המתקן התגבשות MRC-LMB הוא באדיבות נתמך על ידי המועצה למחקר רפואי (בריטניה). אנו מודים חברי LMB על תמיכתם: אולגה Perisic (PNAC), טוני וורן, Fusinita ואן דן Ent ו פט אדוארדס (לימודי המבנית), סטיב Scotcher, שאר חברי הסדנה מכני, ניל גרנט, ג'ו וסטמורלנד (עזרים חזותיים), פול הארט, טום פראט (IT). אנחנו גם רוצה להודות סטיב אליוט (Tecan, בריטניה), סטיוארט מיטשל, הת'ר Ringrose (רובוטיקה המילטון, בריטניה), פול הפשרה, רוברט לואיס של Joby ג'נקינס (טרומבוציטופניה Labtech, בריטניה), פול רירדן (Swissci AG, שוויץ), סטיבנס. ג'ורג ', דונלד Ogg (Alphabiotech, בריטניה), ניל ויליאמס (Markem Imaje, בריטניה) ו גרהם האריס (סוכנות קליבלנד) לקבלת עזרה טכנית.

1. שני אוטומטי לחלוטין מערכות (מיון ראשוני)
<ol><li>
מערכת 1: הכנת לוחות 96-ובכן התגבשות 72 מלא עם הקרנת ערכות (LMB צלחות)
	<ol>
<li>לפני ביצוע ההליך, ודא הרובוטים של המערכת יאותחלו תוכנת השליטה שלהם פתוחה. הפעל את chiller של קירור-צינור המוביל בערך 30 דקות לפני התוכנית הראשית יופעל.</li>
		<li>מניחים צלחת מבחן על המוביל SBS ממונע של חותם צלחת. חותם צלחת ולרוץ לבדוק כי הסרט הוא מיושם כהלכה. לחזור על בדיקה זו עוד פעמיים כדי לוודא חותם צלחת מוכנה.</li>
		<li>לאחר מכן, להוסיף 20 לליטר מים יונים המכל הראשי של המטפל נוזלי. נתק את הכיסויים צימוד של המכולה קטן (20% אתנול שטיפה פתרון) וחבר את המכסים המכל הראשי.</li>
		<li>הזן את שם המסך המתאים (טבלה 1) על המגע מדפסת הזרקת דיו. לאחר מכן, לפתוח ולסגור את הדלת קרוסלה להזניק את הסיבוב בקרוסלה. פתח את הדלת כאשר הערימה הראשון מציג את עצמו.</li>
		<li>מלא לטעון הערימה הראשון עם 22 לוחיות התגבשות, כל אחד עם עמודה 1 מול החוצה. מלא לטעון את הערימות שני הבא באותו אופן.</li>
		<li>לטעון את הצלחות 6 הנותרים בעמדות הגבוהות של הערימה הרביעית. סגרי את הדלת קרוסלה.</li>
		<li>ודא כי התצוגה chiller מציין 14 ° C. בעדינות, שוב ושוב היפוך ערכות ההקרנה שנבחר במשך דקה אחת. לאחר מכן, לפתוח את הפאנל הקדמי של המטפל נוזלי.</li>
		<li>פתח הצינורות ומניחים שבתא הקירור לפי התוכנית 96-ובכן תקן (A1, A2, וכו '.). בעת הצבת כל שפופרת במנשא, במקום המכסה על מגש בפריסה 96-ובכן אותו.</li>
		<li>להצליב הצינור עמדות ולוודא לכל הצינורות ברמה התיישבו במנשא. לאחר מכן, סגור את הפאנל הקדמי.</li>
		<li>בחלון 'אתחול' של התוכנה המפעילה נוזלי, בחר "בניהול אחזקה", פתח את התוכנית שטיפה. הפעל את התוכנית ריקון האתנול 20% מן המערכת, כדי לשטוף את דן טיפים לחילוק נוזלי.</li>
		<li>לאחר שטיפה הושלם, לחץ על 'ביטול' כדי לחזור 'אתחול'. בחר 'הפעל תהליך הקיים' ולחץ על "התחל את הבחירה שלך". פתח את התוכנית 'dispensing ערכת MRC'. מלא "18" עבור "מופעים" בתצורת מסך ולהפעיל את התוכנית.</li>
		<li>צג המערכת כפי קודם ארבעת הלוחות מסומנות, מלא, והוא חתום.</li>
		<li>לאחר כל הצלחות 72 היה מוכן להציב בחזרה הקרוסלה, להחליף את הכיסויים צימוד מהגורם הראשי אל המיכל קטן. הפעל את התוכנית 'הפעלת רצף' (ראה שלב 1.1.10).</li>
		<li>כבה את chiller ולמחוק את רוקן הקרנת ערכת צינורות. הסר בזהירות את הצלחות מוכן 72 מ הקרוסלה. ביטול מלא באופן שגוי או צלחות גרוע אטום. חנות את הלוחיות מוכן לשימוש ב- 10 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מערכת 2: הגדרת טיפות התגבשות (חלבון nL 100 + 100 מצב nL) מתוך מדגם יחיד ב- 20 LMB צלחות
	<ol>
<li>ראשית, ודא הרובוטים של המערכת הם על, מנפק nanoliter מאותחל עם התוכנה שלה פתוח, המנהל בשיטה של המטפל נוזלי פתוח. הפעל המוביל צינון microtube בערך 15 דקות לפני התוכנית הראשית יופעל.</li>
		<li>מניחים צלחת מבחן על המוביל SBS ממונע של חותם צלחת. הפעל חותם צלחת וודא כי הצלחת אטום כראוי. מבחן חותם צלחת שלוש פעמים.</li>
