עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לטיפולי משובים, פקולטה לרפואה של TU דרזדן, וDFG השיתופי מרכז המחקר SFB655 (A20 subproject). התואר ראשון נתמך על ידי מלגה של תכנית חפירות-BB, דרזדן. אנו מודים לבני זוג. נוריקו Osumi, טאדאשי נומורה, שקר Chichung דיטר, וראבי Jagasia עצה יקרה בהקמה ברחם electroporation והזרקה נגיפית stereotaxic.

צליל מקדים ניתוח חייב להתבצע על ידי חוקרים באופן מלא מאומנים עם אישור מהרשויות המקומיות לרווחת בעלי חיים. כל אמצעי הזהירות יש לנקוט כדי למזער את הכאב ולחץ שנגרם לבעל חיים הכולל הרדמה עמוקה, ממשל של שיכוך כאבים לאחר ניתוח, ועל פעולות שנמשכות יותר מ 10 דקות, יישום של חומר סיכת עין כדי למנוע התייבשות ועיוורון של קרנית. עכברים מורדמים חייבים להישמר כל זמן חם על 37 מעלות צלזיוס עד להחלמה מלאה וכל כלי ניתוח ופתרון צריכה להיות סטרילי. למרות שהשימוש במכסת מנוע ביולוגית הוא לא הכרחי, המפעיל חייב לנקוט את כל האמצעים הסבירים כדי למזער את האפשרות של הדבקת בעלי החיים במהלך המבצע על ידי לבוש בחלוק מעבדה, מסכה, וכפפות. בדומה לכך, כל צעד הנוגע לדור ושימוש בוירוסים חייב להיות מורשה וחייב להתבצע באזורי S2 על פי ההתקנות של הרשויות המקומיות.לבסוף, טיהור יסודית של כל הכלים והמשטחים שהיו יכול להיות במגע עם וירוסים חייבת להתבצע על פי נהלי חיטוי מתקן מאושר (ל-HIV על ידי ניגוב עם 70% ET-OH ו / או מעוקרים). חלק 1: הרחבה העוברית המל&quot;ל 1. ברחם electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שיבוט הגנים המושתלים (כלומר cdk4/cyclinD1) בpCMS-EGFP (Clontech) או וקטורי pDSV-mRFPnls 16, לטהר את פלסמידים באמצעות EndoFree הערכה וresuspend ב PBS סטרילי לריכוז של 3-5 מיקרוגרם / μl. בקרוב לפני הניתוח, לערבב את פלסמידים עם 0.05% FastGreen ב PBS ביחס סופי של CA. 04:04:01 וחובצה את התערובת במשך 2 דקות ב16000 XG כדי להסיר את כל משקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת דנ&quot;א לכוס ורוסיליקט משכה בעבר נימים. פרמטרים מושכים באמצעות P-97 פיפטה חולץ הם: משיכה: 200; vel: 140; זמן: 140. חום ניתן על ידי בדיקת רמפה ותלוי במפרטהרבה ific של נימי דם בשימוש. הר הנימים בנחיר של PicoPump כי הוא קרוב לפלטפורמת electroporation רחם (איור 1 א), ותחת stereomicroscope, לכופף קצו וכינויו בנקודת הפיתול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל כלי הניתוח במעקר חרוז זכוכית יבשה ועמוק להרדים עכבר בהריון ביום 12-15 להריון באמצעות מכשיר אידוי isoflurane. הנח את החיה במצב שכיבה על פלטפורמת חימום נקבע על 37 מעלות צלזיוס ולשמור תחת ממשל isoflurane קבוע באמצעות חרטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את העור של הבטן, לחטא עם מספר רבות של פעמי Betaisodona, סופו של דבר בניגוב בין עם אתנול 70%, ולהזריק עצירות (בדילול ב PBS) תת עורי ברמה של 0.1 מ&quot;ג / קילו ריכוז כמשכך כאבים מקדימים. בעזרת מספריים עדינים, לעשות חתך 2 סנטימטר אורך של העור, ולאחר מכן, של הדופן השרירי הבסיסי לגשת לחלל הצפק. לוותר בca חלל הצפק. 2מ&quot;ל של IUE פתרון (D-PBS המכיל 100 U / מ&quot;ל ​​של עט / סטרפטוקוקוס) prewarmed על 37 המעלות צלזיוס ולשמור על הפתרון בבלוק חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את העכבר עם drap סטרילי המכיל סדק שממנו יוסרו הרחמים. לחזור בו החתך באמצעות מפשק טונגסטן, לזהות את הרחם ולשלוף אותו מחזיק אותו עם מלקחיים בין עוברים סמוכים (האיור 1B; שמאל) ולבסוף מניח אותו על drap סטרילי. במהלך כל המבצע, יש לשטוף את הרחם