ישנם רב שתרמו לעבודה זו ורובם מן הקרום המבני ופונקציונלית קבוצת ביולוגיה, שניהם חברים בעבר ובהווה. לכולנו להרחיב את התודה וההערכה החמה שלנו. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מקרן מדע אירלנד (07/IN.1/B1836), המכונים הלאומיים לבריאות (GM75915, P50GM073210 וU54GM094599), ועלות הפעולה CM0902 FP7.

<ol>
	<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501 (2011).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallization.">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li><li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II:+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping.">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li><li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution.">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li><li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis.">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography.">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה וידאו שהראינו כיצד להשתמש ברובוט כדי להגדיר באופן אוטומטי בניסויי התגבשות טווה בצלחות זכוכית כריך 96-כן באמצעות mesophase lipidic חלבון עמוס. הרובוטים משמשים בעבודה זו תוכננו במיוחד כדי כוללים מזרק זכוכית תזוזה חיובית למסירה מדויקת ושחזור של כרכי nanoliter של mesophase הצמיג והדביק, כפי שתוארו במקור 7. דיוק ותכונות חשובות של רובוט. עם זאת, מאפיינים אלה הם רק טובים כמו מידה וסדירות שביצועי רובוט מוערכים וכיול מתבצע. למותר לציין כי ביצועים של הרובוט צריכים להיות מוערכים ואילו צלחות בודדות שהקימו. אין זה ראוי להניח שהרובוט יתפקד ללא רבב ולעזוב את הרובוט לפעול ללא התערבות. המפעיל קשובים ומצוות צריך להיות בקופהition לציין על ידי צליל או מראה כשמשהו לא עובד כמו שצריך וכדי לתקן אותו באופן מיידי. בנוסף, כל צלחת יש לבדוק בקפידה על ידי עין אחידות בתכנים גם בהקדם הצלחת היא חתומה ולפני זה הוא לשים בצד לניסויי התגבשות. זה צריך לדרוש רק כמה שניות כדי לבצע וניתן לעשות זאת תוך הצלחת הסמוכה נטענת. שם לב, למשל, שבארות מסוימות לא מלאו כראוי עשוי להדגיש את העובדה שבקצה מחלק מסוים מזרז שאינו מתפקד כהלכה. צריכה מסירה של mesophase לראות כדי להיות לא סדיר, הפריט הפגום הרלוונטי היית צריך להיות מתוקן באופן מיידי. בכך שציין בנושאים אלה וביצוע ההתאמות הרלוונטיות במהלך הגדרה תהיה לחסוך זמן וחומרים, כולל שומנים ובעל ערך חלבון קרום. אם imager משמש למעקב אחר גידול גביש, דיוק ויכולים גם להיות במעקב במהלך הדמיה. לדוגמה, בעיות שיטתיות עם טיפה או בולוסמיקום על ידי imager מצביע על כך שמשהו לא בסדר ושפעולה מתקנת איפשהו במעלה זרם בפרוטוקול היא זקוק. באינטרסים של ביצועים אמינים ולכן הרובוט חייב להיות מכויל על לוח זמנים קבוע ולפי צורך. כיולים צריכים לכלול נפח מזרז וmesophase נמסר כמו גם מיקום בולוס ופזיז בבאר. ברור, בכל המקום האפשרי כיול צריך להיעשות באמצעות כרכים וחומרים דומים לאלה שיהיו בשימוש בניסויים שנערכו בתקופה המכוסית בתרגיל בקרת האיכות. חשוב כמו כיול כך גם הוא שיש במלאי אספקה ​​נאותה של חלקי רובוט ואספקה. כישלונות קטסטרופליים ובלתי צפויים, חסימות וקריסות יכולות לקרות ואכן קורים. במקרה כזה, שזמין טיפ מסירת החלפה מאיצה, למשל, אולי זה אומר שהכנת חלבון קרום יקרה מאוד משמשת כמו שצריך ולא מתבזבז. חלק מהיתרונות של רובוט כולל את העובדה שזה יעבוד למעשה ברציפות וכי היא אינה סובלת מאו &#39;מתלונן על &quot;עייפות. רובוט יכול לשמש גם בתנאים שאינם נחשבים ידידותי לאדם, כמו בחושך, תחת תאורה נשלטת ותנאים סביבתיים, ובקצוות של טמפרטורה. הרובוטים הפגינו במאמר זה היו כל שימוש בתנאי סביבה ב~ 20 ° C. עם זאת, ישנם חלבונים ופרויקטים הדורשים טמפרטורות שאינן סביבה, אור