		<li>לאחר מכן, להפעיל מנפק nanoliter להגדיר 100-nL טיפות של פתרון מבחן צלחת הבדיקה. בדוק במיקרוסקופ טיפות מוגדרות בצורה נכונה. לסגור את התוכנה מנפק nanoliter ולהסיר את הבלוק רצועת-מחזיק מן הסיפון.</li>
		<li>הכנס הבא, המחזיק צלחת אישית מעוצבת (לראות תוצאות נציג: התגבשות התקנים שפותחה LMB) לצלחת LMB עם הכמות היחסית הגבוהה של ריאגנטים נדיף בתנאים שלה (טבלה 1). הסר את הסרט דבק הצלחת.</li>
		<li>לפתוח את הפאנל הקדמי של המטפל נוזלי ומניחים את הצלחת יפתחו במרפסת, מאחורי המוביל הראשון הזזה (הזזה נושאות עשוי להיות שלף, כדי להקל על גישה).</li>
		<li>מכסים את הצלחת עם מכסה אלומיניום SBS. ליישב את המכסה לעבר הפינה השמאלית האחורית של המוביל על ידי הפעלת לחץ עדין לכיוון הפינה הנגדית של המכסה.</li>
		<li>. פתחי, לטעון לתוך נושאות הזזה, לכסות את הלוחות 19 הנותרים באותה דרך, עובד ביותר לתנאים לפחות תנודתי. לאחר המוביל קירור-microtube-4 ° C, כמצוין על-ידי אור ירוק, הסר את העטיפה שלו.</li>
		<li>חתוך את המכסה של microtube המכיל µL 440 (לפחות) של חלבון לדוגמה (טבלה 2). לוודא הדגימה יש ללא קצף מעל מניסקוס, כמו זה יפריע מערכת זיהוי נוזלי. מקם את הצינור בעמדה 1 של חברת קירור-microtube.</li>
		<li>מניחים צלחת PCR על סיפון נוזלי המטפל מול המוביל מתאם צלחת-המעבר. לאחר מכן, סגור את הפאנל הקדמי.</li>
		<li>לאחר טעינת הסיפון, ודא סיפון מתקן nanoliter ברור של גוש רצועת-מחזיק נושאות בירכתי המחסן עצה 50-µL ברורות של הכיסוי SBS אלומיניום.</li>
		<li>הממשק 'שיטת ניהול' המטפל נוזלי, בחר 'הגדר לוחות'. לעקוב אחרי האתחול של שתי מערכות ומלא את הפרמטרים לרוץ. בצע את ההנחיות של ממשק ניהול שיטה (ההנחיות, דמויות, מערכת ניהול המידע לעזור עם הכנה).</li>
		<li>בדוק היטב כי כל הנדרש רכיבים מוכנים ולאחר מכן התחל את התהליך.</li>
		<li>צג המערכת מנפק nanoliter שוקעת הטיפות בצלחת הראשונה, חותם צלחת לאחר מכן חותמות את הצלחת.</li>
		<li>לאחר כל 20 לוחות שהוכנו עם התגבשות טיפות, חזר באופן אוטומטי נושאות הזזה, לפתוח את הפאנל הקדמי ולהסיר בעדינות את הצלחות. בדוק כי הלוחות נסגרות כראוי לפני אחסונם על התגבשות.</li>
		<li>לנקות את המכסים SBS עם פתרון 20% אתנול לפני ערימות מהם, בצד שמאל של המטפל נוזלי לאחסון. למחוק את הצלחת ה-PCR ואת microtube.</li>
		<li>כבה המוביל צינון microtube ואת לנגב את הדחיסה. להשאיר מגבת נייר על גבי המשטח קריר יותר לספוג עוד יותר עיבוי. לאחר מכן, התקן מחדש את מכסה המוביל וסגור הפאנל הקדמי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אופטימיזציה של התנאים
<ol><li>
מבוסס על המזרק המטפל נוזלי: מפיק שני מעברי צבע ליניאריים של ריכוזים לתוך המאגרים של צלחת התגבשות (שיטת 4-פינה).
	<ol>
<li>ראשית, ודא המטפל נוזלי על מוטענים עם התוכנה שלה פתוח.</li>
		<li>בכרטיסיה 'מעבר צבע': לפתוח את התוכנית הנדרשת, בחר את סוג הצלחת התגבשות ונפח הסופי המאגרים (טבלה 3). הגדרת מתקדמות עבור 'vol שוט מקס' צריך תפחת מ- 6000 ל-3,000 בעת שימוש בפתרונות המכיל [אלכוהול איזופרופיל] > 10% v/v ו- [MPD] > 20% v / v
</li>
		<li>להכין את? המזרקים. הכנס בוכנה כל מזרק (קצוות מחודדים למטה) ולהוסיפה האחורי של מזרקים החריצים המיועד מתחת לראש רובוט. טוויסט מזרק עם כיוון השעון כדי לנעול אותו בעמדה (התוכנית תתחיל רק עם? כל המזרקים נדרש מחובר כראוי).</li>
		<li>הכינו את שקתות. הסר את מסגרת מפלדת והכנס את שקתות. העמדות 4 משמאל תואמות 4 הפינות A, B, C, מתג ד לכרטיסייה 'הגדר' אשר מציגה את נפחי הפתרונות הנדרשים כל מזרק (על טבלה 3, 0.5 מ"ל נפח מת נוספו אמצעי האחסון מוצג). שופכים את הפתרונות פינה לתוך שקתות בהתאמה שלהם, להציב את המסגרת בחזרה על הסיפון (המסגרת מחזיקה בעמדה עם 2 מגנטים קטנים הממוקמים בחלקו הקדמי של הסיפון). דרך חלופית להמשיך עם שלב זה היא לשפוך את הפתרונות לתוך שקתות כאשר הם ממוקמים כבר על הסיפון.
</li>
