עבודה זו ממומנת על פרס חוקר ERC מתקדם לAMA (DAT, שחפת) על ידי עם תרומה של גרנט פרויקט של קרן Wellcome לAMA, מלגת לימודי EPSRC לPB-J וארסמוס, ד&quot;ר Stichting. Vaderlandsch חטיבות של הנדריק מולר וFundatie ואן דה ואן Vrijvrouwe Renswoude &#39;te S-Gravenhage לSCvdB. אנחנו רוצים להודות לג &#39;בריסקו, ס מוניוז-Descalzo, ג Schroeter, וט רודריגז, לדיונים וביקורת בונה, חואקין דה Navascués לפרוטוקול ההרכבה הבינוני ושני AK Hadjantonakis וג Budjan לשיתוף הפרוטוקולים של המעבדה שלהם הנוגע להכתמה של עוברים כל הר. גרסה קודמת של מאמר זה היה זמינה בעבר על שרת bioRxiv טרום 29.

1. תנאי תרבות לפני הצבירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור mESCs במדיום ESLIF (ראה טבלה של חומרים וציוד ספציפיים לניסוח) על צלוחיות 2 רקמות שטופלו תרבות ג&#39;לטין המצופה 25 סנטימטר בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 21-25 פבואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים לפחות שני קטעים לפרסם הפשרה לפני השימוש בפרוטוקול זה; תאים במעברים נמוכים הם בדרך כלל מוצלחים יותר ביצירת מאפיינים לשחזור בכל משכפל ניסוי (כלומר., לא יותר מ 15 קטעים בתרבות), וריאציה קלה אך בין תא-קווי ES השונים היא צפויה (ראה טבלה 2 לשורות התאים שנבדקו ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים לconfluency 40-60%. אל תשתמשו בתאים על-מחוברות לצבירה. </li></ol> 2. דור של אגרגטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS טרום חם (+ 2 + Ca, Mg + 2 +), ESLIF, N2B27 26,27 </sup&gt; וטריפסין- EDTA באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב תרבות מהבקבוק בתרבית הרקמה (שלב 1.3). יש לשטוף את הבקבוק בעדינות עם 5 מיליליטר PBS, פעמיים. לשאוב PBS ולהוסיף 1 עד 2 מיליליטר של מחומם מראש טריפסין EDTA (0.25%) לנתק את התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוק בחממה ל&lt; 5 דקות או עד שתאים יש מנותקים לחלוטין מהמשטח של הבקבוק. פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת מיליליטר 1 כדי ליצור תא בודד השעיה לספירה מדויקת והיווצרות גודל כוללת אחידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל טריפסין עם 5-10 מיליליטר ESLIF; לשטוף את משטח הצמיחה למקסם את התאוששות תא ולהעביר לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. להסיר aliquot 1 מיליליטר מצינור צנטריפוגות ולספור את התאים עם haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את עוצמת הקול של ההשעיה נדרשה לתת 10 תאים / μl (צלחת 96-היטב כל דורשת 5x10 4 תאים ב5 מיליליטר השעיה). ספירת תאים במדויק, כdeviat גדוליונים ממספר התא האמור יכולים להשפיע לרעה על התגובה של אגרגטים לגירויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5x10 4 תאים 5 מיליליטר PBS המחומם מראש בצינור טרי 50 מיליליטר צנטריפוגות וספין ב ~ 170 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב PBS ולהוסיף 5 מיליליטר מראש חימם PBS בעדינות; לא להפריע גלולה בחלק התחתון של הצינור. צנטריפוגות ב ~ 170 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS בזהירות בפעם שנייה. להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מבלי להפריע גלולה כשריד PBS יכול להשפיע לרעה על צבירה. Resuspend גלולה ראשית בN2B27 החם 1 מיליליטר עם טפטפת P1000 ליצור השעיה תא הומוגנית, ואחריו תוספת נוספת של N2B27 להיקף הנדרש (לדוגמא, להוסיף 4 מיליליטר ל5x10 4 תאים / 5 מיליליטר השעיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא למאגר סטרילי ופיפטה אגל 40 μl לתחתית היטב בכל שאינן רקמות תרבות טופלה, &#39;U&#39;תחתית-96-Wצלחת ell בעזרת פיפטה רבה. מכסה את הצלחת 96-היטב עם המכסה המתאים לו ולאשר את קיומם של תאים עם מיקרוסקופ ספסל העליון הפוך (איור 1). הערה: זה חיוני כי צלחות אלה משמשות כדי להגביל את האפשרות של תאי שמירה. האם לא מעיל התחתון של הצלחת 96-היטב עם ג&#39;לטין, פיברונקטין או כל ציפוי אחר שמקדם את הידבקות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 48 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לצבירה. </li></ol> 3. החלת גירויים ושינוי בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, להתבונן במראה של mESCs בתוך היטב בכל הצלחת 96-היטב כדי לאשר צבירה מוצלחת (איור 1E). הערה: מצרפים יופיעו כדוריים בטבע וכ 150-200 מיקרומטר בקוטר. עיין בסעיף פתרון הבעיות אם תתעוררנה בעיות (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">0; להוסיף 150 בינוניות משניים μl טרי (3 מיקרומטר Chi99021 (צ&#39;י) בN2B27 19; המניה מוכנה ב 10 מ&quot;מ בDMSO) לכל אחד גם בעזרת פיפטה רבה. פיפטה עם מספיק כוח כדי לסלק כל אגרגטים שאולי התחילו לדבוק בתחתית הבארות. דגירה אגרגטים במדיום המשני למשך 24 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (איור 1 א). הערה: אגרגטים מוארכים ומקוטבים לשחזור נוצרים באמצעות מדיום המשני זו. גם יצירות בינוניות משניים אחרות, ניתן להשתמש בהתאם לתנאי הניסוי הנדרשים ודוגמאות שמוצגים באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשינויים בינוניים שלאחר מכן, להשתמש פיפטה רבה שנערכה בזווית (כ -30 מעלות) כדי להסיר בעדינות 150 μl של המדיום המשני מהצד של כל טוב. לאחר מכן, פיפטה μl 150 טרי N2B27 לתוך זה גם עם מספיק כוח כדי לסלק כל אגרגטים שייתכן שיש לי התחלהאד לדבוק בתחתית הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה חזור 3. 