המחברים מבקשים להודות המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) והחברה הקנדית למלחמה בסרטן למימון מחקר מחזור התא במעבדה שלהם. MJC הוא מקבל המלגה MD / PhD מן CIHR. MJC ותואר שני חברי ההכשרה CaRTT.

<ol>
	<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+introduction.">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li><li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker,+Us9-GFP,+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry.">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li><li>Qin, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action.">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li><li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control.">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li><li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions.">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li><li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development.">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li><li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin.">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li><li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation.">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li><li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein.">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities.">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li><li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins.">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li><li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins.">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מניסיוננו, הצלחה עם טכניקות אלה תלויה שולט מפתח כמה תנאי הניסוי. האחד הוא הקמת לשלוט באופן אסינכרוני מתרבים לשימוש בניסויים אלו. שליטה זו משרתת שלוש מטרות חשובות. ראשית, היא מבטיחה כי התנאים תרבות המשמש את כל דגימות ניסיוני מספיקות כדי לתמוך שגשוג מתמשך בהעדר טיפול. מדגם זה גם משרת את המטרה של בקרה חיובית על המתודולוגיה מכתים על מנת להבטיח כי BrdU או CD20 בתאים חיוביים ניתן להבחין כאשר הם נוכחים. לבסוף, מדגם זה משמש לכייל את cytometer לזרום. מדגם זה לשלוט יכול לשמש כדי להתאים את עוצמת propidium מכתים יודיד כדי לזהות תאים ו - 2N 4N ב 200 ו 400 בהתאמה. יתר על כן, רגישות הזיהוי של BrdU או CD20 יכול להיות מותאם כך אותות שליליים וחיוביים מרוכזים כפי שמוצג דמויות 1A ו-2A. כאשר כל הדגימות יש ריכוז דומה של תאים PI-Rפתרון Nase, ולאחר מכן התאמות כמה cytometer הם הצורך דגימות עוקבות מנוהלים. זה חשוב מסיבות באיור. 4B ו 5B שם הצטברות G1 חזקה יוצרת למעשה שיא G1 יחיד שיכול להתפרש בטעות G2 / M. הניסויים נציג גם לעשות נקודות חשובות אחרות. קודם כל, הם מראים כי ספיגת BrdU וסימון יכול להשתנות בין סוגי תאים. מסיבה זו חשוב באופן אמפירי לקבוע את אורך הפולס ותנאי מכתים צריכה מספקת לזהות תאים ב-S שלב. באופן כללי, סוגי תאים כפולים, כי בתרבות בתוך 24 שעות או פחות יכול להיות מתויג עם BrdU בעוד שעה. איטית יותר סוגי תאים הגוברת עשויה לדרוש פולסים ארוכים שינויים מכתים התנאים נוגדן ומשך. תאים MCF10A הם דוגמה מצוינת לעניין זה כפי שהם כונו עם BrdU במשך ארבע שעות ו מוכתם ריכוז פעמיים רמת נוגדנים עבור ארבע פעמים, כל עוד. החוקריםצריך להיזהר שלא יעלה על 6 שעות של BrdU תיוג אפילו עם תאים לאט לאט גדל כמו זה יכול בטעות לגרום הכללת G2 / M בתאים באוכלוסייה S-שלב. שנית, להשוות את ההשפעות של ביטוי p27KIP1 עם אלה של TGF-β1, ברור כי p27 יכול לגרום הצטברות באחת G1 או G2 / M שלבים תוך TGF-β1 איתות משרה מעצר G1. אמצעים מסורתיים של גילוי התפשטות כגון התאגדות H-3 Thymidine והספירה הנצנץ לא מסוגלים להבחין בין האפשרויות הללו. בפרוטוקול החלופית שלנו אנחנו מדגימים את הזיהוי של האוכלוסייה משנה של תאים באוכלוסייה untransfected יותר. חשוב לקבוע באופן אמפירי את הכתב המתאים ביותר לאיתור תאים transfected. מניסיוננו כמה סוגי תאים או משטח להביע תא סמנים גרוע, או לא יכול כראוי תעבורת להם קרום הפלזמה, וכתוצאה מכך חוסר יכולת לזהות תאים transfected. Likewise, לא כל התאים לסבול את הטופס קרום כבול של ה-GFP. בחירת הכתב המתאימה ביותר צריך להיעשות על ידי הערכת יעילות transfection של הכתב, כמו גם את עוצמת יחסי הביטוי בהשוואה לקבוצת הביקורת untransfected. באופן אידיאלי, הביטוי Heterologous של מולקולות אלה יהיה נסבל היטב וזה מרמז כי סמנים יש מעט שום השפעה על חלוקת מחזור התא. מגבלה אחת של סוגים אלה של גישות cytometry הזרימה היא כי הם רק מסוגלים להקים שכיחותם היחסית של שלבי מחזור התא בהשוואה זה לזה. מסיבה זו היא רב משמעית אם הביטוי של p27 באיור 3 באמת גורם מעצר G1 ו - G2 / M, או אם הוא רק מאט את התקדמות דרך שלבים אלה ביחס שלב-S. אפשרויות אלה יכולים להיחקר יותר על ידי טיפול מדגם מקביל של תאים עם מעכב mitotic כגון nocodazole, או G1 / S מעכב כמו aphidicolin. מאז תרופות אלו ליצור Dominaמעצר NT ב-M-שלב מוקדם או S-שלב בהתאמה, תאים מתרבים לאט יצטברו בנקודת המושרה סמים מעצר. עבור תאים למשל נעצר G1 כי הביטוי PRB יישאר G1 למרות הטיפול nocodazole בעוד התאים לשלוט יצברו ב-M-שלב 13. יחדיו, גישות אלו ניסיוני להציע מתודולוגיה גמישה ניתן ליישם במגוון רחב של היונקים מחזור התא שאלות מחקר. הם יכולים בקלות לזהות שינויים התקדמות מחזור התא ולכמת הבדלים בהשוואה שולטת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> התפשטות תאים תיוג מגיב </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU נוגדנים </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר FITC נוגדנים מצומדות </td><td> וקטור Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> מסננים מסננים Cell </td><td> BD פלקון </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD20 נוגדנים </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> מחזור רב תוכנה </td><td> הפניקס תזרים מערכות </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