		<li>מניחים את הצלחת התגבשות על המוביל SBS ממונע.</li>
		<li>לחץ על 'תשאף' ולחכות בשלב זה יושלם (כאשר בוכנות עצר בדרך למעלה).</li>
		<li>מעבר לכרטיסיה 'לרוץ' ולהפעיל את התוכנית.</li>
		<li>בגמר של התוכנית, לחזור אל הכרטיסיה הגדרה, לחץ על 'הסר': המערכת ניקוי המזרקים את מפתרונות שאריות, ואז מרים את הפיסטונס עד הסוף. 'לטהר' עשויים להתבקש במקום 'הסר'; זה ישאיר את בוכנות במיקום התחתון, מוכן לרוקן פתרונות יותר עם מזרקים אותו.
</li>
		<li>הסר תארגן את הדברים על ידי ומסובב אותם התרחקותו.</li>
		<li>להיפטר מזרקים של שקתות בסל המתאים (או לשטוף אותם עם מים יונים, ולאחר מכן 20% v/v אתנול פתרון לשימוש חוזר).</li>
		<li>לאטום את הצלחת ומניחים אותו על מיקסר microplate במשך 3 דקות במהירות של 1000 סל ד, או 10 דקות כאשר פתרונות בעלי צמיגות גבוהה מעורבבים. הבסיס מוכן להגדרת התגבשות טיפות על מנפק nanoliter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תוסף הקרנת פרוטוקול 1 (הגדרת התגבשות טיפות לתוך צלחת 96-ובכן התגבשות מראש מלא מסך כתוסף)
	<ol>
<li>ראשית, להכין את המצב עם ריכוזים הראשונית של ריאגנטים גדלה בכ-10% (מינימום כרך 15 מ"ל בעת העברת התנאי של מיכל על-גבי המסך מוספים עם המטפל נוזלי).</li>
		<li>ודא כי המטפל נוזלי מוכן לנתח. פתח את התוכנית 'הוסף למסך תוספים' על לוח אחד (להכניס נפח מאגרים: '72 µL'). מנחה, דמויות ועזרה עצה-ניהול מערכת (12 x 1,000 µL טיפים נדרש) עם מוודא הרובוט הוא מוכן לפעול על-פי הבחירות.
</li>
		<li>להחזיר את המסך מוספים מן החממה-20 ° C, להסיר את החותם אלומיניום מיד (שימוש בעל צלחת) ולאחר מכן מקם את הצלחת על סיפונה של המטפל נוזלי. התוכנית פועלת לפי פריסה דיוקן (הצלחת ממוקם מעבר לפינה-A1 ממוקם בפינה הקדמית השמאלית של המוביל). גם להציב את המיכל מלא עם המצב. הפעל את התוכנית.</li>
		<li>פעם היו מלאים המאגרים של הצלחת, מניחים אותה על גבי ניעור microplate ולהפעיל את התוכנית. יש לשטוף את הגורם המכיל של תנאי עם יונים מים ו-20% אתנול לשימוש חוזר.</li>
		<li>
להגדיר את טיפות על מנפק nanoliter. ראשית, פתחי את הצלחת התגבשות (שימוש בעל צלחת). אז, את הצלחת ואת החלבון 8-ובכן להתפשט במקום הראשון של בלוק רצועת-מחזיק את המקום. הכרטיסיה 'הגדרה' על תוכנת השליטה מציגה את העמדות בפועל של כל רכיב על הסיפון. לטעון כל טוב של רצועת עם חלבון דגימת לפי גודל טיפה הנדרש (טבלה 4). להפעיל את התוכנית להכין טיפות.
</li>
		<li>בגמר של התוכנית, הסר את הלוחית של הסיפון, לאטום אותו מיד (להשתמש סילר לאיטום צלחת, דבק רחב 3 אינץ). למחוק את רצועת לפח המתאים.</li>
		<li>להעריך את הגודל, צורה, ולמרכוז של טיפות מתחת למיקרוסקופ לפני האחסון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תוסף הקרנת פרוטוקול 2 (הגדרת התגבשות טיפות לתוך צלחת 96-ובכן התגבשות עם מסך מוספים מחדש שמיש)
	<ol>
<li>תחילה, הכן את המסך מוספים: להשאיר את הצלחת תרבות המתאים תא 96-ובכן קפואים להפשיר בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לאחר מכן, centrifuge את המסך מוספים ב 1,000 x g למשך 2 דקות.</li>
		<li>להכין את התנאי (מינימלית כרך 15 מ"ל בעת העברת התנאי של מיכל על-גבי המסך מוספים עם המטפל נוזלי).</li>
		<li>למלא את המאגרים של צלחת 96-ובכן התגבשות עם התנאי. על המטפל-הנוזל, המשך באותו אופן כמו פרוטוקול 1, צעד 2.2.2, אך הזן '80 µL' עבור אמצעי האחסון במאגרים.</li>
		<li>להגדיר את טיפות על מנפק nanoliter עם 3 רכיבים על הסיפון (לוח המכיל את המסך מוספים, יחד עם לוח התגבשות ורצועת 8-ובכן חלבון במקום הראשון של בלוק רצועת-מחזיק, בטבלה 4).</li>
		<li>לאטום את הצלחת התרבות התא המכיל את המסך עם גיליון אלומיניום ומניחים אותו בחזרה בחממה-20 ° C.</li>
		<li>להעריך את הגודל, צורה, ולמרכוז של טיפות מתחת למיקרוסקופ לפני האחסון.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

