">A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network.</a> Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse.">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li><li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+mouse+somatic+cells.">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+roadmap+of+reprogramming+somatic+cells+into+iPS+cells.">A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells.</a> Cell. 151, 1617-1632 (2012).</li><li>Wright, A. J., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+marker+antigens+in+the+characterization+of+human+embryonic+stem+cells.">Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).</li><li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells.">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+coordinated+proteome+dynamics+during+reprogramming+of+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency.</a> Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+molecular+cornerstones+during+fibroblast+to+iPS+cell+reprogramming+in+mouse.">Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse.</a> Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).</li><li>Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reprogrammable+mouse+strain+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells.">A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 7, 53-55 (2009).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li><li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells.">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, 1145-1148 (2009).</li><li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells.">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).</li><li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

על מנת לתכנת מחדש בהצלחה MEFs לתאי iPS ולטהר ביניים תכנות מחדש בכמות גבוהה זה הכרחי להיות מודע לגורמים שיש להם השפעה על היעילות הכוללת. בפרט אצווה של FBS משמש כדי להשלים את תקשורת iPS יכול להיות השפעה מזיקה. בחוויות חיוביות כלליות נעשו עם הגזע עוברי FBS המוסמך תא (ES), אך בדיקת אצווה של סרה ממגוון רחב של ספקים עלולים לזהות חלופה זולה יותר. גורם נוסף שמשפיע על יעילות תכנות מחדש הוא גנוטיפ של MEFs 15,20. למרות MEFs נגזר מהטרוזיגוטיים עכברים (ח) לשני OKSM ומוקד m2rtTA אל לתכנת מחדש, homozygousity באחת או בשני תוצאות הלוקוסים ביעילות תכנות מחדש גבוהה יותר. ואכן, MEFs נגזר מהצאצאים של צלבי OKSM וm2rtTA להראות עלייה ביעילות תכנות מחדש לפי הסדר הבא (OKSM / m2rtTA): ח / ח &lt;הומו / ח &lt;ח / הומו &lt;הומו /הומו (שים לב שהמספרים הניתנים בטבלה 1 הם לבעלי החיים ח / ח). בהזדמנות נדירה של בעלי חיים הומו / הומו גברי מזוהה, הרמון הזדווגות עם נקבות m2rtTA מרובות ניתן להגדיר. כל הצאצאים מצלבים אלה &quot;מדוכאת&quot; / הומו לOKSM / לוקוסי