3 כל שעה 24 עד זמן הקורס היא מלאה (האורך הטיפוסי של ניסוי תרבות כולל הוא 120 שעות). הערה: ודא אגרגטים בחופשיות נעים בעקבות שינויים בינוניים כדי להבטיח שחזור ועקביות בתוך ובין כל צלחת 96-היטב. בינוני יש לשנות יומי לאחר תקופת הצבירה. </li></ol> 4. הכנת אגרגטים לImmunostaining וניתוח על ידי מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבעון ויסודי נוגדן דגירה הערה: הפרוטוקול שתואר על ידי AK Hadjantonakis 28 שונתה כדי להתאים immunostaining של המסקלין צובר. לנוגדנים האופייניים בשימוש במחקרים שלנו ודילוליהם, מתייחס לפרסמנו את עבודת 19,21,24,25,29 וטבלה 3 בעבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיפטה רבה שנערכה בזווית (כ -30 מעלות) כדי להסיר בעדינות 150 בינוני μl מo הצדF היטב בכל צלחת 96-היטב. לשטוף פעמיים על ידי pipetting 150 μl PBS לכל אחד. השאר כמה דקות בין כל שטיפה כדי לאפשר אגרגטים להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר פיפטה P1000 לוותר 200 μl, לצרף את קצה פיפטה המקבילה ומנותק כ 3 מ&quot;מ מהקצה של הקצה עם זוג המספריים סטרילי. לצייר חלק של PBS בתוך היטב בכל הצלחת 96-היטב דרך קצרה לקצה ולגרש אותו כדי להתסיס את כוללת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו הקצה לצייר את כל הנפח בבאר כולל המצטבר ופיפטה לנתיחת תסיסנית זכוכית קטן (30 מ&quot;מ קוטר) כן. העבר את כל אגרגטים מ96-גם הצלחת שתעבור משטרי immunostaining זהים לאותו נתיחת הזכוכית היטב. הערה: השתמש בקצה פיפטה לחתוך חדש בעת העברת אגרגטים מתנאי ניסוי שונים כדי למנוע שריד של אגרגטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכוס המכילה גם aggregates על מיקרוסקופ לנתיחה. מערבולת הזכוכית גם לכפות המצרפים למרכז ולשאוב PBS מצד אחד של היטב עם פיפטה פסטר זכוכית. השתמש במיקרוסקופ כדי להבטיח המצרפים אינם להישאף. השאר נפח קטן של PBS בתוך באר הזכוכית לכסות המצרפים כדי למנוע מהם מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר פורמלדהיד מוכן טרי (4%) מומס בPBS ו דגירה של השעה 2 ב 4 ° C על שייקר מסלולית מוגדרת מהירות נמוכה. זהירות: Paraformaldehyde ידוע להיות אלרגני, מסרטנים ורעיל. ללבוש הגנה ראויה תוך טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קיבעון, לשאוב את פתרון פורמלדהיד באותו אופן כפי שתואר בסעיף 4. 1. 4 ולשטוף אגרגטים עם 1 מיליליטר PBS שלוש פעמים, 10 דקות לעם כל שטיפה, על שייקר מסלולית מוגדר מהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS כמתואר בסעיף 4. 1. 4 ולבצע שלוש, 10 שטיפות דקות נוספות עם PBS המכיל 10% עובריים בסרום שור ושל 0.2% TriX-100 טון (PBSFT). לבצע שטיפות 10 דקות על שייקר מסלולית מוגדר מהירות נמוכה. הערה: שימוש בסרום שור עוברי תוצאות (FBS) בחיץ לשטוף ברור, צמצום מספר אגרגטים שאחרת היה אבודים בפרוטוקול אם חלב היה בשימוש. חשוב לציין כי בעקבות קיבעון, ניתן לבצע הליכי immunohistochemical בדרכים שונות אחרות מאלה המפורטים להלן וצריכים להיקבע ומותאמים על ידי החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום המצרפים עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס בPBSFT על נדנדה מסלול מוגדרת במהירות נמוכה. הפרוטוקול יכול להיות מושהה בשלב זה, ומצרפים חסומים O / N, עם תסיסה מתמדת על כיסא נדנדה gyratory אופקי ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBSFT כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 4. 1. 4) ודגירת המצרפים עם 500 μl של הנוגדן הראשוני הנדרש בדילול המלא PBSFT O / N ב 4 ° C על שייקר מסלולית מוגדר מהירות נמוכה. מכסים בסרט פרפין למניעת אידוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הנוגדן הראשוני ולשטוף עם 1 מיליליטר PBSFT (4 ° C) באופן הבא: פעמיים במשך 5 דקות; שלוש פעמים במשך 15 דקות; וארבעה עד שבע פעמים במשך שעה 1. לבצע כל שלב לשטוף ב 4 ° C ועל נדנדה מסלול מוגדרת במהירות נמוכה. הערה: צ&#39;יל לשטוף בינוני לפני השימוש. אל תבצע את שוטף על קרח כמו זה יכול לגרום המצרפים לבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום לשטוף הסופי ודגירת המצרפים עם הנוגדנים משני הנדרשים ב500 O PBSFT μl / N ב 4 ° C בחושך על כיסא נדנדה gyratory אופקי. להוסיף כתם גרעיני כגון Hoechst אם נדרש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה והדמיה על ידי Confocal microcopy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את אגרגטים כמתואר בסעיף 4. 1. 4 עם 4 מעלות צלזיוס PBSFT. לאחר לשטוף הסופי, לשטוף אגרגטים עם 1 מיליליטר PBS המכיל FBS 0.2% וTriton X-100 (PBT) באופן הבא: פעמיים במשך 5 דקות; שלוש פעמים במשך 15 דקות. לבצע שטיפותב RT על נדנדה מסלול מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום כפי שתואר לעיל (סעיף 4. 1. 4) דגירה במשך 30 דקות בחושך עם 1: 1 פתרון של גליצרול: PBT (1 מיליליטר) ואחרי דגירה 30 דקות שנייה עם 7: 3 פתרון של גליצרול: PBT (1 מיליליטר). הערה: מערבבים את גליצרול ופתרונות PBT ב 4 ° C באמצעות הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב גליצרול הסופי: פתרון PBT ולהחליף עם 1 מיליליטר הרכבה בינוני 24. הפרוטוקול ניתן עצר בנקודה זו לפני ההרכבה (אם עצר, לאטום את הבארות עם סרט פרפין ולאחסן את בארות צביעה על 4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המצרפים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי pipetting אותם ב -17 טיפות μl עם קצה P20 חתך (איור 2). מקפלים קלטת דו צדדית חזרה על עצמה ארבע פעמים כדי ליצור מפרידי ולצרף לכל קצה של השקופית. מניחים את coverslip העליון (22 מ&quot;מ x 60 מ&quot;מ) על מפרידי אלה (איור 2). הערה: זה חיוני כי קצה חתך הואמשמש בשלב זה כדי לא לפגוע בדגימות. מפרידי למנוע coverslip ריסוק המצרפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמצרפים הם רכובים, תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה confocal באמצעות פרוטוקולים שתוארו קודם לכן 19,21,24,25. הניח פעם במיקרוסקופ, לעזוב את השקופיות ללא הפרעה על הבמה לכמה דקות כדי לאפשר אגרגטים להתיישב בתוך ההרכבה בינונית. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SnapShot:+mouse+primitive+streak.">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).