אנחנו בזאת המדינה עניין מסחרי סותרות מאז LifeArc commercializes את הפריטים הבאים: 96 - ו 48-הבאר MRC צלחות, MRC תלייה טיפה החותם, המסכים התגבשות LMB אנגסטרום, Pi, מורפיוס.

1 - הכנה ושימוש ראשוני מסכי מאוחסנים לוחות
הקרנת ערכות צריך להיות מעורב לפני להיות בגליל לוחות כי ההפרדה משקעים או שלב אור מתרחשת כמה צינורות במהלך האחסון. כאשר המסך מורכב שתי ערכות (2 x 48 צינורות), הצינור הראשון של ערכת השני ממוקם במיקום E1 נושאת קירור. כאשר המסך מורכב של ערכות 4 (4 x 24 צינורות), הצינור הראשון של ערכת השני ימוקם במיקום C1, הצינור הראשון של ערכת השלישי ממוקם במיקום E1, הצינור הראשון של ערכת הרביעי ממוקם במיקום G1. בעת הוספת הצינורות במנשא הקירור שלהם, עפעפיו ממוקמות על מגש בעקבות הפריסה תקן 96-ובכן נוף. מאז המספרים טוב נקובים מעל עפעפיו על ידי יצרני, הדבר מאפשר הצלבת אם לכל הצינורות הונחו בסדר הנכון. זה גם עוזר כדי להחליף את המכסים הנכון על הצינורות בעת מילוי מספר מופחת של צלחות.
אנו מאחסנים את הצלחות שמולאו מראש ב 10 ° C, פשרה כדי להימנע הקפאה ואחסון ב 4 ° C זה עלול לגרום להידרדרות של מצבים ובעיות עם איטום. צלחות מאוחסנים עבור אפילו מספר חודשים עם כלל לא מורגש עיבוי על הפנים הפנימי של החותם. זה פחות נכון עבור לוחות LMB05, LMB06, LMB09, LMB10 כמו אלה מכילים התנאים עם ריכוזים גבוהים יחסית של ריאגנטים נדיף (טבלה 1). כמות קטנה של עיבוי על הצד הפנימי של החותם מפחית יעילות איטום והוא יכול לגרום זיהום צולב בין בארות בזמן unsealing את הצלחות. כדי לסייע למנוע עיבוי במהלך הקירור הראשוני, צלחות ניתן להעביר תחילה של הקרוסלה לתוך פיקניק מבודדים קריר המאוחסן בחדר קר 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. התקררות איטית מאוד מצמצם את ההתפתחות של מעברי צבע הטמפרטורה בתוך הבארות אטום, ומכאן ומפחיתה עיבוי הכוללת15. בנוסף, ברגע הלוחות מאוחסנים בחממה 10 ° C, ללא צורך במיקור חוץ מותאמים אישית SBS פוליסטירן המכסה מושם בצלחת בחלק העליון של כל ערימה (לא מוצג).
הערכה השלמה של הצלחות שמולאו מראש שלנו יכול לשמש כמסך ראשונית גדולה נגד מדגם הרומן, מסיסים במים, חלבון. לחלופין, ייתכן שנבחר צלחות פחות כדי להתאים את דרישות ספציפיות. לדוגמה, LMB15 ו- LMB19 הם מסכים שגובשו במיוחד עבור26,דגימות חלבון ממברנה27, או LMB20 היא מסך עם כבד-אטומים כדי להקל על ניסיוני בהדרגה של נתוני דיפרקציה28 (ראה גם : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">ניסוח של מורפיוס חלבון התגבשות המסכים</a>).
2. הגדרת התגבשות טיפות
בעת שימוש במערכת 2, הקרנת ערכות עם כמויות משמעותיות של ריאגנטים נדיף תעובד קודם. זה מונע התעבות שהצטבר על הגומי של הכיסוי SBS, אשר יכול להשפיע על מכסה טיפול ואיטום צלחת. המכסה SBS יש קצת סיווג כאשר על צלחת, ולכן הם צריכים להיות מיושרים בתחילה (ראה פרוטוקול, שלב 1.2.6). אמצעי האחסון מת ב הבארות של צלחת PCR חלבון הם נדיב יחסית (0.8 µL, ראה מקרא המובאים בטבלה 2). שימו לב כי באותה מידה נדיב כרכים מת הם מועסקים בעת השימוש מנפק nanoliter בנפרד עם חלבון ברצועות 8-טוב (טבלה 4). אמצעי אחסון קטן יותר מת עשויה לפעול, אולם כמה דגימות לדבוק הטיפים, כיול של רובוט עשוי להיות מעט לא מדויקים, החדר יכול להיות חם יותר מאשר כרגיל, ועוד. כל להוביל לדוגמה הפסדים מכוסה על ידי אמצעי האחסון מת נדיב על מנת לחזק את הגישה.
התפתחויות נוספות המזעור של ניסויים וההגדרה ומכאן היקף המדגם הדרוש לסינון התגבשות התנאים ניתן להפחתה בהכניסו המתאימים טכנולוגיה29,30 . עם זאת, היבטים מסוימים של מזעור נוסף צריך שיקול דעת זהיר, כגון האידוי של טיפות31 והמניפולציה של microcrystals32.
לבסוף, צנטריפוגה של הצלחת (2,000 סל ד, 1 דקות) יכול להיות משולב כשלב הסופי שגרתית בעת הגדרת התגבשות טיפות (ב כדורית העליונה-ולס). בגודל ובצורה עקבית יותר של טיפות הנובע צנטריפוגה עשויה להפחית הפארמצבטית-בעיות-33,-34. . בוודאי, טיפות ממורכז תקל את ההערכה מאוחר יותר של ניסויים באמצעות מיקרוסקופ כפי אורך המוקד הדרוש יהיה דומה על פני המשטח כולו.
3. יתרונות השיטה 4-פינה