m2rtTA, בהתאמה. בנוסף, גנוטיפ המהיר של המלטות מומלץ כהמלטות גדולות יותר מתקבלות כאשר משתמשים בעכברים צעירים לרבייה (6-15 שבועות של גיל). יתר על כן, השימוש בMEFs מעבר הנמוך לתכנות מחדש יודגש 23. אם MEFs נגזרו והרחיב בתרבית רקמת חממת normoxic אנו ממליצים בחום להשתמש רק תאים אלה עד למעבר .2 עם זאת, אם יש לו את הניסוי גישה לחממת חמצן נמוך (חמצן 5%) לגזירה והרחבת MEFs, מספרי מעבר גבוהים ככל 3 עדיין להניב תוצאות טובות 23. במקרה הנסיין נתקל בבעיות הקשורות לתכנות מחדש,<html> כפי שתואר, סביר להניח שההסברים הם מספרי מעבר גבוהים בזמן בנוסף DOX, גנוטיפ לא נכון של העכברים או השימוש בFBS שהוא לא תורם ליצירת תאי iPS. עם זאת, במקרים נדירים אנחנו ציינו כי MEFs לא הצליחו לתכנת מחדש גם בתנאים אידיאליים. במקרים אלה מחיקה ספונטנית דה נובו בתוך מסגרת הקריאה הפתוחה של m2rtTA זוהתה כסיבה הבסיסית. מתודולוגיה זו הותאמה בהצלחה לחלץ SSEA-1 + ביניים באמצעות בידוד מגנטי תא (MACS). יש יתרון ברור בזמן באמצעות MACS, לעומת זאת, טוהר SSEA-1 + &quot;אוכלוסיות תאים מצטמצם 80-90%, ולא יותר מ 95%, אשר תלוי בסוג של ניסוי בתאים מיועדים לעלולים להוות בעיה. לפיכך, אפשרות היא להשתמש MACS להעשיר לSSEA-1 + תאים ואחריו FACS להגדיל טוהר ו / או החלק ל+ / תאי Epcam- SSEA-1 + / EpCAM + וSSEA-1. &quot;&gt; בעוד תאי iPS המיוצרים על ידי הפרוטוקול שתואר ומודל עכבר הוכחו להיות pluripotent וביעילות לתרום לכל הרקמות של בעלי החיים chimeric 15,20, קיבולת מופחתת כדי לייצר עוברים לחלוטין מורכבים מתאי iPS אלה באמצעות שלמת tetraploid כבר הפגין 24. דפוסי מתילציה Aberrant באשכול גני DLK-Dio3 זוהו כגורם הבסיסי 24. עם זאת, תוספת של חומצה אסקורבית בריכוז של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל לתקשורת במהלך תכנות מחדש תהיה לייצר תאי iPS המוסמך שלמת tetraploid 24. לידיעתך מודל עכבר אפשר לתכנת חלופי שהונדס גורמי תכנות מחדש בstoichiometry שונה יכול לייצר תאי iPS המוסמך tetraploid גם בהעדרו של טיפול בחומצה אסקורבית 25. עם זאת, בתאים את ידינו מלתכנת מחדש את המתח הזה באופן משמעותי תדירות נמוכה יותר בהשוואה למצב עכבר במסמך זה משמשl. המתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה מאפשרת הפרדת ביניים תכנות מחדש מהכמויות הגדולות עקשן של האוכלוסייה ויש לראותו ככלי רב ערך כדי לנתח ולהבין את תהליך תכנות מחדש, הסרת המגבלות הקודמות של צורך להשתמש באוכלוסיית unfractioned לפרופיל (לדוגמא, רעש גבוה אות מהתאים עקשן). שילוב הנוגדן המתואר כאן מאפשר בידוד של חומרי ביניים מתאי עכבר בטוהר גבוה, אולם יתכן כי סמנים פני תא נוספים להיחשף בעתיד שיאפשר להשיג ביניים בטוהר גבוה אף יותר. שים לב שהביטוי SSEA-1 הוא לא סימן היכר של תאי גזע pluripotent האנושיים מושרה וכפרוטוקול כזה זה לא יכול להיות בשימוש על תכנות מחדש של תאים ממקור אנושי. לסיכום, ביניים תכנות מחדש מבודדים פעם אחת עם השיטה המתוארת יכולים לשמש לניתוחים מולקולריים כוללים profilin ביטויg, immunoprecipitation הכרומטין, methylome ניתוח, וחלבון מבחני.

