התגבשות על ידי דיאליזה היא שיטה לא מנוצלת. פרוטוקול זה מציג גישה נובו לכך, אשר תגדיל את מגוון אסטרטגיות ההתגבשות הקיימות כיום לקביעה מובנית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא בעלת תפוקה גבוהה, פשוטה להתקנה ללא צורך בציוד מיוחד, ומאפשרת ניטור קל של צמיחת גבישים.
האדם המבצע טכניקה זו חייב להיות נוח עם pipetting נפח נמוך באמצעות פיפטות רב ערוציות. יש להקפיץ את הטיפות בצורה מספקת ככל האפשר כדי למנוע התייבשות חלקית. כדי להגדיר את ניסוי המיקרודיאליזה, הניחו צלחת מיקרודיאליזה מסחרית של 96 בארות בכיוון צד החלבון כלפי מעלה והסירו את סרט הכיסוי הדביק על ידי קילוף ספייסר הדבק בלחץ 200 מיקרון.
לאחר קילוף סרט הכיסוי הדביק, שים לב למיקום של באר A1. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב ערוצית, לטעון מקסימום של 3.2 מיקרוליטר של דגימת חלבון מוכן כראוי לתוך כל באר. מקם כראוי את סרט כיסוי UV של 200 מיקרון מעל צלחת 96 בארות כאשר הסרט פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כדי להפעיל ולאטום את דבק הלחץ, לחץ על סרט כיסוי UV באמצעות משוט איטום ובדוק את תקינותו.
כעת, הפוך את הצלחת כדי להביא אותה לכיוון צד החיץ כלפי מעלה ושים לב למיקום המראה של הבאר המסומנת A1. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לטעון מקסימום של 350 מיקרוליטר של תמיסת הדיאליזה לתוך כל באר של הצלחת בזהירות לאטום את הבארות עם סרט כיסוי המאגר. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בכיוון צד החיץ כלפי מעלה בתוך אינקובטור מבוקר טמפרטורה מתאים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר צמיחת גביש. כדי לבחון את היווצרות הגביש מתחת למיקרוסקופ, הסר את סרט הכיסוי המגן מסרט כיסוי UV של 200 מיקרון והנח את הצלחת מתחת לעינית כאשר צד החלבון פונה כלפי מעלה.
כדי להקים ניסוי התגבשות בקנה מידה גדול, אמצו את התנאים שבהם התרחשה צמיחת מיקרו-גבישים בלוח המיקרודיאליזה ושחזרו את אותם תנאים במיכלים גדולים. בחר את גודל המיכל בהתאם לנפח תמיסת הדיאליזה. פיפטה בנפח מרבי של 500 מיקרוליטר דגימת חלבון לתוך צינור הדיאליזר לפני אטימת הצינור באמצעות מכסה הפלסטיק האדום.
הניחו את צינור הדיאליזר האטום בנפח 500 מיקרוליטר במדף הצף בתוך המיכל המלא בתמיסת דיאליזה. לאחר מכן, הניחו את המיכל ללא הפרעה בתוך אינקובטור מתאים מבוקר טמפרטורה ב 20 מעלות צלזיוס כדי להשיג צמיחה גבישית. כדי לבדוק היווצרות של גבישים, פיפטה אחד עד שני מיקרוליטר של התמיסה מן dialyzer על שקופית כיסוי זכוכית.
כסו את התמיסה בשקופית זכוכית נוספת וצפו בה תחת מיקרוסקופ. תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה גבוהה הראו היווצרות מוצלחת של מיקרו-גבישים של ארבעה חלבונים באמצעות לוחות מיקרודיאליזה עם ממברנות חיתוך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון. ליזוזים נמצא כיוצר גבישים כאשר הוא מחויג כנגד נתרן אצטט מולארי 0.1 ב-pH 4 המכיל תוספים מתאימים.
דומאטין יצר גבישים כאשר חוגגו כנגד פרופאן ביס-טריס מולארי 0.1 ב-pH 6.6 המכיל תוספים מתאימים. תנאי דיאליזה אופטימליים הובילו להיווצרות מיקרו-גבישים על ידי חלבוני הממברנה, כלומר חלבון משאבת השטף הרב-תרופתי E.coli AcrB וטרנספורטר הלקטוז E.coli LacY. התגבשות בקנה מידה גדול בצינורות הדיאליזר תוך שימוש בתנאי הדיאליזה האופטימליים שהתקבלו מניסויי המיקרודיאליזה הובילה להיווצרות אלפי מיקרו-גבישים לכל אחד מהחלבונים.
לצורך התגבשות של פומיטין, 250 מיקרוליטר של חלבון היה dialyzed מול 50 מיליליטר של תמיסת דיאליזה. עבור AcrB, 250 מיקרוליטר של החלבון חוגו כנגד 25 מיקרוליטר של תמיסת דיאליזה. גם התגבשות LacY נקבעה באותו יחס, עם 100 מיקרוליטר חלבון ל-10 מיליליטר תמיסת דיאליזה.
בעת היפוך הצלחת לצד החיץ כלפי מעלה, חשוב לשים לב למיקום של A1, כך שניתן יהיה לחלק פתרונות ממסך ההתגבשות בהתאם. הגבישים המתקבלים משיטה זו יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם, כגון קריסטלוגרפיה טורית ומיקרו ED.