עם פתרון IUE ללחות חלל איבר ואת הגוף ולמנוע התייבשות של בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפל ברחם מחזיק אותו בזהירות בין אגודל ואצבע מורה ולהפוך עובר אחד עד שהראש שלו גלוי ומכוון למפעיל. זהה את ההמיספרות telencephalic ולהזריק אחד מהם מהצד dorso הצדדי. שחרר 1-2 μl של פתרון ה-DNA באמצעות footswitch של PicoPump עד החלל מתואר על ידי FastGreen (התרשים 1B; ימין). </li><li&gt; מקום האנודה של אלקטרודות באתר ההזרקה והקתודה בצד הנגדי (התרשים 1C) ולספק 6 פולסים של 30 V עבור 50 מילים עם מרווח 950 מילישניות בין דופק בכל שימוש electroporator יצירת שדות חשמליים מרובעים פעלה דרך footswitch. הימנע מלהניח את האלקטרודות קרובה לשליה כזה עלול לגרום דימום וניזק לעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל העוברים מוזרקים וelectroporated, הנח את הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן ולסגור את הקירות השריריים עם מחרוזת תפר תפירה כל מ&quot;מ 3-4. את הקשרים צריכים להיות הדוקים לשריר אבל לא חזק מדי כדי לאפשר לנפיחות קטנות של הרקמה. לבסוף, לסגור את העור שמעליה באמצעות קטעי מתכת. לחטא את העור עם Betaisodona, הסר את העכבר ממסיכת isoflurane ולהעביר אותו בכלוב דיור כאשר ער לחלוטין. לפקח על ההתאוששות של העכבר, עד שההתנהגות של תנועה היא נורמלית. </li></ol> 2. עיבוד של סםple <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד או יותר ימים לאחר electroporation, להקריב את העכבר, לאסוף את העוברים ולזהות את אלה electroporated כראוי באמצעות stereomicroscope ניאון (1D איור). לנתח את מוחם על PBS קר כקרח, ולתקן אותם בלילה ב4% PFA (paraformaldehyde בחומציות חיץ פוספט 7.4). סופו של דבר, BrdU יכול להינתן לפני ההקרבה פי פרדיגמות שונות כדי לחקור קינטיקה מחזור התא וחלוקה של תאי 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוחין אז מעובדים לתבתרו וimmunostaining לכמה סמנים של גליה רדיאלי, את האבות ונוירונים (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 וכו &#39;) basal כדי להעריך את השפעתם של הגנים המושתלים התפקודיים במל&quot;ל הממוקדת וצאצאיהם שהם זוהה על ידי הביטוי של גן כתב השיתוף electroporated. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1.בelectroporation הרחם. () ייצוג סכמטי של בפלטפורמת electroporation רחם. (ב) רישומים המראים את המיקום של העכבר להריון במהלך הניתוח (מימין) והזרקה של DNA / FastGreen התערובת (כחול) בחצי כדור telencephalic של עובר עכבר (משמאל). (ג) תכנית המראה את המיקום של אלקטרודות במגע עם קירות הרחם עם האנודה (+) סמוך לאתר של הזרקה (כחול). חיצים מעידים על ההגירה של ה-DNA לאנודה. (ד) תמונה של 24 שעות לאחר electroporation עבר עכבר עם פלסמידים GFP ביום עוברי 13. קו מקווקו תוחם את אונת telencephalic. תכנית בשונה מCalegari et al., 2004 17. חלק 2: הרחבת המבוגרים המל&quot;ל 1. ייצור של HIV נגזרת חלקיקים נגיפיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: צלחת 5 X 10 6 תאים 293T על 10 סנטימטריםצלחת עם 8 מ&quot;ל של D-MEM המכיל 10% של סרום עוברי מומת חום שור ו100 U / מ&quot;ל ​​של עט / סטרפטוקוקוס (תרבות בינונית). השתמש 15 מנות להכנה ותרבות הלילה נגיפית 1 על 37 המעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: לכל מנה, לדלל ב1 מ&quot;ל של 5 מיקרוגרם הרגיל D-MEM של כל אחד מ3 פלסמידים קידוד עבור i) חלבון VSVG (סוג הווירוס stomatitis שלפוחי G) מעטפה, ii) איסור פרסום / pol (אנטיגן / פולימראז