אנו מודים אנדי ג&#39;ונסון של מרכז מחקר ביו רפואית UBC לקבלת סיוע בניתוח FACS. לחקר הסרטן הגיוס וונג מעבדה ניתן על ידי האגודה למלחמה בסרטן הקנדית Research Institute (ההפעלה מענק # 019250) ומ מהשקעה קרנות מחקר של הפקולטה למדעי התרופות, UBC. JMYW נתמך על ידי הכיסאות מחקר בקנדה סמית מיכאל קרן לקריירה בריאות תוכניות מחקר ופיתוח.

1. תא הכנה <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="איור 0" /> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הצלחת להשיג צפיפות של כ 60% confluency. התאים חייבים להיות בשלב יומן בעת ​​האיסוף. עבור mcf7 תאים, עושים זאת על ידי זריעה על 5 x 10 תאים 5/10 ס&quot;מ צלחת באמצעי התקשורת המתאימים. HT29 ו LS180 תאים זרע לאחר 6 x 10 תאים 5/6 צלחת ס&quot;מ. השתמשנו DMEM התקשורת השלימו עם 10% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. הקפד צלחות זרע שולטת חיוביות ושליליות הנכונותבנוסף דגימות הבדיקה שלך. הם כוללים: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אני </td><td> בקרה חיובית </td><td> BrdU בלבד </td></tr><tr><td> ב </td><td> בקרה חיובית </td><td> לצרכן בלבד </td></tr><tr><td> ג </td><td> בקרה שלילית </td><td> BrdU שלילית, PI שלילית </td></tr></tbody></table> (יש לציין כי ניסוי ראשוני עם timepoints מרובים כמו זה שמתואר בפרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לצמצם את מסגרת הזמן שבו לבצע את האוספים הבאים.) <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מצופה מודגרת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 של 24-48 שעות, ובכך לאפשר לתאים להתאושש לצרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדופק תאים תווית עם bromodeoxyuridine (BrdU), DMEM מוחלף Wiהתקשורת טריים המכילים 10 מיקרומטר ה BrdU. תאים מודגרת עבור 1 H ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, כדי לאפשר שילוב BrdU לתוך ה-DNA. הקפד להשאיר צלחת 1 מטופל לשמש בקרת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדופק תיוג התקשורת מוסר לבין תאים שטף בקצרה עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת הצמיחה טריים נוסף (מינוס BrdU) ותאי מותר להמשיך לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד timepoint מתאים קצירת הוא הגיע. </li></ol> 2. קציר קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאים שלא טופלו משלב 1.3 נחשבים timepoint אפס. מדגם זה ניתן לקצור יחד עם 1 H timepoint אשר נאסף מיד לאחר הטיפול BrdU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור את התאים, מדיה מוסר והצלחות הם שטף פעם אחת עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים trypsinized, אסף בתקשורת culturing ו pelleted לאחר מכן על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 1500 עבור 5 דקות סופernatant נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף 1-10 x 10 6 תאים 5 מ&quot;ל קרח קר 1X PBS. סרכזת בסל&quot;ד 1500 עבור Supernatant 5 דקות נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא גלולה הוא resuspended אז μl 100 של קר כקרח PBS / 1% FBS. תוספת של 1% FBS PBS מסייע במניעת clumping התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה תאים אלה על ידי ירידה של 5 מ&quot;ל ל -20 ° C, 70% אתנול לתקן את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על קרח למשך 30 דקות או בחנות ב 4 ° C למשך הלילה. זהו צעד אידיאלי שבו להפסיק איסוף דגימות מן timepoints שונים. דוגמאות ניתן להשאיר באתנול במשך כמה ימים, ולאפשר להם להיות מעובד בו זמנית באמצעות יתרת לפרוטוקול. </li></ol> 3. BrdU ו PI מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה 5 דקות בסל&quot;ד 1500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע, אבל להשאיר ~ 50 μl בו כדי לשחרר את הכדור על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפגל את ה-DNA, לאט להוסיף 1 מ&quot;ל של HCL 2N / טריטון X-100dropwise תוך vortexing. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה דגימות 5 דקות בסל&quot;ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל של 0.1M נתרן tetraborate, pH 8.5, לנטרל את הצעד denaturation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת תאים 5 דקות בסל&quot;ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב μl 75 תמהיל מכתים BrdU (50 0.5% μl tween 20/1% BSA / PBS + 20 μl FITC מצומדות נגד BrdU + 5 μl 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים גלולה, צנטריפוגות מדגמים דקות 5 בסל&quot;ד 1500. Aspirate וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​propidium יודיד. </li></ol> 4. תזרים Cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את התאים, cytometer זרימת מצויד לייזר 488 ננומטרמסננים מתאימים הוא הכרחי. תוכנת ניתוח כגון CellQuest יש ליצור החלקות המפורטות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר פועל באמצעות מדגם cytometer את זרימת, ליצור פיזור קדימה (SSC-H) לעומת הצד פיזור (FSC-H) העלילה כדי להבטיח את התפלגות גודל תקין של התאים (איור 1 א). שני פרמטרים אלה נרשמות על בקנה מידה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל להצגת חלקת FL3-H (PI כתם) לעומת fl2-W (1B איור). עלילה זו משמשת ליצירת השער (R3) כדי לבודד את החלק היחסי של תאים הנמצאים בתוך דפוס ההתפלגות הנורמלית של מחזור התא. באופן כללי, דפוס זה מאופיין על ידי חלוקת שני אשכולות של תאים מתוכן את ה-DNA של 2N ו 4n מכתים לצרכן מייצג את ה-G1 ו G2 של שלבי מחזור התא, בהתאמה. שורה של תאים הממוקמים בין 2 קבוצות הוא נציג של שכפול ה-DNA מתמשכת המתרחשת בשלב S של מחזור התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור displayi העלילהng התאים סגורות (R3) של 4.3 צעד, עם FL1-H (FITC, העלילה יומן) על ציר y ו - PI (העלילה ליניארי) על ציר x (איור 1 ג). העלילה זה ישמש כדי לקבוע את הפרמטרים הנותרים באמצעות הפקדים השונים המתוארים 1.1, וכן כדי לאסוף נתונים לצורך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את PI רק דגימה מוכתמת על cytometer. התאם רווח להציב G1 ב ~ 200 על ציר ה-x. זה יהיה קל יותר לדמיין בעלילה היסטוגרמה של PI הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקד 2 כרוך פועל מדגם BrdU בלבד על cytometer את הזרימה. התאם רווח כך 2 אוכלוסיות של תאים (BrdU חיובית לעומת BrdU שלילי) נראה על המגרש. באופן אידיאלי, התאים BrdU שליליות ממוקמים להופיע מתחת 10 -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השליטה הסופית היא מדגם BrdU / PI שלילית. הפעל בקרה שלילית על מנת להבטיח כי התאים אינם מופיעים בכל אחד הרביעים העליונה או ימינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים של החלקות השונות נקבעו,cytometer הזרימה הוא מכויל ומוכן לעיבוד של תאים BrdU ו PI מוכתמים. מינימום של 10,000 תאים הנמצאים מגודרת בשבריר לצרכן הנכון (מתייחס לשלב 4.3) יש לקרוא לכל אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את הנתונים שנאספו, תוכנה כגון FlowJo או FacsDiva מנוצלים. כל החלקות הנ&quot;ל ניתן ליצור מחדש בתוכניות אלה וניתוח כמותי סטטיסטי ביצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודת הסיום של ניתוח כולל כמה שלבים רצופים. יצירת חלקת FITC לעומת PI עם תאים סגורות כמו PI חיובית העלילה לצרכן לעומת fl2-W מאפשר להבחין בין האוכלוסייה רכיבה על אופניים. שער 2 נוצרת העלילה זה על ידי בידוד האוכלוסייה BrdU חיובית. להביע את האוכלוסייה הייחודי על מגרש היסטוגרמה עם PI על ציר ה-x מאפשר לעקוב אחר מהלך הזמן של התקדמות מחזור התא. זה יכול להיות דמיינו עוד יותר על ידי מתכנן מספר BrdU חיובי תאים עם G1 או תוכן G2 כפונקציה של הזמן. </li></ol> 5. נציג תוצאות בדרך כלל תאים אופניים מוכתמים יודיד propidium יש שיאים שונים ב G1 ו G2, המתאימים תאים המכילים תוכן DNA 2N ו 4n, בהתאמה (איור 2). הדופק סימון BrdU מאפשר תיוג סלקטיבית של אוכלוסיית משנה של תאים באופן פעיל סינתזה DNA (שלב S IE). זמן קצר לאחר הסרת מגיב BrdU, כל התאים המסומנים נמצאים בשלב S (איור 3). על ידי הגבלת תיוג לדופק קצר אחד הוא מסוגל לעקוב אחרי זה ברור עכשיו תת אוכלוסיה של תאים בכל נקודות זמן רב כשהם עוברים דרך השלבים