מבוקר 11,12 וחמצון או סביבת הפחתת 13. כל אלה ניתן לדאוג גם ל, בקלות יחסית, כאשר רובוט התגבשות משמש. במאמר וידאו יופיטר מוקדם יותר הפגנו כמה ניסויי התגבשות ידי בשיטה טווה מוגדרים ידני 1. ההיקף המינימאלי של mesophase שניתן לוותר מהימן ביד מוגבל בy handedness חזותי חדות והיציב של האדם שהציב את הניסויים. מניסיוננו, כרכים של mesophase נמוך כמו 100 nl מטופלות בקלות. אנחנו יודעים ממעבדה אחת שבה נפח ברירת המחדל חלק ידני הוא כ 40 nl. עם זאת, כמויות קטנות יותר במידה ניכרת הן אפשריות באמצעות רובוט. בנפרד, יש לנו הראינו כי נפחי mesophase נמוך כמו 550 picoliters ניתן לוותר רובוט 14. שמהעבודה היה ברור שהמזעור נוסף על ידי רובוט הוא אפשרי שאם ייושם, יוביל לירידה גדולה בכמות חלבון קרום יקר הנדרש לביצוע ניסוי התגבשות. במאמר זה וידאו, שלושה רובוטים זמינים מסחרי שמשו להפגין התגבשות חלבון קרום תפוקה גבוהה באמצעות mesophases lipidic. הראשונה שבן פותחה בקבוצת MS &amp; FB מבוסס על ניסיוננו להקים ניסויים באופן ידני, כמתואר ביופיטר 1712 1. זה instrument יש לנו היכרות עם ביותר ואת חלק הארי של המאמר הנוכחי מוקדש לשימוש בו. שני הרובוטים האחרים היו בהפגנה בטרשת הנפוצה וקבוצת FB בזמן כתיבת המאמר והקטעים הרלוונטיים נכלל כאן באינטרסים של שלמות. כל שלושה הרובוטים מאוד להשתמש באותה המערכת mesophase מחלק, תכונה החיונית שבם היא מזרק זכוכית תזוזה חיובית 5,7. הם נבדלים באופן משמעותי ביותר בכל קשורים לאספקה ​​מזרזת. רובוטי 1 ו 2 יכולים לוותר מזרז במקביל ל8 בארות, טור אחד בצלחת התגבשות בכל פעם. בניגוד לכך, 3 רובוט dispenses כל 96 הפתרונים הנחפזים בפעולה אחת. רובוט 2 הוא הכלי היחיד עם טיפים חד פעמים נחפזות ניפוק. יש יתרונות וחסרונות הקשורים למכשירים השונים שתלויים ביישום המסוים, אלה לא הרחיבו על כאן. די לומר שכל השלוש העבודות והפיקו גבישים שליחלבוני mbrane ידי בשיטה טווה. הצעדים הבאים בתהליך הכולל של קביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה macromolecular הם לקציר ולגבישי cryo-מגניבים מצלחות שהוקמו כמתואר במאמר זה וידאו ולהקליט ועקיפים רנטגן תהליך מהם. נושאים אלה מכוסים במאמרי יופיטר נפרדים בסדרה 1,15 זה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> רכיבים </td></tr><tr><td> Brayer (רולר) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 50820937 </td><td> כלי </td></tr><tr><td> מזרקי גז הדוק </td><td> המילטון </td><td> 81030 </td><td> כלי </td></tr><tr><td> coverslips זכוכית </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> לוחות זכוכית </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> Gryphon LCP רובוט </td><td> האמנות רובינס </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> בטווה רובוט </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> מחברת מעבדה </td><td> שונה </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> יתוש LCP רובוט </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> כלי </td></tr><tr><td> קלטת spacer כפול מקל מחורר </td><td> סונדרס התאגיד (חור אגרוף-) </td><td> אישית </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> פתרונות נחפזים </td><td> שונה </td><td> שונה </td><td> מגיב </td></tr><tr><td> מים מטוהרים </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> מגיב </td></tr><tr><td> גשם-X </td><td> טיפול ברכב פגז </td><td> 80199200 </td><td> מגיב </td></tr><tr><td> טיפי מזרק </td><td> המילטון </td><td> 7770-020 (מד 22) </td><td> כלי </td></tr><tr><td> רקמות </td><td> שונה </td><td> שונה </td><td> חד פעמי </td></tr><tr><td> מימייה </td><td> שונה </td><td> NA </td><td> מגיב </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

