The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בקו תא לוקמיה לימפובלסטית החריף NALM6 אבל יכול להיות מיושם על סוגי תאים אחרים. 1. פתרונות וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 56 מיליליטר סרום עגל עוברי (FCS) ו -5.5 מיליליטר של 200 מ&quot;מ L- גלוטמין לבקבוק 500 מיליליטר של מדיום RPMI-1640. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BrdU פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 32.5 מ&quot;מ BrdU (10 מ&quot;ג / מיליליטר) בבופר פוספט של Dulbecco (DPBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI המלא BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 6.2 μl של פתרון מניות BrdU 10 מיליליטר של RPMI השלם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון DNase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DNase 1 מ&quot;ג / מיליליטר בDPBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3% FCS מומת חום ושל 0.09% אזיד הנתרן בDPBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בחומרי רשימה להגדרות של קיבוע מאגר, permeabilization הצפת והצפה לשטוף. </li></ol> 2. תאים לאטה: תאים לא היו בתרבית ליותר מ -6 חודשים. שיטה זו היא באופן ישיר וישימה לכל שורת תאים שאינם חסיד עם התאמות לצפיפות תאים ותקשורת ותרבות. להשתמש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי בייזום של הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי NALM6 בצלוחיות תרבות T-75 בRPMI השלם. לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים באמצעות Class II בטיחות ביולוגית קבינט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי NALM6 בין 1-2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר ידי פיצול התרבות שלוש פעמים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר. </li></ol></li></ol> 3. תיוג דופק של תאים עם BrdU זהירות: ידית BrdU בזהירות כפי שהוא mutagen וטךטוגן פוטנציאליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות. שים לב: העברת תאים לתקשורת טריות משפרת את שחזור של התוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים ותאים גלולים בRPMI המלא ב 2 x 10 6 ג/ אמות מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאים 1 ב 2 עם RPMI השלם BrdU ייצור ריכוז תא סופי של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 45 דקות, ואז לדלל תאים 1 ב 10 עם RPMI השלם. תאי צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות ובזהירות להשליך את כל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים בנפח קטן (~ 100 μl) של RPMI השלם, לבצע ספירת תאים ולהתאים ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 מיליליטר של תאים לתוך הבארות של צלחת גם 48. מיליליטר פיפטה 1 של DPBS לתוך כל בארות פנויות כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באוויר לנקודות זמן רצוי, כאן 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, ו -24 שעות. הערה: משך הזמן יהיה תלוי במה העיצוב הניסיוני שמטרתו למדוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל התאים לתוך צינורות FACS באמצעות פיפטה. יש לשטוף את הרצף גם עם 1 מיליליטר voluMES של PBS להיקף כולל סופי של 5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 150 במשך 5 דקות ולהסיר את כל supernatant בזהירות. תאים מוכנים לצביעה, לבצע את זה (סעיף 4) באופן מיידי. </li></ol> מכתים 4. סלולארי הערה: אם נדרש צביעת תאי שטח לבצע אותו לפני הקיבוע, על מנת להבטיח כי התאים נשמרים על 4 מעלות צלזיוס לאורך כל דרך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים במאגר של הכתמת 100 μl (מכתים משטח אופציונאלי, להוסיף הנפח המומלץ של נוגדן על פני השטח אנטיגנים דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ מכתים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG וזורקים supernatant. הערה: נוגדן ספציפי, ריכוז, זמן דגירה וכו &#39;ישתנה בהתאם למטרות ניסוי ספציפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבעון וpermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים במאגר של קיבעון 100 μl ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר oחיץ F לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים במאגר של permeabilization 100 μl דגירה התאים במשך 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים במאגר של קיבוע לכל צינור 100 μl ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 150 XG, וזורקים supernatant. הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן אם נדרש. התאים הקבועים יציבים במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס אם resuspended במאגר מכתים. הסר את החיץ מכתים הבא צנטריפוגה לפני שימשיך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNase טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend בפתרון DNase 100 μl (30 מיקרוגרם של DNase / 10 6 תאים) ותאי דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, צנטריפוגות ב XG 150 במשך 5 דקות וזורקי supernatant. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדן מכתים הערה: מכתים עבור סמנים תאיים אחרים מאשר BrdU ניתן לבצע בו זמנית עם מכתים BrdU. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב: הכן בקרות פיצוי בהיקף של תאים בלא כתם ותאים שכותרתו עם כל fluorochrome יחיד. באופן אידיאלי, להשתמש באותו נוגדנים עבור פקדי פיצויים אלו המשמשים בצינורות הניסיוניים. עם זאת, אם זה לא ריאלי, נוגדני תחליף לאנטיגנים הביעו מאוד מצומדות לאותו fluorochrome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 50 μl של חיץ לשטוף ולהוסיף μl 1/10 6 תאים של נוגדן BrdU. הערה: ניתן גם להוסיף נוגדנים מצומדות ישירות לאנטיגנים ספציפיים תאיים אחרים. הערה:. נוגדנים להיסטון H3 phosphorylated על Ser10 יכולים לשמש כדי להבחין בין התאים בG2 וM, היסטון H3 הוא phosphorylated בSer10 במהלך מיטוזה 10 נוגדנים לcdc2 phosphorylated על Tyr15 יכול לשמש כדי לזהות תאים שhavדואר מחויב למיטוזה. 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ לשטוף, תאי צנטריפוגות ב XG 150 במשך 5 דקות וזורקי supernatant. </li></ol></li></ol><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה- DNA כתם לניתוח תא מחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר גלולה ולהוסיף 20 μl של פתרון 7-AAD (0.25 מיקרוגרם). הערה: זה קריטי כדי להשתמש בכמות קבועה של 7-AAD / תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ מכתים. </li></ol></li></ol> 5. אוסף של cytometry זרימת נתונים הערה: המכונה הנדרשת יהיו תלוי במספר והאופי של fluorochromes בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הפרמטרים הבאים: FSC-, SSC-, FSC-H (FSC-W יכול לשמש במקום FSC-H) וקרינה 7-AAD בקנה מידה ליניארי. לאסוף את ערוץ APC בקנה מידת יומן. לאסוף כל ערוצים נוספים הנדרשים להערכת תוויות משטח או פנימי באמצעות סולם יומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע compensation של חופף אותות בספקטרום פליטה נצפה בין fluorochromes שונה לפני ניתוח הדגימות. הערה: רוב הזרימה cytometers יבצע זאת באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה. </li></ol> 6. ניתוח cytometry זרימת נתונים הערה: FlowJo שימש במחקר זה לזרימה גם cytometry יכול לשמש לניתוח נתונים, אך חבילות תוכנה אחרות. אסטרטגית gating מודגמת באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אוכלוסיית תאי קיימא באמצעות פרמטרים FSC-וSSC-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך אוכלוסייה זו לא לכלול כפילויות ואגרגטים באמצעות FSC-וFSC-H (FSC-W יכול לשמש גם כאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך אוכלוסייה זו נקבעה עלילת נקודה באמצעות 7-AAD על ציר x וBrdU-APC על ציר y. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1: gating אסטרטגיה שמאל הרשות הפלסטינית.Nel: תאי ungated מוצגים בFCS-מול SSC-עלילת נקודה. אוכלוסיית תאי קיימא מזוהה על ידי השער שמוצג. פנל מרכז: תאים מגודר מהלוח השמאלי מוצגים בFSC-מול עלילת נקודת FSC-H (FSC-W יכול לשמש במקום גובה). כפילויות ואגרגטים מזוהות, ולא נכללו בשער שמוצג. פנל ימני: תאים מגודר ממועד הרחקת כפיל בלוח המרכז מוצגים על 7-AAD לעומת APC-עלילת נקודה. נוגדן BrdU מסומן עם APC מאפשר זיהוי של תאים ששולבו במהלך BrdU תיוג הדופק. 7-AAD מספק מידע על תוכן DNA. השער העליון מגדיר תאים חיוביים לBrdU ולכן בשלב S בזמן דופק BrdU, השער השמאלי התחתון, התאים בG 0/1 והשער הימני התחתון אלה בG 2 / M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מחזור<html> nalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקובץ הראשון נתונים ושער על התאים בשער הדרת כפיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח אוכלוסייה זו להפצת מחזור התא (הממוקמת תחת פלטפורמות בתוכנה פלה-ג&#39;ו) ולהשתמש במודל הדיקן-ג&#39;ט-פוקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את העמדות של G 0/1 וG 2 / M פסגות באמצעות ליצור שערים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער בנושא תאים וחיוביים BrdU אוכלוסייה זו לאותו ניתוח מחזור התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק המשרות לG 0/1 וG 2 / M פסגות על ידי יישום אותו השערים משערים ליצור וקביעת מגבלות (באמצעות השערים שנוצרו) לעמדות של G 0/1 וG 2 / M פסגות. זו באה לידי ביטוי בלוחות 2 הראשונים של איור 2. הערה: גם תוכנות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את הנתונים וההוראות היו להשתנות בהתאם. </li></ol></li></ol>840 / &quot;width =&quot; 700 52840fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2:. התקדמות פנל תא המחזור הראשון (כל התאים) הוא מגודר באוכלוסיית התא שהוגדרה על ידי שער הדרת כפיל. אוכלוסייה זו הוצגה בהיסטוגרמה עם 7-AAD על ציר ה- X. השיא של שיא G 0/1 מצויינים על ידי החץ מתחת לציר. בלוחות הבאים תאים חיוביים BrdU כבר מגודר בכפי שמוצגים באיור 1. הערך לתפקיד 0/1 G מתקבל כאשר gating של שער הדרת כפיל מוחל על התאים מגודרות החיוביים BrdU בתוך תוכנת מחזור תא FlowJo. כל פנל שלאחר מכן היה מגודר באוכלוסייה החיובית BrdU כפי שמוצג באיור 1 ואת עמדתו של שיא 0/1 G מבוסס על הערך שהושג בניתוח האוכלוסייה כולה, כפי שמוצג בשני הלוחות הראשונים. שימוש בחלק השלילי BrdU לזהות את המיקום של אוכלוסיית G 0/1 לתאים החיוביים BrdU באותו SAMPle שולט על כל הבדלים קלים בעוצמה של כתם DNA בין דגימות. המספר המוצג בכל פנל מייצג את הזמן מאז דופק BrdU הסתיים. שלבי מחזור התא המחושבים מוצגים בירוק מוצלת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Banfalvi, G., Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Mol Biol. 761, 1-23 (2011).