הבאים של מחזור התא. זה יכול להיות דמיינו בנקודה H 1 זמן באיור 3 כחוסר הברור של ה-G1 ו G2 פסגות. מידע נוסף ניתן להסיק בשלב תיוג BrdU. לא רק יכול חלקם של התאים המתחלקים באופן פעיל להימדד, אבל ESTimate ההפצה מחזור התא בשלב בין שתי דגימות ניתן לקבוע גם כן. על ידי איסוף תאים במרווחים גדולים לא פחות לאחר הסרת מגיב BrdU, ניתן לאתר תאים כאשר הם ממשיכים בהתקדמות מחזור, כדי G2, ובסופו של דבר לעבור כדי חלוקת התא של התאים המקוריים, סוף סוף מתעוררים כמו BrdU חיובי לתאי הבת עם G1 ה-DNA תוכן (איור 4). דוגמה כימות מחזור התא בשלב וניתוח הקינטית ניתן באיור 5. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 (א) פיזור קדימה לעומת פיזור מגרש הצד של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. (ב) לצרכן לעומת רוחב (FL-W) מגרש של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. Gating מוצג להוציא כפילויות התא בסופו של דבר (R3). כפילויות התא יהיה רוחב הדופק עולה על תא בודד, כפי שהם דורשים זמן רב יותר לעבור דרך קרן לייזר ו therefעפרות ניתן לשלול מן הניתוח. (ג) PI לעומת FITC (BrdU) מגרש של האוכלוסייה mcf7 נציג התא. Gating מוצג לכלול רק את (BrdU) תאים FITC חיוביות (R4). <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. היסטוגרמה נציג חלקת אוכלוסייה של תאים בדרך כלל אופניים. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. העלילה היסטוגרמה של התאים שנאספו 1h לאחר הסרת הדופק BrdU, לאחר gating עבור FITC (BrdU) חיובי תאים. BrdU חיובי תאים ב timepoint מוקדם לאחר הסרת התווית הצגת פרופילים לצרכן המתאימים דגימות DNA המציגים תוכן בקנה אחד עם תאים הנמצאים בשלב-S של מחזור התא, המאשר תיוג מוצלח של תאים רק במהלך סינתזת ה-DNA. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> LT = &quot;איור 4&quot; /&gt; איור 4. השוואה של מחזור התא קינטיקה התקדמות בין שורות תאים סרטניים, סרטן המעי הגס HT29 (א) ו LS180 (ב &#39;), כמו גם סרטן השד mcf7 (C). תאים נאספו כל שעה במשך 8 שעות, בעקבות הסרת הדופק BrdU. בניסוי זה, צפינו על פרופיל ברור של התפתחות תאים מואצת לעבור שלב G2 של מחזור התא LS180 תא המעי הגס קו. השוואת קינטיקה בין שני פרופילים של תאים סרטן המעי הגס, הופעת שיא G1 ניכר ב ט = 4H שלאחר BrdU ב LS180 תאים, לעומת נקודת הזמן המתאימה לקו HT-29 בתא שבו אין זה השיא. בהשוואה בין אחת משתי שורות תאים המעי הגס, mcf7 תאים רכיבה על אופניים בקצב משמעותי. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <html> מחדש 5 &quot;/&gt; איור 5 (א) תא כמותי מחזור שלב ניתוח BrdU, שכותרתו תאים סרטניים. האלגוריתם דין / ג&#39;ט / פוקס היה מוחל על HT29, LS180 ו mcf7 (מאויר בירוק). מחזור וכתוצאה מכך על תאים בשלב הפצות מכל מדגם מבוטאות% מסך BrdU חיובי תאים עבור כל שלב. רק לבחור נקודות זמנים לקו כל תא מוצגים, כמו ניתוחים של כמה נקודות זמן קודמות הניבו תוצאות לא חוקיים. אלה נקודות הזמן קודמות, כל BrdU חיובי תאים הם בשלב-S ולכן אין G1 ברורים פסגות G2, אשר נחוצים יישום אלגוריתם. (ב) Histograms של תאים סרטניים מראה את הקינטיקה של התקדמות דרך G2 / M שלבי מחזור התא. התקדמות דרך G2 / M שלבים הוא המהיר ביותר LS180 התאים, ואחריו HT29 ו mcf7. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> . <html> &quot;alt =&quot; jpg איור S1 &quot;/&gt; איור S1. Cytometry בקרות זרימה. mcf7 תאים מוצגים הביקורת (A) שלילי שבו התאים הם לא לצרכן ולא מוכתם BrdU. (ב) לצרכן מוכתם בלבד. (ג) BrdU-FITC שכותרתו דגימות. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="להבין S2" /> איור איור S2. סכמטי המציג את הקשר בין ספקטרום פליטה הניאון של PI לעומת FITC (BrdU). החלונות איסוף ספקטרליים עבור ערוץ ניאון 1 (FL1, עבור FITC) וערוץ ניאון 3 (FL3, עבור PI) מוצגים בתיבות המתאימות. אין חפיפה בין ספקטרום fluorophore FL1 ו FL3 זיהוי. ככל הנראה, פיצוי הקרינה אינו הכרחי כאשר נתוני הניסוי של PI ו FITC-BrdU שיתוף שכותרתו התאים נאספים על FL1/FL3 ערוצי בהתאמה. ספקטרום הקרינה התקבלו באתר BioSciences BD:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה</a> .