</li><li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation:+making+and+shaping+germ+layers.">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).</li><li>Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16:+Gastrulation+in+the+Mouse+Embryo.">Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo.</a> Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).</li><li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies.">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).</li><li>ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies.">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li><li>Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt,+Activin,+and+BMP+Signaling+Regulate+Distinct+Stages+in+the+Developmental+Pathway+from+Embryonic+Stem+Cells+to+Blood.">Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).</li><li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX17+Is+a+Critical+Specifier+of+Human+Primordial+Germ+Cell+Fate.">SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate.</a> Cell. 160, 1-16 (2015).</li><li>Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+developmental+marker+genes+to+define+temporal+and+spatial+patterns+of+differentiation+during+embryoid+body+formation.">Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation.</a> J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Koehler, K. R., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generating+inner+ear+organoids.">3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids.</a> Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+P19+mouse+embryonal+carcinoma+cells+as+a+simple+in+vitro+model+to+study+the+molecular+regulations+of+mesoderm+formation+and+axial+elongation+morphogenesis.">Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis.</a> Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).</li><li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+expression,+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis.">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li><li>Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastocoelic+fluid+of+sea+urchin+embryo+induces+exogastrulation.">The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation.</a> J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).</li><li>Horstadius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+Sea+Urchin+Development,+Studied+by+Operative+Methods.">The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods.</a> Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).</li><li>Holtfreter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+totale+Exogastrulation,+eine+Selbstabl&#246;sung+des+Ektoderms+vom+Entomesoderm.">Die totale Exogastrulation, eine Selbstabl&#246;sung des Ektoderms vom Entomesoderm.</a> Wilhelm Roux'Archiv f&#252;r Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).</li><li>van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+breaking,+germ+layer+specification+and+axial+organization+in+aggregates+of+mouse+ES+cells.">Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Eiraku, M., Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Turner, D. A., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/&#946;-catenin+and+FGF+signaling+direct+the+specification+and+elongation+of+a+neural+axial+progenitor+in+ensembles+of+mouse+ES+cells.">Wnt/&#946;-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li><li>Faunes, F., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated+&#946;-catenin/Oct4+complex+correlates+with+ground-state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">A membrane-associated &#946;-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).</li><li>Kalmar, T., Lim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+Fluctuations+in+Nanog+Expression+Mediate+Cell+Fate+Decisions+in+Embryonic+Stem+Cells.">Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells.</a> PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).</li><li>Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Ru&#233;, P., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interplay+between+extracellular+signalling+and+the+dynamics+of+the+exit+from+pluripotency+drives+cell+fate+decisions+in+mouse+ES+cells.">An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells.</a> Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).</li><li>Turner, D. A., Ru&#233;, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brachyury+cooperates+with+Wnt/&#946;-Catenin+signalling+to+elicit+Primitive+Streak+like+behaviour+in+differentiating+mouse+ES+cells.">Brachyury cooperates with Wnt/&#946;-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells.</a> BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).</li><li>Ying, Q. -. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).</li><li>Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).</li><li>Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Aggregates+of+Mouse+ES+Cells+that+Show+Symmetry+Breaking,+Polarisation+and+Emergent+Collective+Behaviour+in+vitro.">Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mesoderm+induction+and+its+specification+to+the+hemangioblast+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).