מחקרי פונקצית מבנה של חלבוני קרום להפיק תועלת רבה מצורך ברזולוציה גבוהה מבני 3-D זמינים מהסוג הניתן באמצעות קריסטלוגרפיה של קרן ה-X macromolecular (MX). מרכיב חיוני של MX הוא אספקה ​​קבועה של אידיאלי גבישים עקיפים באיכות. בטווה או שיטת lipidic מעוקב שלב (LCP) לגיבוש חלבוני קרום הוא אחת מכמה שיטות זמינות לגיבוש חלבונים בממברנה. היא עושה שימוש בmesophase bicontinuous לגדול בה גבישים. כשיטה, יש לו כמה צלחות מרהיבות של מנוח ומשך תשומת לב רבה עם קבוצות מחקר רבות שמתעניייינות כעת בשימוש בו. אחד האתגרים הקשורים בשיטה הוא שmesophase האירוח הוא מאוד צמיג ודביק, מזכיר משחת שיניים עבה. לפיכך, מחלקו באופן ידני באופן לשעתק בנפחים קטנים לתוך בארות התגבשות דורשת מיומנות, סבלנות ויד יציבה. פרוטוקול לעושה juרח שפותח בממברנה הביולוגיה מבנית ותפקודית (MS &amp; FB) הקבוצה 1-3. מאמרי וידאו יופיטר המתארים את השיטה הם 1,4 זמין. הגישה הידנית להגדרה בטווה ניסויים יש יתרונות ברורים עם יישומים מיוחדים, כגון אופטימיזציה של גביש וderivatization. זה אולם סובל מלהיות שיטת תפוקה נמוכה. הנה, אנחנו מדגימים את פרוטוקול לביצוע ניסויים בהתגבשות טווה כמו רובוט. רובוט מציע את היתרונות של מהירות, דיוק, דיוק, מזעור ולהיות מסוגל לעבוד ברציפות במשך תקופות ממושכות תחת מה יכול להיחשב כתנאים עוינים כמו בחושך, באווירת צמצום או בטמפרטורות נמוכות או גבוהות. בטווה רובוט, כאשר משתמשים בו כראוי, יכול לשפר את הפרודוקטיביות של מבנה חלבון קרום ומחקר פונקציה מאוד על ידי קידום גיבוש שהוא אחד מהצעדים האיטיים בצינור קביעת מבנה כללי. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים את השימוש בשלושה רובוטים זמינים מסחרי שיכול לוותר mesophase האינטגרלי לצמיג ודביק בcrystallogenesis טוו. הרובוט הראשון פותח בMS &amp; FB קבוצת 5,6. שני האחרים הפכו לאחרונה זמינים ונכללים כאן לשלמות. סקירה של הפרוטוקול המכוסה במאמר זה מוצגת באיור 1. כל המניפולציות שבוצעו בטמפרטורת חדר (~ 20 מעלות צלזיוס) בתנאי הסביבה.

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases at JoVE.com

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

במסמך מתואר גישה רובוטית להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular ה-X. שלושה רובוטים המסוגל להתמודד mesophase הצמיג ודביק חלבון העמוס האינטגרלי לשיטה הם הציגו.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Google

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K Views.  Trinity College Dublin. במסמך מתואר גישה רובוטית להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular ה-X. שלושה רובוטים המסוגל להתמודד mesophase הצמיג ודביק חלבון העמוס האינטגרלי לשיטה הם הציגו.

Video: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...