ספציפי קבוצה) , וג) polycistronic לבנות להביע את transgenes הפונקציונלי וכתב (כלומר cdk4/cyclinD1/GFP) המשובט בעבר בוקטור העברת איידס מבוסס (p6NST90) 9. מערבב את הפתרון הזה עם 1 מ&quot;ל של D-MEM המכיל 45 μl של polyethylenimine כי כבר פזר מראש ב PBS ב1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות, ודגירה במשך 15-30 דקות בטמפרטורת חדר. בינתיים, להסיר את המדיה מהתאים ולהוסיף 4 מ&quot;ל למנה של טרי D-MEM המכילה 15% בסרום שור עובר מומת חום ו100 U / מ&quot;ל ​​של עט / סטרפטוקוקוס. הוסף 2 מ &#39;מערבל תערובת transfection ולילה התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: להוסיף 120 μl של 500 מ&quot;מ Na-וטיראט לצלחת כדי לשפר את הביטוי של הגנים המושתלים, מערבב בעדינות והתרבות במשך 6-8 שעות לאחר שיחליף את מדיום transfection עם 5 מ&quot;ל של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4: לאסוף את supernatants (70 מ&quot;ל סה&quot;כ בקירוב), לעבור דרך מסנן 0.22 מיקרומטר והעברה ב2 צינורות צנטריפוגות polyallomer (35 x 89 מ&quot;מ). Ultracentrifuge ב110.000 XG עבור 90 דקות ב 4 ° C באמצעות הרוטור נדנדה. בטל supernatant, להוסיף 6 מ&quot;ל של PBS לכל צינור ולדגור על קרח למשך שעה 1. Resuspend הגלולה ולהעביר אותו בצינור צנטריפוגה polyallomer 1 (14 מ&quot;מ x 95). Ultracentrifuge ב110.000 XG עבור 90 דקות ב 4 ° C באמצעות הרוטור נדנדה. בטל supernatant, resuspend גלול ב 50 μl של PBS, להפוך 5 aliquots וחנויות μl ב -80 ° C. כייל נגיפי יהיה בטווח של 10 8 -10 9 CFU / מ&quot;ל. (הערה: וירוסים רגישים מאוד לטמפרטורה והאחסון, AVOid מחדש הקפאה, לשמור על קרח יבש במהלך ההובלה ולהפשיר מהר לפני השימוש.) </li></ol> 2. הזרקת Stereotaxic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר 6-10 שבועות ישן עם isoflurane ולמקם את החיה בתנוחת שכיבה על מסגרת stereotaxic (איור 2 א) שימוש בברי האוזניים ותמיכת החיך לתקן את הראש כמו שצריך. החיה נשמרה חם על כרית חימום נקבע על 37 מעלות צלזיוס ותחת ממשל isoflurane קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 100 μl של פתרון עובד עצירות כמשכך כאבים מנע תת עורי, להתגלח פס של עור על ראשו של העכבר, וכפי שמתואר בdesinfect 1.4. באמצעות אזמל, להפוך את CA. 1.5 סנטימטרי חתך אורכים ארוכים על עור הראש וחושף את הגולגולת ברמה של תפר sagittal. לחזור בו את העור בעדינות ולנקות את משטח העצם עם מקלון צמר גפן סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חצי למלא כוס נימים (מפרט ב1.2) עם שמן פרפין ולעלות אותו על משאבת הזרקת החדרההנימים עד הטבעת השנייה (איור 2 ב &#39;). הזז את הבעל בנימי X, Y ו Z הציר עד קצה הנימים ממוקם על גבחת, נקודת חיבור בין תפרי sagittal והרוחביים (האיור 2C) (שייקבע בסיוע stereomicroscope), ו להגדיר מחדש את x, y, z וערכים ל 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הנימים ידי ± 1.6 מ&quot;מ בציר Medio-הרוחב (x) ו-1.9 מ&quot;מ בציר קדמי, האחורי (Y) ולסמן את העצם באמצעות עט סימון כירורגית. לעשות חור של CA. 0.5 קוטר מ&quot;מ בגולגולת באמצעות קודח חשמלי לשים לב שלא לפגוע במוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפת 5 μl של השעיה נגיפית (aliquot 1) על פיסת parafilm הונחה על סורגי האוזן ותשקיע את הקצה של הנימים בטיפה. תמצוץ CA. 3.5 μl של השעית ויראלי באמצעות מזרק nanoliter להגדיר ב 55 nl / sec. ביצוע שלב זה במהירות כמו האגל יתאדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הנימים לאתר oהזרקת F ולהזיז אותו כלפי מטה עד הקצה נוגע במשטח pial. אפס את ערך ציר dorso-הגחון (z) 0. בשלב זה, לחדור לרקמות עם הנימים ל-1.9 מ&quot;מ ולשחרר 1.5 μl של השעיה נגיפית בשיעור של 4 nl / sec. חכה 2-3 דקות כדי למזער את הזרימה החוזרת של שוקת השעיה נגיפית מסלול הנימים וחוזרים בו נימים. זריקה שנייה ניתנת לביצוע בחץ כדור controlateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את העור, לחטא, ולאפשר החיה להתאושש מהרדמה כפי שתואר בעבר עבור ברחם electroporation (1.8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הזרקה נגיפית Stereotaxic. (A ו-B) ייצוג סכמטי של המרכיבים הדרושים לביצוע הזרקת stereotaxic () ובעל נימים מפורקות מראה את הכניסה של capillary עד הטבעת השנייה (B). (ג) תמונה של ראש העכבר המשותק על ידי ברי האוזן ותמיכת חיך עם העור נחתכה כדי לחשוף את הגולגולת (משמאל). הגדלה של התיבה המקווקות (מימין) מציגה את התפרים הרוחביים וsagittal, גבחת, והאתר של הזרקה (המעגל). 3. עיבוד של המדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת לשלושה שבועות לאחר ההדבקה, תנקב את העכבר עם CA. 100 מ&quot;ל של 4% PFA, לנתח את המוח ולפרסם-לתקן את זה בלילה ב4% PFA. סופו של דבר, BrdU ו / או טמוקסיפן יכול להינתן לפני ההקרבה פי פרדיגמות שונות כדי לחקור קינטיקה מחזור התא ולהפסיק את הביטוי של הגנים המושתלים הנגיפיים המוקפים אתרי loxP, בהתאמה 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח אז יכול להיות מעובד לimmunostaining באמצעות מספר סמנים של גזע ותאים ונוירונים (למשל Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin, וכו &#39;) את האבות. </li></ol>

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

התואר ראשון וFC הגישו בקשה לרישום פטנט המתאר את ההתרחבות מותנה של תאי גזע הסומטיים במבוגרי cdk4/cyclinD1 וירוסים (EP 10160288.6).

צעד קריטי לרחם electroporation הוא האיכות והטוהר של ה-DNA מאז ההגירה כיוונית במהלך הלידה של השדות החשמליים תלויה במטען שלה. פרוטוקולים לטיהור DNA שאינו כוללים הסרה של מולקולות טעונות נוספות, כגון endotoxins, עלולים להוביל למיסוך של המטענים השליליים DNA הטבעיים המובילים לאספקה ​​לקויה. ברור, לגעת בקירות הרחם עם האלקטרודות הקרובה ככל האפשר לאזור על מנת להיות ממוקד ישפר את יעילות electroporation. לא פחות חשוב היא האיכות של אלקטרודות המשמשות מאז הזה הוא יסוד לאספקה ​​של שדות חשמליים אופטימליים. מייקרו סריטות אפילו לא נראים לעין בעין ו / או שאריות אורגניות, כגון עקבות של סרום, שומנים, וכן הלאה, באופן בלתי נמנעות מצטברות לאורך זמן מובילה לאלקטרודות לאבד את הנכסים שלהם. electropes הישן ו / או מלוכלך היא הסיבה הסבירה ביותר של ירידה פתאומית ביעילות electroporation, ולכן, צריך להיות replaced בהקדם זה הוא שם לב. אמנם פשוט יחסית, ברחם electroporation מחייב בדרך כלל כמה שבועות של אימונים על מנת להשיג תוצאות משביעות רצון ולשעתק. טכניקה זו היא מאוד תכליתית שכן הוא יכול להיות מיושם, כמעט, לכל איבר ורקמה של העובר המתפתח. אין ספק, איברים המכילים חלל, כגון מוח, במיוחד קלים למקד ולאפשר לשיעור גבוה של תאי transfected בשל ההקלות של הזרקת נפח גדול יחסית של ה-DNA. בעיה נפוצה נתקלה בהקמת הזרקה נגיפית stereotaxic היא שיש כמה תאים נגועים ו / או להתמקד באזורים לא רצויים. הבעיה הראשונה קשורה בעיקר עם ההזרקה של נגיפי כייל נמוך. תאי 293T עם מספר נמוך יותר של מעברים בתרבות לצמוח מהר יותר ולהוביל לtiters הנגיפי הגבוה יותר. שימוש בתאים מבוגרים יותר CA. 20 קטעים אינם מומלצים ואמצעי transfection עם יעילות% פחות מ 80 לא יבטיח טובייצור נגיפי. Resuspension של גלולת ויראלי הוא גם קריטי, ההשעיה הנגיפית יש להופיע גושים הומוגניים ויראלית שיכול לחסום את הנימים צריכות להימנע. וירוסים רגישים מאוד לטמפרטורה יורדת ואחסון לטווח ארוך. מסיבה זו, aliquots צריך להיות מאוחסן באופן קבוע ב-80 מעלות צלזיוס, ולא יכול להיות refrozen. גם בתנאים אלה, ירידה בinfectivity יכולה להיבחן לאחר 6-12 חודשים של אחסון. בשלבי הלמידה, אנו ממליצים לבדוק את כייל הנגיף של כל הכנה נגיפית ולעשות אותו שוב לאחר אחסון ארוך טווח. הנוכחות של תאים נגועים באזורים לא רצויים של המוח יכולה להיות תלויה במיקום אופטימלי של ראש העכבר על מסגרת stereotaxic, שדורשת קצת תרגול. בנוסף, חשוב שלא לפגוע בשטח של המוח בעת פתיחת החור בגולגולת כי אחר זה לא יהיה אפשרי לאפס 0 כראוי על פני שטח pial, וכתוצאה מההזרקה לא מדויקת. הקואורדינטותשנקבענו בפרוטוקול זה נקרא C57/BL6 6-10 שבועות נקבות זקנות ומומלץ לבצע אופטימיזציה שלהם למתח / גיל / מין שונה. רכישה של טכניקה זו עשויה לדרוש זמן רב יותר מאשר ברחם electroporation בשל השלבים הארוכים יותר הדרושים כדי להכין את הווירוסים ולנתח את הדגימות. אנו ממליצים בחום שוירוסים נמצאים בשימוש רק לאחר ניתוח עכבר והזרקת stereotaxic הפכו אמין לשחזור. הצעד הראשון להשגת מטרה זו הוא להזריק צבעי התא permeant DNA, כגון Hoechst 33342, בעכברים מורדמים ולנתח את מוחם באופן מיידי. בelectroporation הרחם והזרקה נגיפית stereotaxic שתי מערכות חשובות לחריפות ורקמות ספציפיות לתפעל ביטוי גנים בתוך מערכת העצבים המרכזיים בפיתוח ובבגרות של יונקים. למרות מגבלתם במיקוד רק תת אוכלוסיות של תאים, מערכות אלו מספקות מהירות חסרות תקדים וקל בהשוואה לשיטות קונבנציונליות יותר, אניn בפרט דור הרב המפרך וזמן של עכברים הטרנסגניים. עם זאת, למרות דמיון זה, כמה הבדלים קיימים בין שתי טכניקות שראויות לאזכור. ראשית, בכל קשורים למיקוד של תאים מסוגים שונים, ברחם electroporation תחילה מוביל לtransfection של תאי גזע תקינים (הנקרא גם תאי גלייה רדיאלי), כי אלה הם התאים היחידים התוחמים את החדר שבו את ה-DNA מוזרק. כתוצאה של חלוקות, פלסמידים יהיו לאחר מכן לעבור בתורשה מאם, תאי גזע ממוקד למולידם ו / או תאי בת עצביות שהובילו לחלוקה מחדש של תאי transfected לאורך הקליפה כפונקציה של זמן. בניגוד לכך, השימוש בlentiviruses HIV במוח הבוגר מוביל לזיהום סימולטני של כל סוג תא כוללים תאי גזע, את אבות, הנוירונים כמו גם תאי גלייה בוגרים. מן ראוי לציין כי בכל קשור לשימוש בlentiviruses HIV בניגוד לרטרווירוסים נפוצים ביותר היא העובדהכי שילוב lentiviral יתרחש באופן עצמאי מהמדינה המיטוטי של תאים, ובכך מאפשר גם המיקוד של בוגרי תאים רדומים גזע. שנית, עוד הבדל חשוב בין electroporation ודלקת הנגיפית הוא שביטוי חולף, episomal מושג על ידי לשעבר בניגוד לשילוב בלתי ההפיך של ה-DNA בגנום של תאים נגועים הושגו על ידו. כתוצאה מחטיבות רצופות סלולריים, דילול של פלסמידים electroporated, והשפלה של cyclinD1 החלבון מחוץ לרחם, הייתי להתחולל בכל מחזור תא. לפיכך, הרחבת המל&quot;ל במהלך התפתחות עוברית הוצגה רק לאחרונה במשך כשני ימים אחרונים 15 ואילו במוח הבוגר השפעה זו נמצאה נמשכת כמה חודשים (תוצאות לא פורסמו). שלישית, מאז ש) cdk4/cyclinD1 יש השפעה חזקה על תאים עם G1 ועוד ii) אבות עצביים שבוצעו במהלך פיתוח יש עוד מחזור תאמתאי גזע ואילו ההפך נכון בבגרות, שתי המניפולציות נמצאו כדי לעורר את ההתפשטות, בעיקר, מאבות עצביים במהלך פיתוח תאי גזע ותקופת הבגרות. בכל מקרה עלייה בנוירונים הושגה על ידי שתי השיטות. הזריקה רביעית, נגיפית קלות ניתן לבצע באופן אמין וreproducibly, באזורים שונים של המוח הבוגר, פשוט על ידי שינוי קואורדינטות stereotaxic. לעומת זאת, מיקוד מדויק של אזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית, כגון גזע מוח, היווצרות היפוקמפוס, או בחוט שדרה, על ידי בelectroporation הרחם עלול להיות קשה יותר להשגת reproducibly. יתר על כן, בעוד שניתן לבצע הזרקת stereotaxic בעכברים בכל גיל, ביצועים אופטימליים של electroporation ברחם הנו מוגבלים מעל E11 לE16. שלבים שקדם לE11 יחייבו גם השימוש במיקרוסקופ backscatter אולטרסאונד 18,19 או פולחן עובר שלםמערכת יור 17,20. לאחרונה, עניין גובר בביולוגיה של תא בסיסית של תאי גזע סומטיים כבר קדם כי המחקר והמניפולציה שלהם נחשבים למהותיים לקראת פיתוח טיפולי התחדשות מבוססי תאים חדשים. במיוחד לביטוי יתר של cdk4/cyclinD1, הפרוטוקול שלנו מספק את האמצעים להגברת transitorily הרחבת המל&quot;ל בvivo (האיור 3B ו-C ו4B ו-C) על מנת להגדיל את מספר תאי עצב שנוצרים במוח הבוגר. אנו מאמינים כי מניפולציה אלה עשויות להיות חשובה בכמה הקשרים שונים כדי להבין טוב יותר את תפקידו של המל&quot;ל במוח התפתחות, אבולוציה והומאוסטזיס כמו גם תרומתם לפונקציה או התאוששות מניוון או פגיעה עצבי הקוגניטיבית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר / ציוד </td><td> ספק </td><td> קטלוג # </td><td></td></tr><tr><td> ערכת פלסמיד maxi Endofree </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> סיגמא </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / בראון פיפטה חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ורוסיליקט נימים עם נימה </td><td> סאטר מכשירים </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת בראש טבלת מעבדת חית הרדמה </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> בקסטר </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 חרוז זכוכית המעקר </td><td> SouthPointe כירורגים </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> איריס מלקחיים </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון Betaisodona </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> משאבת פיק </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> electroporator הגל ECM 830 כיכר </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודות פינצטה עגולות </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> חומר תפר </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> רפלקסקליפ applier לסגירת פצעים </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון ההזרקה Temgesic </td><td> תסקס פארמה AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax- </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי בובין סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת תרבית רקמה </td><td> בז </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimine 250 מ&quot;ל </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> חומצת n-וטירית, מלח נתרן </td><td> סיגמא </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> צינור, thinwall, polyallomer </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> מכשיר הדגם 900 חיות קטן stereotaxic </td><td> קופף מכשירים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ pico OPMI </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 בקר וNanoliter2000 מזרק </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> החלפת הזכוכית 3.5 nanoliter </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> יישום SR תרגיל כללי </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td><strong&gt; נוגדן </td><td> ספק </td><td> קטלוג # </td><td> מהילה </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> שולחן של נוגדנים. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

תאי גזע הסומטיים יכולים לחלק להפקת תאי גזע נוספים (רחבה) או סוגי תאים מובחנים יותר (בידול), שהוא יסוד להיווצרות רקמות במהלך התפתחות עוברית והומאוסטזיס רקמות במהלך 1 בגרות. נכון לעכשיו, מאמצים רבים מושקעים לקראת שליטה על המתג של תאי גזע סומטיים מהתרחבות לבידול, כי זה נחשב למהותי לפיתוח אסטרטגיות חדשות ל1,2 הרפואה רגנרטיבית. עם זאת, אתגר גדול במחקר והשימוש בתאי גזע סומטיים הוא שההתרחבות שלהם הוכחה מאוד קשה לשליטה. כאן אנו מתארים מערכת המאפשרת שליטה בתאי גזע עצביים / מולידו (המכונה לגמרי כלמל&quot;ל) התרחבות בעכבר העוברי הקליפה או היפוקמפוס המבוגר על ידי המניפולציה של הביטוי של cdk4/cyclinD1 המורכב, וסת עיקרי של שלב G1 של מחזור תא סומטי ותאי גזע ההבדלerentiation 3,4. באופן ספציפי, שתי גישות שונות שתוארו על ידי המורכב cdk4/cyclinD1 הוא overexpressed בהמל&quot;ל בגוף חי. לפי הגישה הראשונה, ביטוי יתר של רגולטורי מחזור התא מתקבל על ידי הזרקת פלסמידים קידוד לcdk4/cyclinD1 בחלל telencephalon העכבר ואחריו ברחם electroporation כדי לספק אותם למועצה לביטחון לאומי של הקליפה לרוחב, ובכך, מפעילים ביטוי של episomal transgenes 5-8. לפי הגישה השנייה, וירוסי HIV-derived מרוכזים מאוד מוזרקים stereotaxically ברכס המשונן של ההיפוקמפוס העכבר הבוגר, ובכך, מפעילים ביטוי מכונן של רגולטורי מחזור התא לאחר שילוב של המבנה הנגיפי בגנום של תאים נגועים 9. שני גישות, שהעקרונות בסיסיים כבר תוארו על ידי פרוטוקולי וידאו אחרים 10-14, היו כאן אופטימיזציה לט) להפחית ניזק לרקמות, ב) חלקים רחבים היעד של המוח Regio מאוד ספציפיns, ג) להשיג מספרים גבוהים של תאי מניפולציות בכל אזור, וiv) לעורר רמות ביטוי גבוהה של הגנים המושתלים בתוך כל תא. ביטוי יתר זמני בtransgenes באמצעות שתי הגישות מתקבל על ידי אמצעים שונים כלומר בדילול טבעי של פלסמידים electroporated בשל חלוקת תא או טמוקסיפן ממשל בCre-לבטא המל&quot;ל נגוע בוירוסים שנשאו cdk4/cyclinD1 מוקפים אתרי loxP, בהתאמה 9,15 . שיטות אלו מספקות פלטפורמה חזקה מאוד בחריפות ורקמות במיוחד כדי לתפעל את הביטוי של כל גן במוח העכבר. בפרט, על ידי המניפולציה של הביטוי של cdk4/cyclinD1 המורכב, המערכת שלנו מאפשרת שליטה הזמנית של התרחבות המל&quot;ל ומתגם לבידול, ובכך, סופו של דבר להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח של היונקים. הגישה שלנו עשויה להיות חשיבות מכרעת למחקר בסיסי ושימוש בתאי גזע הסומטיים לטיפולשל מערכת העצבים המרכזית של היונקים, תוך מתן הבנה טובה יותר שלי) נובע תרומת תא ליצירת רקמה במהלך הפיתוח, ii) הומאוסטזיס רקמות במהלך הבגרות, ג) תפקיד של neurogenesis מבוגר בתפקודים קוגניטיביים, ואולי, ד) הטוב יותר באמצעות סומטי גזע תאים במודלים של מחלות ניווניות.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסך הכל, ברחם electroporation מניב 60-80% מעוברי electroporated מציגים ביטוי חזק של גן הכתב באזור רחב של הקליפה לרוחב (איור 3 א). חלבוני ניאון ניתן לאתר בקלות בעוברי הר שלמים בהקדם 3-6 שעות לאחר ניתוח עם האות שנמשך יותר משבוע אחד. בתוך אזור המיקוד, על 30-50% מתאים בדרך כלל להביע transgene (הים) בשיעור של תאים מבטאים שיתוף ושתיים (או יותר) transgenes השיתוף electroporated להיות בדרך כלל מעל 90% (איור 3B, משמאל) 6,8 , בן 15. בעוד רמה מינימאלית של אפופטוזיס (2.0-2.5% בקירוב) יכולה להיות שנצפתה לאחר כ 2 שעות מelectroporation, ערך זה יהיה לחזור לרמות פיסיולוגיות (0.5-1.0% בקירוב) אחרי בערך 6 שעות (FC, נתונים שלא פורסמו). שיעור עוברים או עכברים הרה למות עקב הניתוח הוא בדרך כלל זניח (&lt;5%). שיתוף עם electroporation cdk4/cyclinD1 בתנאים אלה ואחרי 48 שעות של פיתוח גורמת לעלייה בהתרחבות של אב עצבי על ידי 30% (איור 3B, מימין, ו-C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הרחבת אבות עצביים על ידי cdk4/cyclinD1 ביטוי יתר. () תמונת קרינה של סעיף דרך הקליפה הרוחבית של עובר עכבר 24 שעות לאחר electroporation עם פלסמידים GFP וRFP ביום עוברי 13. (ב) תמונות פלורסנט כמו ב48 שעות לאחר electroporation שיתוף עם פלסמידים וimmunolabeling cdk4/GFP וcyclinD1/RFP עבור סמן מוליד הבזליים Tbr2. כתבי ניאון עם DAPI counterstainig (משמאל) וTbr2 (מימין) מוצגים. קווים מציינים משטח הפסגה של אזור חדרית (VZ; קו לבן) ואת גבולות אזור subventricular (SVZ; קווים מקווקווים צהובים). שים לב המוגבר thickness של SVZ בחלק electroporated של קליפת המוח (ראשי חץ לבנים) בשל דור ורחבה של אבות הבזליים לאחר ביטוי יתר של cdk4/cyclinD1 גדל. (ג) כימות ההשפעה שמוצגות בארים ב = SD, p &lt;0.05, n = 3. גרף עמודות ב-C נלקח מנגה et al., 2009 15. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה נגיפית stereotaxic, CA. 80% מעכברים שפעלו להציג ביטוי חזק של transgenes לאורך הרכס המשונן כולו. ביטוי מכונן של GFP ניתן לאתר בקלות על 40 סעיפי מיקרומטר ההקדם 4 ימים לאחר ניתוח. לאורך הציר מקורי לזנב של gyrus המשוננת, על 10-30% מתאים (שווה ערך לסך של CA. 10,000-30,000 תאים) בדרך כלל להביע transgene (הים) (איור 4 א) 9. חלקם של עכברים מתים עקב הניתוח הוא זניח (&lt;5%). ביטוי יתר של שלושה שבועות cdk4/cyclinD1 בתנאים אלה מעורר עלייה במל&quot;ל על ידי מעל שתיקפלים (איור 4B) תוך הפחתת neurogenesis ידי 70% (האיור 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. השפעות של זיהום ויראלי. () שיקום 3D של 7 תמונות שנלקחו מקרינת 40 מיקרומטר קטעי עטרה סידוריים עבים (איסוף 1 כל 6) לאורך הציר מקורי לזנב של ההיפוקמפוס. ה-GFP + תאים נגועים (ירוק) וצביעת DAPI גרעינית (כחול) של gyrus המשוננת מוצגים (למעלה). תמונות שדה בהירות של החטיבות המקבילות לאלו המוצגים ב( באמצע) וייצוג 3D (תחתון) של אונת המוח השלמה עם ההיפוקמפוס מודגש בירוק pseudocolor (שונים ממוח אלן האטלס; עטרת <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org)</a> . חצים לבנים להצביע במקום הזרקה. רוחב (L), מקורי (R), ודורצירי סאל (ד) (x, y, z וstereotaxic קואורדינטות) המסומן (מימין). פרופורציה (B ו-C) של nestin + המל&quot;ל (B) וDCX + נוירונים יילוד (C) בתוך האוכלוסייה של ה-GFP + תאים נגועים 3 שבועות לאחר הזרקת stereotaxic של ה-GFP (לבן) או cdk4/cyclinD1/GFP וירוסים (שחור). ברים = SD, p &lt;0.005, n = 3. גרפים בB ו-C שנלקחו מArtegiani et al., 2011.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.6K Views.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

Video: Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...