</li><li>Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Glycogen+Synthase+Kinase+3+Inhibitors+Potentiate+Insulin+Activation+of+Glucose+Transport+and+Utilization+In+Vitro+and+In+Vivo.">Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).</li><li>Inman, G. J., Nicol&#225;s, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-beta+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+(ALK)+receptors+ALK4,+ALK5,+and+ALK7.">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).</li><li>Hao, J., Daleo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling,+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).</li><li>Neely, M. D., Litt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMH1,+a+highly+selective+small+molecule+BMP+inhibitor+promotes+neurogenesis+of+hiPSCs:+comparison+of+PAX6+and+SOX1+expression+during+neural+induction.">DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.</a> ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12+Sox17+promotes+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+by+directly+regulating+extraembryonic+gene+expression+and+indirectly+antagonizing+self-renewal.">12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal.</a> Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).</li><li>Chambers, I., Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+and+differential+localization+of+lipid-modified+GFP-variant+fusions+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice.</a> Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).</li><li>Serup, P., Gustavsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+promoter+substitutions+generating+transcriptional+sentinels+of+diverse+signaling+pathways+in+embryonic+stem+cells+and+mice.">Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice.</a> Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).</li><li>Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPRT-deficient+(Lesch-Nyhan)+mouse+embryos+derived+from+germline+colonization+by+cultured+cells.">HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells.</a> Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).</li><li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells.">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הטכניקה המתוארת בכתב היד הזה ביעילות ובreproducibly יוצרת אגרגטים של תאי גזע העובריים של עכבר (mESCs) שתצוגה מאורגנת סימטריה-שבירה והתארכות 19, שילוב של שניהם תרבות ירידת תלייה שתוארה על ידי Marikawa et al. 14 וEB היווצרות. אגרגטים אלה להמשיך לפתח מוארכים וציריים, משלימים שיטות קיימות לדור של איברים קדמי מתאי גזע עובריים כגון כוסות אופטיות 11 וקליפת המוח 13, ומכילים תאים עם זהותם של שכבות שלוש נבט בי תצוגת תהליכים דומים לאלה בgastrulation כמו 19,21 תנועת תאים מהירות. זה מעניין, להעלות השערות על אופי האירוע שבירת הסימטריה, שכן הוא מתרחש בהעדר רקמות דפוסים חיצוניים וסימטרית zygotic מקלות 19. ההיווצרות הספונטנית של ציר בסיסי יכולה לנבוע מקיימת מראש heterogeneities בתרבות החל מתאים, המהווים את הבסיס לפיתוח של א-סימטריה. ואכן, אוכלוסיות של תאים בתרבית בתנאי ESLIF להציג תערובת של עצמי חידוש והבחנת תאים, הפרופורציות היחסית של אשר עשויות להשתנות מצבירה אחד למשנהו. יתר על כן, עבודה ראשונית במעבדה שלנו מצביעה על כך שאגרגטים מאוכלוסייה מלא pluripotent של תאים להראות התפתחות מאוחרת ופגמים בדפוסים, המצביע על תפקיד להטרוגניות בהיווצרות דפוס מאורגן (DA טרנר וא מרטינז אריאס, בהכנה). כדאי גם בהתחשב בכך שמנגנון תגובה-דיפוזיה עלול ליצור הדפוס, עם דיפוזיה של מעכב מהמשטח של כולל. Warmflash et al. 41 מצביע על כך שמנגנון כזה יכול להיות אחראי על פיתוח סימטריה רדיאלית בתרבות חסיד, מה שהופך אותו למועמד אפשרי לדפוסים בשלושה ממדים. במהלך initiaתקופת צבירת 48 שעות l, תאים להגיע למצב דומה לזה שבתוך epiblast postimplantation, שבו הם המוסמכים להגיב לאותות מהמדיום המשני 19,21,24. בדרך כלל, הפרוטוקול המתואר כאן מספק תאים עם דופק של מדיום המשני המכיל גורמים (כמו אגוניסטים Wnt / β-קטנין) המספקים את האותות מספיק להתארכות. שיטות קודמות תרבות שתוארו על ידי et al לנקסטר. (באמצעות ESCs 13 בני האדם) וEiraku אל. (עם mESCs 11) משמש et תקופה קצרה של צבירה נמוכה בהידבקות 96-גם צלחות לפני תאים מצטברים הועברו לטיפי Matrigel למאזניים הולך תרבות. למרות הזמן בין הצבירה והכנסת Matrigel היה שונה בין המחקרים, בשני המקרים, מספר גדול של תאים ששימשו להיווצרות המצרפי (כ 3,000-4,500 תאים). בניגוד לכך, הפרוטוקול מתואר כאן 19 משתמשים בהרבה פחות תאים (כ 400 תאיםלצבירה) שנקבע להיות חיוני לתהליך של התארכות, סימטריה-שבירה והקיטוב שהוא ציין 19. בנוסף, מבנים מוארכים אלה יכולים להיות שנוצרו בתקופת זמן קצרה הרבה יותר ללא הטבעה במטריצות מלאכותיות: להשוות את הדור של אזורים במוח שהוגדרו על ידי אל נקסטר et (&gt; 20-30 ימים) 13 ואופטי כוסות מEiraku. et al. (~ 11 ימים) 11 עם 5 ימים הנדרשים לייצור מבנים מוארכים מקוטבים. אחת המגבלות בשיטת התרבות המתוארת כאן לעומת זאת, הוא שהם יכולים להיות מתורבת רק כ 5-6 ימים לאחר ציפוי עד הגודל שלהם הופך אותם מוסמך תחת כובד לשקוע לתחתית של הבארות ולאלץ את הידבקות אפילו על אי פלסטיק כלי -coated. ניסויים נוספים באמצעות מטריצות מלאכותיות כגון אלה שהוזכרו קודם לכן, אולי יאפשר לנו להגדיל את התקופה שלתצפית וניסויים, ועבודה הוא לקבוע את ההשפעות של הגבלת המצרפים באופן שוטף. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שכדי לשנות את המדיום מבלי להסיר אגרגטים, נפח קטן של מדיום יש להשאיר בתחתית הבאר. ההשלכות לגנטיקה כימית גישות הצורך לשקול דילול זה וכל השפעה שיורית מתקשורת הקודמת: ביום דופק צ&#39;י 3 מיקרומטר, 2.37 מיקרומטר פתרון הוא למעשה נמסר, ושינויים בינוניים לאחר לגרום לשאת על של .499 מיקרומטר (72-96 שעות) ו0.105 מיקרומטר (96-120 HR) בין נקודות הזמן. העבודה נוכחית לא תיקנה לדילול, ויש להניח כי שינויים בינוניים יומיים יהיו למזער השפעה שיורית. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול כדי להבטיח שחזור שני התוך והבין-ניסיוני. ראשית, תרבות המוצא של mESCs חייבת להיות מטופחת ולא על שיתוףnfluent, ובינוני תמיד צריך להיות כלומר באיכות טובה., (איור 5 א &#39;, ב&#39;) הטרי וגם מעורבים. תנאי תרבות עניים להשפיע לרעה על הצבירה (איור 5Bi). ספירה מדויקת של תאים להשיג השעיה תא ~ 400 תאים / μl 40 היא חיונית, כמו אגרגטים גדולים נכשלים עצמי לארגן ונוטה יותר ליצור אגרגטים כפולים בתוך כל טוב (איור 5Bii) ואילו אגרגטים קטנים יותר אינם יכולים להגיע לנכון צפיפות בו הם יכולים להגיב לגירוי (איור 5Biii). צעד אופטימיזציה מפתח היה הכללת לשטוף PBS שני שמסיר סרום מזהם מהשעית התא (שלב 2.6); זה שיפר את תדירות הצבירה והאיץ את התפתחות המצרפים של כ 24 שעות. בשלב הבא, שינויים בינוניים להבטיח מיושמים בכוח מספיק כדי לסלק כל אגרגטים שיש לו את הפוטנציאל לדבוק פני השטח של הבאר; כישלון לעשות זאת resuLTS ב&#39;מתרסק &#39;המצרפים (איור 5Biv). בנוסף, וכפי שהוזכר קודם לכן (ומטה), זה חיוני כדי להבטיח כי המצרפים נשמרים בתרבות השעיה ומנועים מהקפדה על כל משטח. ברגע שהמצרפים דבקים, הדפוס של ביטוי גנים ופוטנציאל התארכותם הם שיבשו. כטכניקה זו היא פשוטה יחסית, וגם במסגרת גבולות של אנשים עם טכניקות רקמות תרבות טובות, רוב הבעיות הקשורות לצבירה ניתן לפתור במהירות יחסית, אם הם אחרי השלבים הקריטיים אלה; שולחן מלא בעיות ירי נגיש (טבלה 1). ברגע שמשתלט עליו, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור פיתוח צירי, אירועי שבירת סימטריה ותא-החלטה. באופן ספציפי יותר, יש לי אגרגטים אלה הפוטנציאל ליצור בריכות של תאים שהיו זמין עד כה בתרבות, כגון כבל, אופנועים ואופניים השדרהנוירונים r. הערה אתית: יש לציין בזהירות הראויה שהתרגום של פרוטוקול זה לES אדם או תרבית תאי iPS יכול להביא הניסוי קרוב לבסיס המשפטי של מגבלת ארבע עשרה יום על מחקר בעוברים אנושיים, כלומר הדור של פס פרימיטיווי, כמפורט באדם ההפריה ואמבריולוגיה החוק (2008 בריטניה) 42. מאז החוק מכסה את כל עוברי האדם חיים ללא קשר לאופנם של יצירה, התרבות של gastruloids האנושי מעבר לפרימיטיבי-פס כמו שלב תהיה מעבר להיקף של מחקר רישוי.

הלימוד וההבנה של החלטות תא-גורל בפיתוח יונקים המוקדם יכולים לעשות שימוש בתרביות של תאי גזע העובריים (ESCs), אוכלוסיות משובטים נגזרות מblastocysts שיש את היכולת עצמית לחדש ולהתמיין לכל סוגי התאים של אורגניזם כלומר., הם 1,2 pluripotent. בעוד תרבויות אלה היו וממשיכים להיות שימושיים להבנת הבסיס המולקולרי של תא החלטות-גורל, הם אינם מסוגלים להתרבות חלק מההסדרים במרחב ובהתנהגויות הגלובליות שנוצרו בעוברים במהלך gastrulation. בעובר, התהליך של gastrulation הופך שכבת האפיתל אחת לשלוש שכבות נבט שונות ומעניק את העובר עם ארגון anteroposterior גלוי 3-5. ניסיונות לשחזר את האירועים הללו vivo לשעבר היו מבוססים על הדור של אגרגטים תלת ממדיים של ESCs, התייחס לגופי embryoid כ( EBS), ולהעמיד אותם לאo תנאי בידול 6,7. ניתן שידלו אגרגטים אלה להתמיין לסוגים רבים ושונים של תאים, שחלקם גם אינם מסוגלים להשיג או מושרה עם יעילות נמוכה בתרבות חסיד או לא יכול להיות מיוצרים בכל;. לדוגמא, תאי דם 8 ונבט קדמוני 9. הגבלה בשימוש בEBS עם זאת, היא שהם אינם מסוגלים להציג את התנהגות המוךפו&quot;גנטי, הפצת שכבת נבט או ארגון צירי כי הם מאפיינים עיקריים של העובר המתפתח, וכתוצאה מכך חוסר הארגון המרחבי 6,10. בדו&quot;ח אחד, טיפול של EBS עם Wnt מוביל לקיטוב חלש בביטוי גנים בחלק אגרגטים אבל לא המורפוגנזה ברורה הוא ציין 7. בדיווחים האחרונים יותר, EBS שכבר בתרבית לתקופות ממושכות של זמן לפתח מבנים קדמי כגון רשתית, קליפה ותאי חישה באוזן פנימית, המחקים את העמיתים העובריים שלהם, אבל בלי לפתח ההקשר של organizat ציריהיון 11-13. דו&quot;ח של Marikawa et al. 14, תוך עבודה עם אגרגטים של קרצינומה תאים עובריים P19 העכבר (EC) שהוקמו על ידי שיטת תלייה-הטיפה, דיווח את הופעתה של מבנים מוארכים ממוצא mesodermal מזכיר המוארכים שהם נצפו עם exogastrulae בדו-חיים ועוברי קיפודי הים וקלר explants 15-18. כמו זה שלא נצפה עם תאי גזע עוברי של עכבר (mESCs), ניסינו לשחזר את ההתנהגות שנצפתה עם P19 תאי EC באמצעות אגרגטים של mESCs 19 ואנו מדווחים תנאי תרבות שמובילים לסימטריה שלהם לשבור והתארכות צירית. הבדל חשוב מהעבודה עם תאי P19 הוא שפרוטוקול הצבירה המתואר כאן מתבצע בצלחת 96-היטב, דומה לזה שתואר על ידי Eiraku et al. 20, במקום תלוי טיפות. שינוי זה הביא להתייעלות במונחים של התאוששות כוללת והן בשחזור התוך והבין-ניסיוני. חשוב לציין, שמירת אגרגטים בבארות בודדות מבטיחה היתוך שבין אגרגטים (נפוץ כאשר איגום אגרגטים מטיפין תלויות) אינו מתרחש. בנוסף, תכונה מרכזית של הפרוטוקול היא 24 שעות חשיפה לCHI99021 מעכב GSK3 (צ&#39;י), activator חזק של איתות Wnt / β-קטנין, הבאים צבירה. השיטה המתוארת כאן מספקת בסיס להבנת התהליכים של ארגון עצמי, ארגון צירי ומפרט שכבת נבט בתרבות, המאפשרת הסקת מסקנות להתבצע לגבי פיתוח צירי in vivo 19,21. מסיבות אלה השיטה יש הפוטנציאל לאפשר ניתוח מכניסטית מפורט של תהליכים שעלולות להיות קשה ללמוד בעובר. יתר על כן, יישום פוטנציאל הוא בדור של רקמות ואיברים שאינם בר השגה בקלות בתרבות חסיד בשל חוסר נישה סלולרית מובנה כגוןחוט השדרה מבשרי 21 ומנוע תאי עצב. תרבות הכוללת תלת ממדים מציעה מבנה פיזי וסביבה מאותתת כי לא יכול להיות בר השגה באמצעים קונבנציונליים, שהוביל לגישה חדשה לגזירה של שושלות עובריות באופן מאורגן במרחב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">31350-010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">25cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">690 175</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:116px;">MSE</td>