תאי גזע עוברי (ES) נגזרים ממסת התאים הפנימית של עובר ב1 שלב הבלסטוציסט. בתנאים מתאימים תרבות הם עצמי לחדש ולהישאר pluripotent. בשנת 2006 יאמאנאקה ועמיתים הראו שתאים בוגרים ניתן לתכנות מחדש לתאים שנקרא גזע pluripotent המושרה (iPS) על ידי ביטוי בכפייה של שעתוק גורמי אוקטובר -4, KLF-4, סוקס-2, c-Myc (OKSM) 2. תאי iPS, כמו תאי גזע עובריים, יכולים להצמיח את כל סוגי התאים בגוף, לעומת זאת, הם חופשיים מהמגבלות האתיות המקיפות את הדור של תאי גזע עובריים 3. יתר על כן, תאי iPS לשאת את ההבטחה של רפואת רגנרטיבית אישית ולהחזיק פוטנציאל עצום עבור יישומים כמו דוגמנות מחלה ובתרופת מבחנה הקרנת 4,5. על מנת שתכנות מחדש בטכנולוגיה כדי לממש את הפוטנציאל הזה, המנגנון הבסיסי של תכנות מחדש גרעיני צריך להיות מובן במלואו. עם זאת, מאמצים לנתח את טפיחת תכנות מחדשhway כבר הקשתה על ידי העובדה שרק מספר קטן מאוד של תאים לתכנת מחדש (0.1-1%). פיברובלסטים בהצלחה תכנות מחדש כבר דיווחו לעבור סדרה שונה של אירועים כולל mesenchymal למעבר אפיתל 6-10 ו, בשלבים הסופיים של תכנות מחדש, פעילות ברשת pluripotency ליבת אנדוגני 11-14. אנו ואחרים 12,13,15-17 לאחרונה זיהינו קבוצה של סמנים על פני התא ומאפשרת להפרדת ביניים נדירים מהאוכלוסייה בתפזורת עקשן. fibroblasts עכבר תכנות מחדש העוברי (MEFs) עובר שינויים בביטוי של Thy-1.2, Ssea1 וEpCAM (בין יתר) בתהליך תכנות מחדש 2 שבועות הארוך 15. מוקדם במהלך תכנות מחדש משנה של MEFs להסדיר את הביטוי של סמן זהות פיברובלסטים (Thy-1.2) ולאחר מכן להתחיל להביע את הסמן הקשורים pluripotency SSEA-1 12. בשלבים הסופיים של תאי Ssea1 החיוביים תכנות מחדש reactivאכלתי גני pluripotency אנדוגני כגון אוקטובר -4 10-13,15. המעבר אחרון זה מסומן על פני התא על ידי ביטוי לגילוי של EpCAM (ראה איור 1) או בשלב מאוחר יותר 15 PECAM. לאחרונה, אומאלי et al. דיווח על השימוש בCD44 וiCAM1 כחלופות או משלים לThy-1.2 וSSEA-1 לזיהוי ביניים תכנות מחדש. יש לנו בעבר FACS חילוץ ביניים תכנות מחדש מיום 0, יום 3, יום 6, תרבויות יום 9 ויום 12 תכנות מחדש, כמו גם משורות תאי iPS הוקמו על בסיס סמנים פני תא אלה 15,18. למערכת תכנות מחדש מתואר להלן ותנאים שהראינו ברמת התא הבודד, שלמרות שהאוכלוסיות שקטות הומוגנית, יש מידה מסוימת של הטרוגניות באוכלוסיות ביניים זוהו. יש לציין כי רק קבוצת משנה של תאים בתוך אוכלוסיות אלה יוכלו להתקדם לsta הבא המתאיםGE של תהליך תכנות מחדש ולהצמיח מושבות תאי iPS ביעילות שונה, שאופיין בהרחבה בעבר 15,19. יתר על כן, יעילות תכנות מחדש של אוכלוסיות אלה תהיה תלוי, כמו גם על התנאים מחדש ציפוי והתרבות. כדי להגדיל את שחזור ניסוי אנו משתמשים זן עכבר אפשר לתכנתו שתוכנן כדי להביע transactivator תעתיק (m2rtTA) תחת שליטה של מוקד Rosa26 וקלטת OKSM polycistronic תחת שליטה של אמרגן תגובה דוקסיציקלין 20,21. שימוש במודל עכבר זה עוקף את תופעות לוואי בלתי רצויה של שיטות נגיפיות מסורתיות של דור iPS תא, כלומר, אוכלוסייה הטרוגנית התחלה עם תא לשונות תא במספר והמיקום של אתרי אינטגרציה של מוסיף ויראלי. שני זני עכבר מהונדסים (OKSM, m2rtTA), זמין כחיות מייסד הומוזיגוטים במעבדה ג&#39;קסון, יש לי להיות חצו כדי להקים reprograמודל עכבר mmable (ראה איור 2). בכתב יד זה אנו מתארים בפירוט כיצד להפיק MEFs, ליצור תאי iPS, ולבודד את תשומות תכנות מחדש בשלבים שונים של תהליך הגיור על ידי FACS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-0902-82&#160;</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">13-8813&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Streptavidin PE-Cy 7&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25-4317-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti- Mouse CD326(Epcam) Fitc&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-5791-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11360-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11140-050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td dir="LTR" height="25" style="height:25px;width:212px;">Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25200-056&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">GlutaMAX</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">35050-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">21985-023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMSO (Dimethyl Sulfoxide)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">D8418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Propidium Iodide solution (PI)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">P4864-10ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Gelatine from porcine skin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">G1890&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Doxycyclin hyclate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">33429-100MG-R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Leukemia Inhibitory Factor (LIF)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Millipore&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">ESG1107&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11960-044&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DPBS (Dulbecco s phosphate buffer saline)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10829-018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Irradiated MEFs&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">S1520-100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">75-cm2 Tissue culture flasks&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">15-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">50-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic vials&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">70 &#181;m Cell strainer&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10342-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell surface marker mediated purification of ips cell intermediates from a reprogrammable mouse model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