<ol>
	<li>Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D+as+a+therapeutic+target+in+cancer.">Cyclin D as a therapeutic target in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).</li><li>Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+is+balancing+development,+differentiation+and+de-differentiation+to+assure+cancer+prevention.">p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention.</a> Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).</li><li>Dickson, M. A., Schwartz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-cycle+inhibitors+for+cancer+therapy.">Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy.</a> Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>van Opstal, A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+phosphatidylinositol+3-kinase+activity+prevent+cell+cycle+progression+and+induce+apoptosis+at+the+M/G1+transition+in+CHO+cells.">Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).</li><li>Gasnereau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+to+sort+mammalian+cells+in+cytokinesis.">Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis.</a> Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).</li><li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+cell+populations+in+G1/S+and+G2/M+phases+of+the+cell+cycle.">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).</li><li>Pedrali-Noy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+HeLa+cell+cultures+by+inhibition+of+DNA+polymerase+alpha+with+aphidicolin.">Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).</li><li>Merrill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+synchronization.">Cell synchronization.</a> Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).</li><li>Fleisig, H. B., Wong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+promotes+efficient+cell+cycle+kinetics+and+confers+growth+advantage+to+telomerase-negative+transformed+human+cells.">Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells.</a> Oncogene. , (2011).</li><li>Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZ703,+an+imidazo[1,2-a]pyridine+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1+and+2,+induces+E2F-1-dependent+apoptosis+enhanced+by+depletion+of+cyclin-dependent+kinase+9.">AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9.</a> Cancer Res. 66, 435-444 (2006).</li><li>Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+cycle+by+flow+cytometry.">Analysis of cell cycle by flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).</li><li>Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

על ידי שילוב של cytometry זרימה עם שילוב BrdU, יש לנו את הכלים הדרושים כדי ללמוד קינטיקה מחזור התא. המאפיין הייחודי של BrdU לתפקד אנלוגי תימידין מה מאפשרת כימות DNA תוכן התא רכיבה על אופניים. שילוב של BrdU לתוך גדיל DNA צומח הבת בשלב הסינתזה של מחזור התא היא מה מאפשר לעקוב subpopulation של ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> bromodeoxyuridine </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> propidium יודיד </td><td> סיגמא </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml המניות </td></tr><tr><td> FITC נגד BrdU </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן tetraborate </td><td> דיג </td><td> S80172 </td><td> 0.1M, pH 8.5 </td></tr><tr><td> FACS קליבר </td><td> בקטון דיקינסון </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ&quot;א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כניסתה של נזק שאינו ספציפי בדנ&quot;א, אשר בתורו משפיע על התקדמות מחזור התא.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

measuring-cell-cycle-progression-kinetics-with-metabolic-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  University of British Columbia. שינויים עדינים מעקב בהתקדמות ו קינטיקה של שלבי מחזור התא ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשילוב של תיוג חילוף החומרים של חומצות גרעין עם BrdU ו מכתים סך הדנ"א הגנומי באמצעות יודיד Propidium. שיטה זו מונעת את הצורך של סינכרון כימי של תאים רכיבה על אופניים, ובכך למנוע את כנ?...

Video: Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...