			<td style="width:87px;">MSB020.CX1.5</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:235px;">BES Buffered Saline (BBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">B2891</td>
			<td style="width:188px;">BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Centrifuge tubes (15 or 50ml)</td>
			<td style="width:116px;">Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td style="width:87px;">118271 or 227261</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">CHIR 99021 (Chi)</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Dissection Well (30mm Internal Diameter)</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:87px;">12678586</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:235px;">ESLIF</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:188px;">500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 &#181;L LIF (1000 units).</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:116px;">Biosera</td>
			<td style="width:87px;">FB-1090/500</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Gelatin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Glasgow&#39;s Minimal Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">11710-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">35050-038</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Glycerol</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">G5516</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Improved Neubauer Haemocytometer</td>
			<td style="width:116px;">Hawksley</td>
			<td style="width:87px;">AS1000</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant</td>
			<td style="width:116px;">CSCR</td>
			<td style="width:87px;">n/a</td>
			<td style="width:188px;">Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">n-Propyl-gallate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">02370</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:235px;">N2B27/NDiff 227</td>
			<td style="width:116px;">Stemcells, Inc.</td>
			<td style="width:87px;">SCS-SF-NB-02</td>
			<td style="width:188px;"><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:116px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11140-035</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:235px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">P6148</td>
			<td style="width:188px;">Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">D8662</td>
			<td style="width:188px;">With Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">11360-039</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Sterile Reservoir</td>
			<td style="width:116px;">STARLAB</td>
			<td style="width:87px;">E2310-1010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:235px;">Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate</td>
			<td style="width:116px;">Grenier Bio-one</td>
			<td style="width:87px;">650185</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:87px;">X100</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:235px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:116px;">Gibco</td>
			<td style="width:87px;">25300-054</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro

פיתחנו פרוטוקול שיפור תרבות נוכחית Embryoid הגוף (EB) המאפשרת הלימוד של ארגון-עצמי, שבירת סימטריה, התארכות צירית ומפרט גורל תא באמצעות אגרגטים של תאי גזע העובריים של עכבר (mESCs) בתרבות השעיה. מספר קטן של mESCs יקובצו במדיום בסיסי במשך 48 שעות ב96-גם צלחות שאינן רקמות שטופלו תרבות, תחתית-U, לאחר שהם המוסמכים להגיב לאותות ניסיוניים. בעקבות טיפול, אגרגטים אלה מתחילים להראות סימנים של ביטוי גנים מקוטב ולשנות בהדרגה המורפולוגיה שלהם ממסה כדורית של תאים למבנה מוארך, מאורגן היטב בהיעדר רמזי סימטריה חיצוניים. מבנים אלה הם לא רק מסוגלים להציג סמנים של שלוש השכבות נבט, אך באופן פעיל להציג תנועות כמו gastrulation-, שמעידות ליפה כיוונית של תאים בודדים מהצבירה, אשר מתרחשת באופן מכריע אזור אחד של המבנה המוארך. protoc זהol מספק שיטה מפורטת ליצירה לשחזור של אגרגטים אלה, גירוים עם אותות כגון הפעלת Wnt / β-קטנין ועיכוב BMP וניתוחם על ידי נקודת זמן אחת או מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות. בנוסף, אנו מתארים שינויים נהלים מכתים עובר הנוכחיים כל הר עכבר לניתוח immunocytochemical של סמנים ספציפיים בתוך אגרגטים קבועים. השינויים במורפולוגיה, ביטוי גנים ואורך של אגרגטים ניתן למדוד כמותית, מתן מידע על איך אותות יכולים לשנות גורלות צירי. זה שחזה כי מערכת זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר אירועים התפתחותיים המוקדמים כגון פיתוח צירי וארגון, ואופן רחב יותר, התהליכים של ארגון עצמי וקבלת החלטות סלולרית. היא עשויה גם לספק נישה מתאימה לדור של סוגי תאים קיימים בעובר, כי הם בלתי ניתנים להשגה מהתרבות חסיד קונבנציונלית כגון תאי עצב בחוט השדרה ומוטוריים.