לאחר הנתיחה, disaggregation והציפוי של עובר עכבר E13.5, צלחת 10 סנטימטר צפוי להגיע confluency בכ 1 עד 2 ימים. בשלב זה, זה נורמלי לתרבות להכיל כמה חתיכות חסיד של רקמה שלא היה cellularized כראוי. אלה ייעלמו לאחר passaging. על האינדוקציה דוקסיציקלין, MEFs תכנות מחדש עובר שינויים מורפולוגיים ברורים. סביב יום 6, טלאים כמו מושבה מוקדם צריכים להתחיל לצאת (איור 4C). אלה ימשיכו לגדול בגודל על תרבות נוספת (ראה איור 4D, E). ניסוי תכנות מחדש טוב צריך לגרום ל&gt; 500 מושבות בכל T75 שבתחילה היה זרע עם 5 x 10 5 תאים (איור 4E). תרבויות iPS הוקמו ברשות מושבות כיפה אופיינית בצורה וצריכה בעיקר להיות נטול תאים מובחנים (איור 4F). מדי פעם, passaging נוסף של cultu iPSמיל ייתכן שיידרש כדי להסיר את תאים שלא עברו התמיינות / תכנות מחדש באופן חלקי; בקבוק ומחוברות של תאים ניתן לפצל ביחס של 1:10 על שכבת מזין של MEFs המוקרן. כפי שצוין לעיל, שינויים מורפולוגיים ומולקולריים במהלך תכנות מחדש באים לידי ביטוי בשינויים בפרופילי FACS לThy-1.2, SSEA-1 וסופו של הדבר EpCAM (ראה איור 7 א-F). כפי שדווח בעבר 12,15, בעוד MEFs הם בעיקר חיובי לThy-1.2 ושלילי לסמנים האחרים, 3 תרבויות היום כבר נראו שונות במידה ניכרת. חלק גדול מתאים החלו למטה להסדיר את הביטוי של Thy-1.2 וקבוצה קטנה מאוד של Thy-1.2 תאים השליליים אלה הפכו חיוביים לSSEA-1, תכנות מחדש בפועל ביניים לנקודה זו בזמן. מספר ביניים תכנות מחדש שניתן לחלץ מיום 3 תרבויות הוא מאוד בלתי צפוי כמו אחוז SSEA-1 + / Thy-1.2- בדרך כלל נמצא בטווח שבין 1-10% מviablתאי דואר. בימים 6 ו -9 אחוז מוגבר של תאי SSEA-1 +, בדרך כלל הרבה מעל 10%, ניתן לאתר. סביב יום 12 משנה של SSEA-1 תאים חיוביים ניתן לאתרם שגם תווית חיובית לEpCAM. תרבויות יום 12, כמו 3 תרבויות היום, מייצגת צוואר בקבוק בתהליך של טיהור ביניים, כאחוז מSSEA-1.2 + / EpCAM + התאים משתנה ובדרך כלל נופל בטווח של רק 2-4% מכל תאי החיים. המספר הצפוי של תשומות תכנות מחדש מוצגות בלוח 1 משמש רק כהערכה גסה. תרבויות שהוקמו בתום לב iPS תא תהיה חיוביות מאוד לSSEA-1 וEpCAM. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 משטח סמן שינויים במהלך מסלול תכנות מחדש: Down-תקנה של סמן זהות פיברובלסטים Thy-1.2 אחריו תקנה עד שלSSEA-1. המעבר של קבוצת משנה של SSEA-1 תאים חיוביים כלפי מדינת pluripotent מצויינים על ידי רכישה של EpCAM סביב יום 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 ייצוג סכמטי של מודל העכבר אפשר לתכנתו:. ביטוי m2rtTA נמצא תחת שליטה של מוקד Rosa26 כל מקום בגוף הפעיל בנוכחות של דוקסיציקלין (DOX) חלבון m2rtTA נקשר לאמרגן תלוי טטרציקלין (tetOP) בשעה קולגן 1A1 (Col1a1) מוקד וכתוצאה מכך הביטוי של קלטת ארבעת גורם. שתי קלטות bicistronic מקושרות על ידי אתר הריבוזום פנימי כניסה (IRES). מסגרות קריאה פתוחות לאוקטובר -4 / KLF-4 וסוקסו-2 / c-Myc הן פו<html> sed על ידי רצפי F2A וE2A ביקוע עצמיים, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig3highres.jpg" width="500" /> נתיחת .3 העובר איור: קרן רחם העברה () לתוך צלחת 10 סנטימטר מלא ב10 