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression.">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li><li>Harper, J. W., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+ten+years+after.">The DNA damage response: ten years after.</a> Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).</li><li>Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+bromodeoxyuridine-substituted+cells+stained+with+33258+Hoechst.">Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).</li><li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine:+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication.">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218, 474-475 (1982).</li><li>Carayon, P., Bord, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-replicating+lymphocyte+subsets+using+a+new+method+to+label+the+bromo-deoxyuridine+incorporated+into+the+DNA.">Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA.</a> Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).</li><li>Gonchoroff, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase+detection+with+an+antibody+to+bromodeoxyuridine.+Role+of+DNase+pretreatment.">S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment.</a> Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).</li><li>Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cell+cycle+analysis+and+two-color+surface+immunofluorescence+using+7-amino-actinomycin+D+and+single+laser+excitation:+applications+to+study+of+cell+activation+and+the+cell+cycle+of+murine+Ly-1+B+cells.">Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).</li><li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD001+(everolimus)+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine.">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).</li><li>Hendzel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation.">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106, 348-360 (1997).</li><li>Draetta, G., Beach, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cdc2+protein+kinase+during+mitosis+in+human+cells:+cell+cycle-dependent+phosphorylation+and+subunit+rearrangement.">Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement.</a> Cell. 54, 17-26 (1988).</li><li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD001+(everolimus)+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine.">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microassay+for+lymphotoxin+using+microculture+plates+and+the+multiple+automated+sample+harvester.">An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester.</a> Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).</li><li>Beck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+kinetics+of+perturbed+cell+populations+determined+by+the+bromodeoxyuridine-33258+technique:+radiotoxic+effects+of+incorporated+[3H]thymidine.">Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine.</a> Cytometry. 2, 170-174 (1981).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+rates+of+DNA+synthesis+during+the+S+phase+of+log+phase+HeLa+S3,+WI-38,+and+2RA+cells.">Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).</li><li>Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+growth+fraction+in+cell+suspensions+by+flow+cytometry+using+the+monoclonal+antibody+Ki-67.">Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67.</a> Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).</li><li>Danova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-related+proteins:+a+flow+cytofluorometric+study+in+human+tumors.">Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors.</a> Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).</li><li>Juan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+expression+of+cyclins+A+and+B1+measured+in+individual+cells+during+their+progression+through+G2+and+mitosis.">Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis.</a> Cytometry. 32, 71-77 (1998).</li><li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation.">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).</li><li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+porcine+fetal+fibroblasts:+effects+of+serum+deprivation+and+reversible+cell+cycle+inhibitors.">Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors.</a> Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).</li><li>Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+nuclear+and+cytoplasmic+cell+cycle+progression+by+drugs+employed+in+cell+synchronization.">Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization.</a> Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

היכולת לנתח את מחזור התא היא חשובה להבנת ביולוגיה של סרטן ואת מנגנון פעולה של שתי התרופות וגנים המשפיעים על שגשוג תאים וצמיחה. אמנם יש מספר רב של מבחני שדיווחים למדוד התפשטות תאים, רוב לספק מידה המציינת את מספר התאים בהווה בלבד. אלה כוללים מבחני המודדים תא מספר על ידי ...

ההערכה של תכונות מחזור תא ושינויים המתרחשים בתאים במהלך התקדמות מחזור התא היא יסוד להבנת היבטים רבים של ביולוגיה, במיוחד ביולוגיה של הסרטן. יש סוכנים רבים בפיתוח לטיפול בגידולים ממאירים השפעות עמוקות על התקדמות מחזור תא או לגרום למוות של תאים באמצעות תלויים-מנגנוני מחזור התא. כדי ללמוד דינמיקת מחזור תא או תאים בשלב מסוים של מחזור התא, זה רגיל לסנכרן תאים. עם זאת שיטות סנכרון יכולות להיות השפעה מזיקה על התאים הנלמדים, שעלול להיות בלבול התוצאות שהתקבלו. 1 ניתוח לאחרונה את השימוש בחלבונים מתויגים fluorescently שנמצאים רק בשלבים מסוימים של מחזור התאים התיר להתקדמות מחזור התא בתאים בודדים לאורך זמן 2, לעומת זאת תאים להיחקר צורך לטפל גנטי כדי לבטא חלבונים מתויגים אלה, להגביל את השימוש שלהם למערכות שבן ניתן לקרוא את זההשיג ily. מחזור התא מורכב משני שלבים פעילים: שלב הסינתזה (S), שבו ה- DNA משוכפל ומיטוזה חלוקת תא שבו (M) מתקיימת. שלבים אלה מופרדים על ידי שלושה שלבי פער, G 0, 1 G ו- G 2. G 0 או קפאון, הוא שלב מנוחה שבו התא עזב את המחזור, 1 G הוא שבו תאי גידול בגודל לפני שכפול ה- DNA וG 2 שבו צמיחת תאים ממשיך בין השלמת שכפול הדנ&quot;א אבל לפני חלוקת תא. ההתקדמות דרך מחזור התא נשלטת על ידי מספר המחסומים. מחסום 1 G מופעל כאשר תנאי סביבה אינם תומכים של סינתזת DNA ומונעים כניסה לשלב S. מחסום שלב התוך-S או העיכוב יכול להיות מופעל על ידי נזק לדנ&quot;א שעלולה לגרום למזלגות שכפול נתקע. במהלך G 2 הנאמנות של ה- DNA המשוכפל הוא אישרה ואם הנזק הוא זוהה לאחר מכן G 2 </תת&gt; מחסום מופעל מתיר תיקון DNA לפני חלוקת התא. מחסום אחרון במיטוזה מבטיח כי chromatids כבר מיושר כהלכה בצלחת mitotic כך שחלוקת התא יכולה להסתיים בהצלחה. 3 הפעלה של מחסומים אלה משמשת בדרך כלל כדי לסנכרן אוכלוסיות תאים. יכולים להיות מופעלים על מחסומי מחזור תא על ידי מספר הגורמים, אך בביולוגיה של הסרטן הנפוץ ביותר היא גילוי של נזק לדנ&quot;א. תגובת הנזק ל- DNA היא ביוזמת telangiectasia כמו-PI3-kinase אטקסיה קינאזות וRad3 קשור (ATR) וtelangiectasia אטקסיה מוטציה (כספומט) המפעיל את קינאזות מפעיל במורד הזרם Chk1 וChk2, בהתאמה. 3 מגוון של אירועים מפעיל Chk1 לרבות נתקע מזלגות שכפול, crosslinks DNA, ונזקי קרינת האולטרה סגולות ואילו Chk2 מופעל בעיקר על ידי הפסקות גדיל פעמיים. השיטה הרגילה ללימוד ההשפעה של תנאים שהשתנו באורך של i מחזור התאים כדי לסנכרן את התאים בשלב מסוים של מחזור התא. 1 זה יכול להיות מושגים באמצעות מספר שיטות. תאים יכולים להיות פיזי מפרידים על בסיס גודל, צפיפות, פיזור צד (גרעיניות), וסמני ביטוי פני תא. יותר כמעט, תאים עשויים להיות מסונכרנים באמצעים כימיים. כמה סוכנים כגון תימידין, hydroxyurea וarabinoside ציטוזין יכולים לשמש כדי לעכב סינתזת DNA בשלב S של מחזור התא וכתוצאה מכך הצטברות של תאים בשלב S שימשיכו רכיבה על אופניים לאחר הסוכנים יוסרו. תאים שטופלו nocodazole, אשר מונע היווצרות של ציר mitotic, מעצר עם G 2 - תוכן DNA או M-שלב. ביעור סרום מהתוצאות בינוני התרבות בהצטברות של תאים בשלב G 0. מחדש התוספת של החומרים המזינים בסרום התרבות מחדש מתחילה רכיבה על אופניים הרגילים של התאים. עם זאת, כל שיטות סנכרון אלה מפריעים לרכיבה על אופניים וצמיחה נורמלים של תאים ויכולים Resulלא במוות של תאים משמעותיים. הסנכרון של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפים הוא מאתגר במיוחד ותאים אלה אינם ניתנים למניפולציה גנטית. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה של דינמיקת מחזור התא והמחקר של תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא ללא סנכרון מסורתי או שינוי גנטי. שיטה זו עשויה להיות שימושית גם עבור סוגי תאים אחרים שבם הנדסה גנטית ונהלי סנכרון מסורתיים אינן מושגות בקלות. השיטה מבוססת על השימוש הוותיק של bromodeoxyuridine התאגדות (BrdU), שבו יש השפעה קטנה מאוד על הצמיחה בטווח הקצר והתפשטות של תאים. 4 פרוטוקולי BrdU הוקם לנצל את השילוב של BrdU לתוך ה- DNA מסונתז חדש בשלב S . זה באופן קבוע מסמן תאים כמי שהיה בשלב S במהלך חשיפת BrdU. אוכלוסייה זו ניתן לזהות בנקודות זמן מאוחר יותר על ידי הצביעה לincorpor BrdUני ובכך לפעול כאוכלוסייה מסונכרנת שניתן בעקבות והעריך לאורך הזמן מאפשר המחקר של שפעות תרופה על מעבר מחזור התא. BrdU צריך להיות חשוף לפני מכתים נוגדן, בדרך כלל מושגת הבאה DNase או טיפול בחומצה. 6,7 באמצעות cytometry זרימה לזהות BrdU המשולב מאפשר ההכללה של סמנים נוספים. החשוב ביותר הוא השימוש בצבעים למדוד תוכן DNA, המאפשר ההערכה של הפצת שלב מחזור התא של התאים שהיו בשלב S בתחילת המחקר. יכולים להיות גם למדו 8 אנטיגנים משטח או תאיים יתר נוסף. 9 אלה עשוי להתייחס לאירועי מחזור התא כגון Ki67 או תכונות תא שאינה קשורה לכאורה כגון סמני אפופטוזיס כמו caspase-3 ביקע. היישומים הפוטנציאליים מוגבלים על ידי הדמיון של החוקר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC BrdU Flow Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552598</td>
			<td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm 
			Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561651</td>
			<td>Referred to as Permeabilization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/Wash Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Referred to as Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Stain Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FORTESSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P2, P20, P100, P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>FisherBiotec</td>
			<td>FBS-7100113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon TC 150cm2 vented Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 25mL</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 200&#181;L</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aersol Pipettes 1mL</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Spintron</td>
			<td>GT-175R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>C 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9708S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>2197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td><a name="RANGE!C23">2348S</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NALM6&#160;</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי להשיג מגוון רחב של מידע. כמה יישומים המפורטות כאן. הערכה של משך מחזור התא כדי לקבוע את הזמן דרוש לתאים למעבר דרך מחזור התא, תאים נקצרים בנקודות זמן שונות הבאות דופ?...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization at JoVE.com

מעקב זמני אחר התקדמות מחזור התא באמצעות ציטומטריית זרימה ללא צורך בסנכרון | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

temporal-tracking-cell-cycle-progression-using-flow-cytometry-without

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Cellular Processes

Cell Cycle and Division

SCIENTISTS IN ACTION

19.0K Views.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney.  פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר. 

Video: Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

סנכרון של<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; לחקירה של מחזור תא החיידק

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...