היתרון המשמעותי ביותר של שיטת 4-פינה הוא הפשטות שלה, אשר ממזער שגיאות ומקל פרוטוקולים אוטומטיים פשוטה. לדוגמה, הפתרונות בפינה תמיד ימוקם על סיפון נוזלי עוזר בעקבות באותה הפריסה. כמו כן, כל התוכניות מבוססות על יחס קבוע בין הפתרונות (איור 3C). הכנה ידנית של הפתרונות בפינה היא עדיפה לטיפול האוטומטי של פתרונות בריכוזים גבוהים, אשר יכול להיות בעלי צמיגות גבוהה. יחסית מהיר ומדויק השאיפה/dispensing אפשרי אז על רוב סוגי המטפלים נוזלי עם הדרישות המינימליות עבור אופטימיזציה של מחלקות נוזלי. בכל זאת, כמה פתרונות פינה עדיין ייתכן צמיגה יותר מדי בשביל רובוט הפועלים עם מערכת נוזל לפעול ביעילות. זו הסיבה לניתוח עוזר נוזלי ההפעלה עם תזוזה חיובית (איור 3B).
בנוסף 2 מעברי צבע ליניאריים של ריכוזים, רכיב השלישי (כלומר, קבוצה של אנשים רגילים/תוספים) יכול להיבדק על ריכוז קבוע בדרך נוחה. בשביל זה, כמויות גדולות יחסית של ערכה בסיסית של פתרונות פינה-ריכוז גבוה יותר כראוי, לא כולל את הרכיב כדי להיות מגוונים, מוכן קודם. לאחר מכן, מלאי פתרונות כולל רכיב זה מתווסף כדי להתאים את ריכוזי הסופי. לדוגמה, 50 מ של קבוצת 4 פינת פתרונות מוכנים בריכוזים גבוהים 10% מאשר בתחילה. סט הליבה ואז מפוצל לערכות 5 של 4. לבסוף, 10% בנפח של מאגר שונים-pH פתרונות מתווסף משנה.
4. תבניות וסוגי מסכי מוספים
המסכים מאוחסנים בדרך כלל ב-20 ° C (איור 4) מאז הם לא משמשים באופן קבוע ומכילים חומרים נדיפים/לא יציב. השימוש של מסך מוספים קפוא המאוחסנים בתוך גוש עמוק טוב (1 מ"ל במספר בארות) חייב להיות מתוכנן מוקדם כי זה יקח 12-24 ביממה עבור כל הפתרונות מוספים להפשיר לחלוטין בטמפרטורת החדר. כמו כן, מספר רב של משתמשים לשתף באותו מסך מוספים, ובכך לגרום בעיות זיהום צולב. לבסוף, הגובה של בלוקים עמוק טוב גורם להם מתאימים עבור רוב מתקני החלוקה nanoliter. כפתרון נוח כדי לעקוף בעיות אלה, המסך צריך להעביר מהגוש עמוק טוב לוחות פרופיל נמוך (איור 4).
מבחינה היסטורית, מסכי מוספים הכוללים מגוון רחב של ריאגנטים יחיד (עם ריכוזים יחיד) היה מאוד פופולרי35,36. עם זאת, סוגים אחרים של מסכי מוספים פותחו המשלבים mixes תוספים37 או מספר מופחת של תוספים יחיד ב ריכוזים שונים38. לבסוף, בגישה המשלימה היא לחקור את ההשפעה של תוספות על הדגימות לפני התגבשות39,40.
5. עוד שיקולים
אימון טוב: רוב מסכי מכילים חומרים מזיקים או אפילו רעילים, ולכן חייב להיות מועסק הגנה אישית נאותה במהלך הפרוטוקולים. באותה מידה, חלקים של הרובוטים נעים עלול להוביל לפציעות, במיוחד כאשר מנסה להפריע באופן ידני בעת הפעלת תוכנית (למרות רוב הרובוטים יש לחצן עצירת חירום/מערכת). בגלל המורכבות הטכנית מעורבת, רגיל בדיקה של רובוטים, מסכי ותוכניות עם בעבר אפיינו את הבדיקה דוגמאות חשובים עבור רמות גבוהות מתמשכת של הפארמצבטית.
תפוקת: כאינדיקציה, בין 4,000 ל 8,000 LMB הלוחות מיוצרים שנתי עם מערכת 1 (וגם לאחר מכן מועסקים על-ידי משתמשים להקרנה הראשונית). שזה לא מותאם מניות כמות גדולה של צלחות שמולאו מראש ב 10 ° C כאשר מחזור הצפוי הוא נמוך בהרבה, כמו אחרי 4-5 חודשים, כמה תנאים יתחיל להתדרדר להתאדות. גישות שונות כדי אוטומציה פרוטוקולים יושמו עבור מעבדות קטנות - עד בינוניים41.
Storing והערכה ניסויים: לאחר הכנת את טיפות, צלחות מאוחסנים על מדפים נמוכים-רטט בחדר בשעה 4 או 18 ° C עם טמפרטורה מבוקרת בחוזקה (+ /-0.5 ° C סטיית המרבי). ניסויים הם העריכו באמצעות מיקרוסקופים מקור אור קר. מערכות הדמיה אוטומטיות שונות זמינים מסחרית, אולם אחד יש לשקול היטב כל ההיבטים: המהירות הדרושה כדי לסרוק צלחת יהיה מספיק עבור תפוקה גבוהה? אובייקטים שאינם קריסטלים יפריע פוקוס אוטומטי? איכות התמונות המתקבלת יהיה מספיק כדי ספוט גבישים קטנים מאוד (במיוחד סביב קצה טיפות)? 42 , 43 , 44
השוואה של התגבשות התנאים: לאחר חקירות זהיר על טבעו של הקריסטלים השיג בתחילה, אחד ניתן לנתח מגמות, דמיון על פני תנאי שימוש על <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB מסך מסד הנתונים</a> או את C6 <a href="http://c6.csiro.au/">כלי אינטרנט</a>45.