מ&quot;ל PBS ו (ב) לחתוך לחתיכות המכילות עובר אחד. (C) בעזרת מלקחיים לשחרר את העוברים מהרקמה עוברית נוספת ולהסיר את הראש, גפיים, זנב ואיברים פנימיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> les / ftp_upload / 51728 / &quot;width =&quot; 51728fig4highres.jpg 500 &quot;/&gt; התיקונים כמו מושבה איור 4 שינויים מורפולוגיים במהלך תכנות מחדש. יתבררו בתרבויות מיום 6 ואילך. iPSCs תום הלב מתאפיין במורפולוגיה בצורה כיפה. יום 0 / MEFs, יום (ב &#39;) 3, יום 6 (ג), יום 9 (ד&#39;), יום (E) 12, (F) () iPS תרבית תאים. סרגל קנה מידה:. 200 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5 התקנה בסיסית FACS. () תכלול פסולת עם צד פיזור לעומת שטח פיזור קדימה כתם. (ב)תכלול אגרגטים מהלא פסולת על ידי gating על אוכלוסיית תא בודדת עם פינת פיזור קדימה לעומת כתם גבוה קדימה פיזור. (ג) תכלול תאים מתים מאוכלוסיית תא בודדת על ידי gating על אירועים נמוכים PI עם ערוץ PI לעומת שטח פיזור קדימה כתם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6 gating. (A, B) שימוש בתאי השליטה ללא התווית להגדיר שערים לThy-1.2 + / SSEA-1 תאים, Thy-1.2- / SSEA-1 תאים וThy-1.2- / SSEA-1 + תאים. (ג) השתמש בתאי השליטה ללא התווית להגדיר שערים לתאים שליליים חיוביים וEpCAM EpCAM. (ד) ניתן להפריד + / Thy-1.2- תאים SSEA-1לEpCAM חיובי ולאוכלוסייה שלילית EpCAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7 Thy-1.2 לעומת SSEA-1 כתמי FACS בשלבים שונים של תהליך תכנות מחדש. יום (א &#39;) 0 / MEFs, יום 3, יום 6, יום 9, (E) יום (ב) (ג) (ד) 12, תרבית תאים (F) iPS. טבלה 1 מוצע צפיפות זריעה, מספר בקבוק ותוצאה הצפויה לP1 MEFs של הטרוזיגוטיים עובר לOKSM וm2rtTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ על h</a>ere כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יום </td><td> מספר צלוחיות T75 זורעים על יום 0 </td><td> מספר כולל של תאי Ssea1 + לאחר FACS </td><td> מספר כולל של Ssea1 + / EpCAM + תאים לאחר FACS </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 8 </td><td> 2 מ&#39; </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 2 מ&#39; </td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 2 מ&#39; </td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 10 </td><td> 10 מ&#39; </td><td> 2 מ&#39; </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model at JoVE.com

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

cell-surface-marker-mediated-purification-ips-cell-intermediates-from

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  Monash University. Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam. 

Video: Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

ויזואליזציה, כימות פוטנציאל בידול Adipogenic תא Mesenchymal עם סמן ספציפי שושלת היוחסין

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

דגם העכבר של חסימת מעיים חלקית

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...