הסדרת התפשטות תאים מרכזי המורפוגנזה רקמות במהלך הפיתוח של אורגניזמים תאיים. יתר על כן, אובדן שליטה של ​​התפשטות תאים בבסיס הפתולוגיה של מחלות כמו סרטן. ככזה יש צורך גדול להיות מסוגל לחקור התפשטות תאים ו לכמת את חלקם של התאים בכל שלב של מחזור התא. הוא גם בעל חשיבות שאין להבדיל בין השתיים כדי לזהות תאים שיש שכפול ה-DNA שלהם בתוך אוכלוסייה גדולה יותר. מאז ההחלטה של ​​התא כדי להתרבות הוא עשוי בשלב G1 מיד לפני ביצוע סינתזה של DNA ועל התקדמותם דרך שאר מחזור התא, גילוי של סינתזה של DNA בשלב זה מאפשר קביעה חד משמעית מעמדה של תקנה גידול תרבית תאים ניסויים. תוכן ה-DNA בתאים ניתן ונרשמת בקלות על ידי cytometry זרימה של תאים מוכתם יודיד propidium, צבע DNA ניאון intercalating.כמו כן, סינתזת דנ&quot;א פעיל ניתן ונרשמת ידי תאים culturing בנוכחות thymidine רדיואקטיבי, קצירת התאים, ומדידת שילוב של רדיואקטיביות לתוך חלק מסיס חומצה. יש לנו ניסיון רב עם ניתוח מחזור התא ממליצים על גישה שונה. אנו לחקור התפשטות תאים באמצעות bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (מקוצר פשוט BrdU) מכתים המאתר שילוב של אלה אנלוגים תימין לתוך DNA מסונתז לאחרונה. סימון מכתים תאים עם BrdU, בשילוב עם מסך ה-DNA על ידי מכתים יודיד ניתוח propidium ועל ידי זרימת cytometry 1 מציעה את מדד מדויק ביותר של תאים בשלבים שונים של מחזור התא. זוהי השיטה המועדפת שלנו משום שהוא משלב גילוי ה-DNA סינתזה פעילה, באמצעות צביעה בנוגדנים מבוסס על BrdU, עם תוכן ה-DNA הכולל יודיד propidium. זה מאפשר הפרדה ברורה של תאים משלב G1 S מוקדם או מאוחר מן השלב G2 / M.יתר על כן, גישה זו יכול להיות מנוצל כדי לחקור את ההשפעות של גירויים רבים תאים שונים וסוכני תרופתי על רגולציה של התקדמות דרך שלבים אלה שונים מחזור התא. בדו&quot;ח זה אנו מתארים שיטות תיוג מכתים תאים בתרבית, כמו גם ניתוח שלהם על ידי cytometry הזרימה. אנו כוללים גם דוגמאות ניסיוני של כמה בשיטה זו ניתן להשתמש כדי למדוד את ההשפעות של אותות הצמיחה עיכוב של ציטוקינים כגון TGF-β1, ומעכבי שגשוג כגון מעכבי קינאז תלוי cyclin, p27KIP1. אנו כוללים גם את פרוטוקול חלופי המאפשר ניתוח של העמדה מחזור התא באוכלוסייה משנה של תאים בתוך תרבות גדולה יותר 5. במקרה זה, אנו מדגימים כיצד לזהות מעצר מחזור התא בתאי transfected עם הגן רטינובלסטומה גם כאשר במידה רבה במספרם של התאים untransfected באותה תרבות. דוגמאות אלה ממחישות את דרכים רבות מכתים דנ&quot;אcytometry זרימה יכול להיות מנוצל והותאמו כדי לחקור שאלות בסיסיות של שליטה היונקים מחזור התא.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells at JoVE.com

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

analysis-of-cell-cycle-position-in-mammalian-cells

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K Views.  University of Western Ontario. קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

Video: Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...