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן מוחל נרחב כדי לקדם את ההבנה שלנו של מנגנונים ביולוגיים ומחלות בשלב האטומי וכדי לסייע לאחר מכן גישות רציונלי גילוי סמים1. בשביל זה, מטוהרים, מרוכז (2-50 מ"ג/מ"ל) דוגמאות macromolecular של חלבון, DNA, RNA, אחר ליגנדים מתחמי שלהם הם trialed עבור שלהם נטיה טופס הזמנת סורגים תלת מימדי התגבשות2,3 ,4. כאשר גבישים באיכות גבוהה מתקבלים זה מכמותה צילומי רנטגן, עשוי לפתור את מבנה גבישי ליד ברזולוציה אטומית5,6. ויותר חשוב, לא ניתן לחזות את התנאים כדי לגבש מדגם הרומן, התשואה של גבישים באיכות גבוהה בדרך כלל נמוך מאוד. הסיבה הבסיסית היא דוגמאות רבות עניין מאתגר מאפייני הביוכימי, ההופכים אותם לא יציב על ציר הזמן המתאים עבור התגבשות (בדרך כלל כמה ימים). בסופו של דבר, התהליך מורכב את הזמן הנדרש כדי לייצר גרסאות מדגם ודוגמאות, וכדי לייעל את טיהור וגיבוש -7,8.
תנאי התגבשות הוא פתרון עם precipitant המפחיתה מדגם מסיסות, תנאים מכילים לעתים קרובות גם מאגרים ותוספים. מאות כאלה ריאגנטים מתאימים היטב כדי לשנות את הפרמטרים של הניסויים התגבשות כפי שיש להם נטיה נמוכה להתערב עם שלמות הדגימה (כגון חלבון או חומצות גרעין התגלגלות). ואילו בדיקות מיליונים of שילובים of התגבשות ריאגנטים הוא לא ריאלי, בדיקה כמה הרבה ערכות הקרנה - גיבש עם אסטרטגיות שונות9,10 - אפשרי עם ניסויים ולמחקר ופרוטוקולים אוטומטית. בפרספקטיבה הזו, הטכניקה נוח ביותר היא כנראה אדי דיפוזיה עם 100-200 nL טיפות יושב על באר קטן מעל מאגר המכיל את התנאי התגבשות (25-250 µL), מיושמת צלחות מיוחדות התגבשות11 , 12. תנאי ולדגום החלבון משולבים לעתים קרובות ביחס 1:1 עבור הנפח הכולל של 200 nL בעת הגדרת את טיפות בבארות העליונה. ניתן ליישם התגבשות חלבון nanoliter רובוטית עם טכניקות חלופיות, צלחות כגון שמן שפרמיה אצווה13 ושלב מעוקבים Lipidic14 (אחד האחרונים מיושמת באופן ספציפי הטרנס-הממברנה חלבונים הנמצאים מאוד מסיסות במים).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">המתקן התגבשות-MRC-LMB</a> החלה בתחילת שנות האלפיים, סיכום מוקדם של פרוטוקולים אוטומטיים שלנו הוצג בשנת 200515. הקדמה היסטורית חלבון התגבשות הוצג ולגשת גם חלוקה לרמות את היתרונות של nanoliter רובוטית (ואז גישה מוזרה לניסויים בבעלי חיים שגרתיים). מאז התגבשות macromolecular הוא בעצם תהליך סטוכסטי עם מעט מאוד או לא שימושי מידע מוקדם, העסקת במגוון רחב של מחלות הראשונית (מתאים) להגדיל את התשואה של איכות עקיפה קריסטלים16. חוץ מזה, יתרון-מתעלמים של מסך גדול הראשונית היא להפחית באופן משמעותי את הצורך אופטימיזציה של גבישים במקרים רבים ודוגמאות. כמובן, אחד עשוי עדיין צריכים להמשיך עם אופטימיזציה של כמה תנאים הראשונית מאוחר יותר. בדרך כלל, הריכוז של ריאגנטים, ה-pH ואז באופן שיטתי נחקרות. ריאגנטים יותר ניתן גם להזרים את תנאים אופטימליים יותר לשנות פרמטרים של התגבשות. בהחלט, אחד צריך לנסות התגבשות עם מדגם הטרי, ומכאן הפרוטוקולים המתאימים להיות פשוטה וזמינה בכל עת.
כאן, שתיים אוטומטי לחלוטין מערכות תוכנן ב- MRC-LMB (מערכות 1 ו-2), הפרוטוקולים המתאימים מתוארים באופן מלא. היישום העיקרי של שתי מערכות אלה היא ראשונית ההקרנה על ידי פיזור אדי יושב טיפה התגבשות צלחות. מערכת 1 משלבת מלווה נוזלי, של קרוסלה אוטומטית ללוחות מניות, מדפסת הזרקת דיו של צלחת תיוג של סילר לאיטום צלחת דבק. במערכת 1, צלחות 96-ובכן 72 מלא עם ערכות זמינים מסחרית ההקרנה (80 µL של מצב יועברו למאגר מ נפח ההתחלתי של 10 מ"ל במבחנות), שכותרתו, אטום. הלוחות מאוחסנים ואז חממה 10 ° C שיהיו זמינים למשתמשים בכל עת (כמו מסכי הראשוני הנקרא 'LMB צלחות').
מערכת 2 משלב מלווה נוזלי, מתקן nanoliter, סילר לאיטום של צלחת דבק. במערכת 2, יושב טיפות (100-1, 000 nL) לניסויים דיפוזיה אדי מיוצרים על ידי שילוב של תנאים, המדגם בבארות העליונה של 20 צלחות 48 - או 96-ובכן מראש מתמלאת תנאים. משמעות הדבר היא תנאי ההקרנה הראשונית 1,920 הם trialed בעת שימוש 20 צלחות LMB על מערכת 2.
רובוטים משמשים גם בנפרד עבור אופטימיזציה של התנאים שנבחרו, הפרוטוקולים חצי אוטומטי המתאים מתוארים גם. שיטה 4-בפינת ה-17 הוא מועסק באופן שגרתי כדי לייצר מסכי אופטימיזציה. הפרוטוקול המתאים הראשון דורש הכנה ידנית של 4 פתרונות ("A, B, C ו- D'). שני מעברי צבע ליניאריים של ריכוזים (עבור שני סוכנים התגבשות הראשי) ואז נוצרות באופן אוטומטי ישירות לתוך המאגרים של צלחת התגבשות. בשביל זה, המטפל נוזלי המבוסס על המזרק dispenses הפתרונות בפינה-יחס שונה.
כדי לייעל עוד יותר תנאי, אחד יכול להעסיק מסכי תוסף זה פוטנציאל לשפר את המאפיינים של גבישים וכתוצאה מכך18. שתי הגישות זמינים להקרנה מוספים: פרוטוקול מתחיל עם תוספים בגליל לתוך המאגרים של התגבשות צלחות לפני שתגדיר את טיפות (פרוטוקול 1) ופרוטוקול אחר שבו המסך תוסף זה בגליל ישירות על גבי טיפות (פרוטוקול 2).
התפתחויות שימושיות אחרות היו ביוזמת MRC-LMB כדי להקל על התגבשות macromolecular אוטומטיות, מוצגים גם. בעיקרו של דבר, התגבשות צלחות ומכשירים המשויכים כגון משתלבת החברה של למערכות ביולוגיות ההקרנה (SBS) מכסה את זה ממזער אידוי של תנאים כאשר באמצעות מערכת 2.
לשם קיצור, ההנחה היא כי המשתמשים הם מכירים הפונקציות הבסיסיות ואת התחזוקה של מנפק nanoliter למדפסת הזרקת דיו, חותם צלחת דבק. אלא אם צוין אחרת, צלחות על סיפונה של הרובוטים ימוקמו כך טוב A1 ('A1-הפינה') היא לכיוון הפינה השמאלית האחורית של נשאית צלחת.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Robots&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&amp;reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&amp;reg; STAR&amp;trade;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&amp;trade; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td></tr><tr><td>Mosquito&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dragonfly&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adhesive plate sealer</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td></tr><tr><td>Inkjet printer 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Crystallization screens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Ammonium Sulfate</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Sodium Chloride</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Index&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&amp;trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td></tr><tr><td>Pi minimal screen</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG screen</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; II screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td></tr><tr><td>LMB crystallization screen&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additive screens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT additive screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (500 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>ANGSTROM additive screen&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Frozen in 96-well cell culture Costar&amp;reg; plate with V-shaped wells (100 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>ANGSTROM additive screen&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Frozen in 96-well cell culture Costar&amp;reg; plate with V-shaped well (100 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>HIPPOCRATES additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&amp;reg; III).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well MRC 2-drop plate</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&amp;nbsp; &amp;micro;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td></tr><tr><td>48-well MRC 1-drop plate&amp;nbsp; (&#039;MAXI plate&#039;)</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&amp;nbsp;</td><td>Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&amp;nbsp; &amp;micro;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &amp;micro;L. UV transmissible.</td></tr><tr><td>MRC hanging drop seal</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td></tr><tr><td>Adhesive sealing tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3-inch wide Duck&amp;reg; HD Clear&amp;trade; for sealer and manual sealing.</td></tr><tr><td>Adhesive aluminium sheet</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Used to reseal additive screens.</td></tr><tr><td>Ink cartridge</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (inkjet printer).</td></tr><tr><td>Solvent cartridge</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (inkjet printer).</td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L tips&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR&amp;trade; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&amp;trade; tips in disposable stacks.</td></tr><tr><td>Reagent container</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR plate</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>AB-2150</td><td>System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&amp;reg;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td></tr><tr><td>microsyringes</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&amp;reg; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td></tr><tr><td>strip-holder block</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>SSB device for the Mosquito&amp;reg; strips, aka &#039;4-way Reagent Holder&#039;.</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;L 8-well strip</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Contains protein on the deck of the Mosquito&amp;reg;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;L 8-well strip</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Contains protein on the deck of the Mosquito&amp;reg;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Syringe body and piston for the Dragonfly&amp;reg; liquid handler. Pack of 100.</td></tr><tr><td>Troughs/Reservoirs</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&amp;reg;. Pack of 50.</td></tr><tr><td>Orbital microplate shaker</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&amp;reg; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td></tr><tr><td>Microplate mixer</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td></tr></tbody></table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