הופעתו של תאים מייד לאחר ציפוי ולאחר צבירה מייד לאחר ציפוי, ניתן לראות את הנוכחות של תאים בודדים בתוך היטב בכל הצלחת 96-היטב עם מיקרוסקופ רקמות תרבות סטנדרטי הפוך (איור 1). בתוך 8 שעות של ציפוי, תאים אלו החלו לרדת לתחתית הבאר בשל כוח הכבידה והחלו להתגבש לאשכולות בדידים (איור 1 ג). לאחר 24 שעות, התאים התגבשו יהיו השלימו צבירה הראשונית, ויהיה נדחסו לתוך מוגדר היטב אגרגטים, עדיין מרופטים שבו תאים בודדים הם לא ברורים מזה (1D איור). בסופו של היום השני (48 שעות), המצרפים צריכים להיראות &quot;נקיים&quot;, שלקח את כל התאים בתוך היטב (איור 1E); תחתית הבאר יכולה להיות כמה תאים שנשפכו מהצבירה בשלב זה. מתןשהמצרפים כבר מצטברים בN2B27, בנקודת זמן זו, הם צריכים להיות כדוריים, כ 150-200 מיקרומטר בקוטר לנוע בחופשיות בתוך היטב (כלומר., לא פעל בהתאם לחלקו התחתון של הבארות). צבירה באמצעי תקשורת אחרת (כלומר., ESLIF או N2B27 עם גורמים ספציפיים) יש את הפוטנציאל לשנות גם את המורפולוגיה כוללת הראשונית והתגובה לגירויים שלאחר מכן (טרנר et al., בהכנה). נציג מורפולוגי שינויים תוספת של דופק 24 שעות של מדיום המשני המכיל צ&#39;י בין 48 ו -72 שעות (איור 1 א, 5 א &#39;) מייצרת מוגדרת היטב אגרגטים מוארכים המציגים ביטוי מקוטב בסמנים ספציפיים של השכבות הנבט 19,21. מייד לאחר דופק צ&#39;י (72 שעות), המצרפים יתחילו לשפוך תאים ולהתחיל להראות את תגובתם לאותות הללו לקראת סוף היום זה (איור 3 א). תגובות אלובאים לידי ביטוי על ידי שינויים בביטוי גנים ומורפולוגיה, שניהם תלויים בטיפול שהמצרפים קיבלו לאחר תקופת צבירת 48 שעות הראשונית בN2B27 (איור 3). אם נדרש רק ניתוח נקודת סיום, הזמן האופטימלי לתמונת המצרפים הוא על כ 96-120 שעות. בשלב זה המצרפים יהיו פיתחו מורפולוגיות ברורות ודפוסי ביטוי גנים (איור 3 א), והגודל והמסה שלהם הם עדיין נמוכים מספיק כך שהפליטה של מדיום מפיפטה P200 היא מספיק כדי לסלק כל שאולי מצורף. אי מניעת התקשרות של המצרפי ולישפיע לרעה על היווצרות המצרפי (איור 5Biv). דפוס מורפולוגיות וגן הביטוי של אגרגטים ניתן לשנות בהתאם לטיפול. תוצאות נציג למשטרים מתמשכים או פעם גם עם טיפול או שילוב של גורמים יחידים מוצגות לBMP4, Dorsomorphin H1 (Bחבר פרלמנט מעכב קולט), ActivinA, SB43 (Activin / מעכב קטרים), bFGF או PD03 (מעכב MEK) (איור 3). הדמיה כוללת וניתוח תמונת כמותית אגרגטים נוחות להדמיה או על ידי מיקרוסקופ widefield (בעיקר להדמיה הזמן לשגות 19), או קבוע immunostained עבור ההדמיה confocal 19,21 (איור 2). תיאור הפרוטוקול וההדמיה הנוכחי לעיל מאפשר מידע כמותי כדי להיות שנרכש מאגרגטים אלה. confocal הבא או לכידת תמונה רחב בתחום, לאורכה והביטוי המקביל הגן לאורך הקוטר או עמוד השדרה של המצרף (כדורי או מוארך בהתאמה; איור 4 א &#39;, ב&#39;) ניתן למדוד. ניתוחים אלה גם ישירות החלים על הזמן לשגות תמונות, שבו אפשר לקבל מידע על קצב צמיחה, גודל והתארכות של אגרגטים בתנאים שונים (איור 4 </strong&gt;). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" /> איור 1. בזמן כמובן אופייני ומורפולוגיות מוקדמות. (א) בזמן כמובן האופייני לניסויי צבירה. תאים מצטברים במשך 48 שעות בN2B27 מכילים השעיה של תאי הגזע העובריים של עכבר (10 תאים / μl) בצלחת 96-היטב (P1, P2). (ב) מייד לאחר ציפוי (t = ~ 5min), תאים בודדים יכולים להיות ראה בהשעיה והחלה ליצור גושים ידי 8h (C). (ד) לאחר 24 שעות התאים יצרו כולל אחת בכל טוב שהוא כ 100 מיקרומטר בקוטר. (E) לאחר צבירת 48 שעות, במצטבר קוטר נע 150-200 מיקרומטר. בשלב זה, את מדיום הצבירה (N2B27) הוא שהוסר ובינוני משני מתווסף גם לשאר הניסוי (P1 בחלק) או למשך 24 שעות לפני שהשתנה ב<html> Ack לN2B27 (P2 בחלק). בר סולם מייצג 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" /> איור 2. מצרפי הרכבה על גבי שקופיות מיקרוסקופ. ברגע שהמצרפים תוקנו, immunostained והניח בהרכבה בינונית, כל כולל הוא pipetted על שקופיות מיקרוסקופ כאגל 17 μl (A, B, B &#39;). מרחב מספיק נותר בין הטיפות מצטברות כדי למנוע המיזוג שלהם. מפרידי הם עשו עם סרט דו צדדי והוצבו בכל פינה של שקופיות מיקרוסקופ (, &#39;, ב&#39;). זה על אלה שcoverslip זכוכית ממוקם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig3.jpg" /> איור 3. ההשפעה של טיפולים שונים על המורפולוגיה של תאי גזע עובריים מצטברים. בעקבות 2 ימים בN2B27, תאי גזע עובריים יצרו אגרגטים. תוספת של גורמים ספציפיים או כדופק יום 1 (א) או ברציפות (ב) יכול לשנות את הפנוטיפ של אגרגטים ביחס לקוטביות של ביטוי גנים, פוטנציאל התארכות, או את צורתם הכללית. דוגמאות בנתון זה הם אגרגטים נוצרו משתי חזייה :: GFP 30 (א) או Sox1 :: תאי הגזע העובריים של עכבר 27 (ב) GFP הדמיה לאחר 120 שעות וטופלו כפי שצוין. צ&#39;י: CHIR 99,021 31; SB43: SB 431,542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ה</a>הוא דמות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח כמותי של אגרגטים. המצרפי טיפוסי נוצרו מהחזייה :: mESCs GFP 25,30 הבאים דופק 24 שעות של צ&#39;י וצלם ב 120 שעות. תמונה ממוזגת של השדה הבהיר וערוץ ה- GFP מוצגת עם קו מפולח לציון &#39;עמוד השדרה&#39; של הצבירה מנקודת A ל- B (), שאורכו הקרינה והאורך הכולל ניתן למדוד (B). האורך (C) ו&#39;העגלגלות &#39;(D) מ -24 אגרגטים באותו הניסוי מוצגים. מתארי צורה כגון עגלגלות (ד &#39;), מעגלי, האזור ההיקפי וניתן למדוד באמצעות תמונת תוסף ניתוח ספר מתכונים מהתוכנה פיג&#39;י ניתוח תמונה 35. אומר שצוין על ידי קו אופקי בכל נקודת זמן;ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן; סרגל קנה מידה ב() מציין 200 מיקרומטר. כמו שיש הבדלים דקים בין שורות תאי כתב, צפוי כי לאחר דופק של צ&#39;י, האורך הממוצע מרבי ועגלגלות מינימום ממוצעת של אגרגטים ישתנו. בין שורות תאים שונות, אנו מוצאים שהאורך המרבי הממוצע יכול להיות בטווח של 400-800 מיקרומטר ~ ועגלגלות המינימום הממוצעת בין 0.4 ו -0.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" /> איור 5. דוגמאות לכשלים במערך כולל. היכולת ליצור אגרגטים לשחזור () תלויה בגורמים קריטיים כגון (BI) בינוני משני טריים וגם מעורב, (Bii, Biii) הדיוק בספירת n הראשוניחום-אדמדם של תאים ו( ביב) להבטיח המצרפים לא יוצר מושבות חסיד כלומר., &quot;התרסקות&quot; לתוך השטח של הבאר. דוגמאות אופייניות לשגיאות במבנה כולל של כל אחד מהתנאים שהוזכרו (B) מוצגות. Scale-בר כפי שצוין; ראה טבלת בעיות ירי לפרטים (טבלת 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" /> שולחן מדריך 1. לפתרון בעיות. שגיאות אופייניות הקשורים לפרוטוקול הצבירה ניתנים עם הצעות לגבי ההחלטה שלהם. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" /> הטבלה 2. טבלה של שורות תאים שנבדקה להיווצרות של AGGregates. מספר שורות תאים 19,22,27,30,36-40 מתאפיינים ליצירת אגרגטים ו, למרות הבדלים דקים בין שורות תאים צפויים ונצפו, כל הקווים מעל להראות דינמיקה דומה במונחים של התארכות ומורפולוגיה. במונחים של ביטוי גנים, דפוס הביטוי הוא ספציפי לגן הביע, אבל בתוך כל שורת תאים, דפוס הביטוי הוא בדרך כלל עקבי לאורך מספר הקטעים. לעקביות, אנו יוצרים אגרגטים מהתאים שלא עלו על 15 קטעים בתרבות. <img alt="טבלה 3" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" /> רשימת טבלה 3. נוגדני נציג משמשים במחקרים אלה. בחירה של הנוגדנים והגורמים המשמשים לדילול immunostaining הכולל.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro at JoVE.com

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה<em&gt; במבחנה</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

generation-aggregates-mouse-embryonic-stem-cells-that-show-symmetry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

17.4K Views.  University of Cambridge. We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Video: Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.