כאשר גבישים באיכות גבוהה מתקבלים זה מכמותה צילומי רנטגן, עשוי לפתור את מבנה גבישי ליד ברזולוציה אטומית. התנאים כדי לגבש חלבונים, DNAs, RNAs ואת מתחמי שלהם עם זאת לא ניתן לחזות. העסקת במגוון רחב של תנאים היא דרך להגברת איכות עקיפה גבישים. שתי מערכות אוטומטית לחלוטין פותחו ב MRC מעבדה לביולוגיה מולקולרית (קיימברידג ', אנגליה, MRC-LMB) המאפשרים התגבשות הקרנה נגד תנאי ראשוני 1,920 על ידי אדי פיזור טיפות nanoliter. פרוטוקולים אוטומטיים למחצה גם פותחו כדי למטב את התנאים על-ידי שינוי הריכוזים של ריאגנטים, ה-pH, או על ידי החדרת תוספים המשפרים באופן פוטנציאלי מאפיינים של הקריסטלים וכתוצאה מכך. כל הפרוטוקולים המתאים להיות מתוארות בפרוטרוט ודן בקצרה. יחדיו, הם מאפשרים נוחה ויעילה מאוד macromolecular התגבשות במתקן מרובת-משתמשים, תוך מתן למשתמשים שליטה על פרמטרים מרכזיים של הניסויים שלהם.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

מערכות אוטומטיות, פרוטוקולים עבור הכנת כמות גדולה של מסכי שגרתית ו nanoliter טיפות התגבשות לניסויים דיפוזיה אדי תיאר, דנו.

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K Views.  Medical Research Council. מערכות אוטומטיות, פרוטוקולים עבור הכנת כמות גדולה של מסכי שגרתית ו nanoliter טיפות התגבשות לניסויים דיפוזיה אדי תיאר, דנו.

Video: Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genetics

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice

Evolution has selected a repertoire of defensive behaviors that are essential for survival across all animal species. These behaviors are often stereotyped actions elicited in response to innately aversive sensory stimuli, but their success requires enough flexibility for adapting to different spatial environments, which can change rapidly. Here, we describe a behavioral assay to evaluate the influence of learned spatial knowledge on defensive behaviors in mice. We have adapted the widely used Barnes maze spatial memory assay to investigate how mice navigate to a shelter during escape responses to innately aversive sensory stimuli in a novel environment, and how they adapt to acute changes in the environment. This new assay is an ethological paradigm that does not require training and exploits the natural exploration patterns and navigation strategies in mice. We propose that the set of protocols described here are a powerful means of studying goal-directed behaviors and stimulus-triggered navigation, which should be of interest to both the fields of instinctive behaviors and spatial memory.

This protocol describes a behavioral assay, based on the Barnes maze test, to study how instinctive defensive actions are modified by the knowledge of spatial environment.

וזמינותו התנהגותית עבור חוקרים את התפקיד של זיכרון מרחבי במהלך ההגנה אינסטינקטיבית בעכברים

Evolution has selected a repertoire of defensive behaviors that are essential for survival across all animal species. These behaviors are often ...

Behavior

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice of detergent is critical, because it affects both the stability and monodispersity of the complex. We recently determined the crystal structure of an active state of bovine rhodopsin coupled to an engineered G protein, mini-Go, at 3.1 &#197; resolution. Here, we detail the procedure for optimizing the preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. Dark-state rhodopsin was prepared in classical and neopentyl glycol (NPG) detergents, followed by complex formation with mini-Go under light exposure. The stability of the rhodopsin was assessed by ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, which monitors the reconstitution into rhodopsin of the light-sensitive ligand, 9-cis retinal. Automated size-exclusion chromatography (SEC) was used to characterize the monodispersity of rhodopsin and the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) confirmed the formation of the complex by identifying a 1:1 molar ratio between rhodopsin and mini-Go after staining the gel with Coomassie blue. After cross-validating all this analytical data, we eliminated unsuitable detergents and continued with the best candidate detergent for large-scale preparation and crystallization. An additional problem arose from the heterogeneity of N-glycosylation. Heterologously-expressed rhodopsin was observed on SDS-PAGE to have two different N-glycosylated populations, which would probably have hindered crystallogenesis. Therefore, different deglycosylation enzymes were tested, and endoglycosidase F1 (EndoF1) produced rhodopsin with a single species of N-glycosylation. With this strategic pipeline for characterizing protein quality, preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex was optimized to deliver the crystal structure. This was only the third crystal structure of a GPCR&#8211;G protein signaling complex. This approach can also be generalized for other membrane proteins and their complexes to facilitate sample preparation and structure determination.

This report describes screening of different detergents for preparing the visual GPCR, rhodopsin, and its complex with mini-Go. Biochemical methods characterizing the quality of the complex at different stages during purification are demonstrated. This protocol can be generalized to other membrane protein complexes for their future structural studies.

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Biology

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

גמיש מדידה של כתבים זוהרים באמצעות לוציפראז האורך אוטומטית של הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

חקירת לוקליזציה של ATG9A בתאים

Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive pathological conditions. A set of proteins, called ATG proteins, comprise the core autophagy machinery and work together in a defined hierarchy. Studies in recent years have improved our knowledge of the autophagy pathway. Most recently, it has been proposed that ATG9A vesicles are at the heart of autophagy, as they control the rapid de novo synthesis of an organelle called the phagophore. The study of ATG9A has proven challenging, since ATG9A is a transmembrane protein, and it is present in different membrane compartments. As such, understanding its trafficking is an important element for understanding autophagy. Here, detailed methods are presented that can be used to study ATG9A and, in particular, its localization using immunofluorescence techniques, which can be assessed and quantified. The pitfalls of transient overexpression are also addressed. The correct characterization of ATG9A function and the standardization of techniques to analyze its trafficking are crucial to further characterize the events governing autophagy initiation.

Author Spotlight: Imaging ATG9A, חלבון ממברנה רב-מורחב  

This protocol describes various methods that can help in the study of ATG9A biology, including immunofluorescence followed by image analysis, transient overexpression considerations, and investigating the ATG9A glycosylation status using western blot.

הדמיה ATG9A, חלבון ממברנה רב-מורחב

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive ...