המחברים מבקשים להודות תמיכה מחקר סרטן מכון סרטן פורום פרס סמואל Oschin המקיף, כמו גם כספים מהמוסד לרפואת רגנרטיבית של Cedars-Sinai, ומשפחת גרן. הפרויקט המתואר נתמכה בצורה של Core שובר CTSI מומן על ידי המרכז הלאומי לחקר משאבים, גרנט UL1RR033176, והיום הוא במרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, גרנט UL1TR000124. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIH.

הליך זה בהתאם לדרישות Cedars-Sinai IACUC. חוקרים צריכים להבטיח עמידת IACUC מוסדית לפני שתמשיך. כל הכלים והחומרים הכימיים צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש. 1. הכנת כלים, פתרונות, ותערובת ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט המלוטש אש 100 מ&quot;מ לחולץ micropipette. הגדר חימום כדי לאפשר משיכה משוקללת סטנדרטית כדי ליצור קצה פיפטה של ​​כ 17.5 מ&quot;מ. חותכים טיפים במספריים כירורגית חדים במרחק כ 8-9 מ&quot;מ מההתחלה של הקצה כדי ליצור בערך פתיחת מיקרומטר קוטר 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מניית 1% w / v פתרון ירוק ומהיר על ידי ערבוב מים מסוננים nuclease חינם (ניצול מסנן מזרק 20-מיקרומטר) עם ירוק מהיר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את ה-DNA מטוהר ללא רעלן פנימי פלסמיד שמרוכז מאוד (כלומר&gt; 3 מיקרוגרם / μl), בדילול מלא חיץ טריס-EDTA (TE). כמויות להוסיף רצויים של פלסמידלתערובת מדוללת בTE חיץ ולהוסיף יחס 01:10 של הפתרון הירוק מהר 1% (מה שהופך את 0.1% w / v ריכוז סופי של ירוק מהיר). השתמש בריכוז סופי 0.5-2.0 מיקרוגרם / μl של פלסמיד לביטוי חזק של transgenes. </li></ol> 2. בעלי החיים הרדמה, טוען פיפטה, והזרקת פלסמיד שטח pial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום הרדמה היפותרמיה על עכברים לאחר הלידה 1-2 יום על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי, כי הוא ממוקם על קרח למשך 5-8 דקות (זמן תלוי בגיל גור / משקל). ברגע שהיפותרמיה היא אושר על ידי חוסר התנועה מרפלקס זנב ו / או צביטת הבוהן, עכברים מוכנים להיות מוזרק. הנח חיות בחזרה על קרח אם רפלקסים כאב ניכרים. הליך ההזרקה וelectroporation לקחת פחות מ 2-3 דקות בסך הכל כל כך זמן היפותרמיה, ההזרקה, ונהלי electroporation בהתאם כדי לשמור על ההרדמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הרדמה, באמצעות פיפטה סטנדרטית, בזהירות פיפטה רצויה כמות plasmiד לערבב להיות מוזרקים (0.5-2 μl) על גבי חתיכת סרט שעוות פרפין להתייחסות. כאן, בהיקף כולל של 0.5 μl של תערובת פלסמיד מוזרק. בשלב הבא, באמצעות מזרק מיקרו, להוסיף בזהירות פיפטה נימי זכוכית התאסף לתוך תערובת פלסמיד צינור המכיל. לנקוט אמצעי זהירות נוספת כדי למנוע את הקצה מהשבירה על ידי ביצוע בטוח שזה לא נוגע בקצוות של הצינור. לשאוב את הפתרון לתוך פיפטה על ידי החיוג באיטיות חזרה חיוג ההעברה. ברגע שנפח מספיק כבר נטען לתוך פיפטה, חייג קדימה עד החזרי לחץ למצב הניטרלי של 0 hPa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש 300-450 לחץ hPa להזרקה כדי להבטיח לחץ מתאים לאף מילוי של פני השטח / חלל קרום מוח pial, מקום הקצה סמוך הזרקת pipetted התייחסות סרט שעוות פרפין (מ2.2) ולהשתמש בדוושת הרגל מהזרקת מיקרו כדי להוציא אחד נפח על סרט שעוות פרפין. התאם את לחץ בהתאם עד הסכום נפלט שווה referenc pipetted בעברדואר בנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהקצה כבר equilibrated והרדמה כבר אישרה, גורים הם מוכנים להיות מוזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרת הניסוי היא להזריק את תערובת פלסמיד תחת הגולגולת ומעל פני השטח pial כדי לאפשר electroporation DNA כלפי מטה לתוך אבות pial פני השטח (איור 1 א). עבור זריקות קליפה, החזק את הגור מטה בעזרת האגודל ואצבע המורה של היד הדומיננטית פחות. ההמיספרות בקליפת המוח ומבנים שטחיים אחרים כגון colliculi מעולה גלויות בין P0 ו P2, המאפשרות מיקוד קליל של מבנים אלה (איור 1). שימוש באזור היד הדומיננטי והמטרה הרצויה של קליפת המוח (כלומר, מוטורי, החושית, וכו &#39;), הכנס פיפטה עבר את העור והגולגולת לטפל כדי למנוע עורקי מוח. ודא כדי למנוע כל חדירה נוספת של הקצה האחרון הגולגולת (אשר מסומן על ידי חוסר התנגדות נוספת רק לאחר שרצעתי את הגולגולת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק plasmפתרון id באמצעות דוושת הרגל של הזרקת מיקרו ולוודא שהוא מפזר באופן שווה על פני (איור 2 א) לרקמות. הערה: חשוב מאוד כדי לקבוע את הגישה למיקסום משלוח פלסמיד, תוך הימנעות שטף דם בשל לחץ נוזלים באופן אמפירי. ניתן לעשות זאת על ידי התאמת משך ההזרקה, את הזווית, את עוצמת הקול, ואתר היעד המדויק על מנת למנוע פגיעה בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לנסות ולשמור על הקצה מהתייבשות בין זריקות על ידי הצבת הקצה בטיפי בדיקה מזריקות שנעשו בעבר על נייר שעווה או פרפין סרט פלסטיק. זה נדרש כדי למנוע הצטברות קצה של פתרון ה-DNA התאדה והתגבש, אשר עלול לגרום לסתימה של הקצה וכרכי משלוח עולים בקנה אחד. </li></ol> 3. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את electroporator ל135-150 V במשך חמש פעימות, שנמשך 50 אלפית שני, עם 950 מרווחים אלפיות שניים בין כל דופק. על מנת להגדיל את המוליכות ולמנוע שריפה של העור, לכסות tweezertrodes פלטינה 3 מ&quot;מ עם ג&#39;ל electroporation. הגעה לרפלקסים צובט בוהן וזנב בשלב זה, כדי להבטיח הרדמה. אם מגיב, מניח על קרח במשך כמה דקות כדי להרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקות קליפת המוח (וcolliculus מעולה), להעסיק אלקטרודה 3 מ&quot;מ (איור 2) כדי להגדיל את הכדאיות של גורים (לעומת 7 - ואלקטרודות 10 מ&quot;מ, המשמשים לelectroporation אזור חדרית). מניחים את חללית מטען השלילית של האלקטרודה מעל האזור המוזרק ובדיקת מטען החשמלית החיובי ברחבי האזור הנגדי מתחת לעין, כך שהנטייה היא באלקטרודה 45-60 ° זווית יחסית לקו האמצע (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדוושת הרגל של electroporator כדי לעורר נוכחית ולהחזיק tweezertrodes במקום 3-5 קטניות, תלוי בגיל גור ובמשקל, ביעילות מיקוד DNA לתאי שטח pial בסיסי כאשר חשבונאי העקמומיותשל ההמיספרות. הערה: הקוטב השלילי ניתן שטף את אזור ההזרקה בבין הפולסים או האלקטרודה גדול יותר יכול להיות מועסק על מנת להגדיל את שטח electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר electroporation, לנקות בזהירות את הג&#39;ל מגורים ולמקם אותם תחת מנורת חום למשך כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורים בחריפות יאבדו את הגוון אדמדם ורוד הטבעי שלהם בדקות לאחר electroporation בשל כיחלון. שים לב הגורים להתאוששות של צבע טבעי והחניכה של תנועה נורמלית לפני החזרתם לכלובים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא חיברות מחדש עם האם על ידי התבוננות אם היא מביאה את הגורים בחזרה לקן ומתחילה טיפוחם. אם היא הופכת להיות אגרסיבית, לעשות אין לי גורים בטוחים שאריות של ג&#39;ל דגירה אותם עם חלק מהמצעים להעביר את הריח לגורים. </li></ol> 4. שינויים עבור מיקוד הקוליקולוס העליון מיקוד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Inject colliculus מעולה באותו אופן כקליפה אבל שים לב שאזור היעד נמצא ממש אחורי וצדדי למבדה ובערך בקו האמצע (3A ואיורים 3 ב). עם זריקות מוצלחות, תערובת פלסמיד באופן טבעי ממלאת את קווי המתאר של colliculus מעולה. ברגע שזריקות נעשו בהצלחה, בעלי החיים מוכנים לelectroporation. </li></ol> Electroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה מאוד, לזריקות colliculus מעולים, למקם את חללית מטען השלילית של האלקטרודה מעל האזור המוזרק ובדיקת מטען החשמלית החיובי סביב העין, החוטם או הסנטר, נהיגה ה-DNA לתוך האזורים השטחיים של colliculus מעולה (איור 3 ג) . במקרה זה, את כיוון האלקטרודה הוא ב25-40 ° זווית יחסית לקו האמצע. </li></ol>

<ol>
	<li>Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+historical+perspective+and+future+prospects.">Neural stem cells: historical perspective and future prospects.</a> Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), (2000).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+that+glitters+isn't+gold:+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses.">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li><li>Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginal+zone/layer+I+as+a+novel+niche+for+neurogenesis+and+gliogenesis+in+developing+cerebral+cortex.">The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).</li><li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genetic+targeting+of+pial+surface+neural+progenitors+and+immature+neurons+by+neonatal+electroporation.">Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation.</a> Neural Dev. 7, (2012).</li><li>Ohira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-induced+neurogenesis+of+neocortical+layer+1+progenitor+cells.">Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells.</a> Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).</li><li>Schmechel, D. E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golgi+study+of+radial+glial+cells+in+developing+monkey+telencephalon:+morphogenesis+and+transformation+into+astrocytes.">A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes.</a> Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).</li><li>Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+of+the+pial+basement+membrane+in+cortical+histogenesis.">A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis.</a> J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).</li><li>Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+neurons+of+the+human+cerebral+cortex.">The first neurons of the human cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).</li><li>Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidirectional+and+multizonal+tangential+migration+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex.</a> Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).</li><li>Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+migratory+coordinates+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+mouse+cortex.">Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex.</a> J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).</li><li>Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+route+of+tangentially+migrating+neurons+in+the+developing+neocortical+intermediate+zone.">Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone.</a> J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).</li><li>Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+cortical+layer+1.">The yin and yang of cortical layer 1.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).</li><li>Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+two+new+cortical+interneuronal+circuits.">The organization of two new cortical interneuronal circuits.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).</li><li>Endo, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+different+AMPA-type+glutamate+receptors+in+morphologically+identified+neurons+in+rat+superficial+superior+colliculus.">Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus.</a> Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).</li><li>Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinhibition+in+rat+superior+colliculus+mediated+by+GABAc+receptors.">Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors.</a> J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).</li><li>Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+waves+coordinate+patterned+activity+throughout+the+developing+visual+system.">Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system.</a> Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li><li>Boller, M., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+GABA(A)+and+GABA(C)+receptor+function+in+the+mammalian+superior+colliculus.">Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus.</a> Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex.">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).</li><li>De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+circuit+connectivity+in+postmitotic+neocortical+neurons.">In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), (2008).</li><li>Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis.">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat Commun. 3, (2012).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition.">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+monomeric+blue+fluorescent+protein+with+the+high+chemical+stability+of+the+chromophore.">An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ההיבט הקריטי ביותר עבור electroporation המוצלח של אבות שטח pial הוא: 1) מיקוד של תערובת פלסמיד אל פני השטח pial; 2) הימנעות מהדור של שטפי דם באזור ההזרקה; ו 3) הימנעות התמותה קשורה עם electroporation המוח התיכון. כראוי מיקוד שטח pial מושגת על ידי ניקוב מדו?...

תאי גזע עצביים ומצויים כעת בכל 1 במערכת העצבים המרכזית של היונקים, 2. הטבע והנכסים באזורים נבטי עובריים ובוגרים המקיפים את אזורי חדרית של המוח וחוט השדרה שלהם תועדו בהרחבה בעשור האחרון 1-3. במידה רבה, זה כבר בשל פיתוח כלים גנטיים מדויקים יותר ויותר, כגון רקומבינציה Cre הספציפית במערכת עצבים של אללים floxed או שושלת רטרווירלי התחקות 4. עם זאת,-אזור הבדיקה המקיפה-יש אזור מוליד שטח pial לאחרונה תואר רק בכל פרט 5-7 ומחכה אב אחד. שטח pial של המוח מוגדר כממשק בין פני השטח של המוח וקרומי המוח שמסביב 8. במהלך פיתוח, neuroepithelial, ומאוחר יותר, רגליים סוף גלייה רדיאלי לצרף שטח זה 9,10. חלק מהאשוחנוירונים st במוח האנושי ורבים mitoses עצבי הם נצפו באזור זה 11. מאוחר יותר, במהלך נוירוגנזה עוברית, interneurons קליפת המוח ידוע לחצות את אזור pial, בנוסף למסלולי הנדידה שלהם באזור ביניים והאזור subventricular 12-14. במהלך תקופה זו, יכול להיות מתורבת בתאי גזע מאזור זה וזה נראה אתר פעיל של נוירו וgliogenesis 5. במוח הבוגר, זה כבר דיווח כי יכול להיוולד interneurons מאבות שטח pial הבא אתגר חוסר חמצן 7. עם זאת, תרומתו של אזור זה לו לgenensis במהלך התפתחות עוברית ואחרי הלידה נשארה מעורפלת בין שאר בשל הקושי באופן ספציפי חוקר אזור זה 6. בcolliculus מעולה ובקליפת המוח, interneurons השטחי (או ששכבה בקליפת המוח) יכול לווסת את פלט המעגל של אוכלוסיות נוירון מעוררות בסיסית ובכך לתרום significantly לפונקציה של מבנים אלה. בפרט, interneurons 1 השכבה נמצא בעמדה מעולה כדי להסדיר את הירי של נוירונים בכל השכבות העליונות של קליפת המוח ניתנה הקישוריות הנרחבת שלהם לשכבות השטחיות ועמוקות של עמודות בקליפת המוח 15,16. באופן דומה, interneurons האופקי מקבל קלט מעורר מסיבי קליפת המוח ורשתית, פרויקט על פני שטח רחב יחסית, והם העריכו לתווך עיכוב של אוכלוסיות עצביות מגיבות לגירויים חזותיים מרחוק 17,18. כמו כן, המורפולוגיה שלהם היא מתאימה היטב לתפקיד פוטנציאלי בפעילות הגלים בדוגמת במערכת הראייה מתפתחת 19. מעניין לציין, כי פיתוח interneuron והתבגרות קורה במידה רבה אחרי לידה. יתר על כן, כבר נמצא בתהליך התבגרות זה להיות מוסדר על ידי פעילות עצבית ולכן מצע של פלסטיות התפתחותית עם השלכות לכל החיים על תפקוד מעגל 20,21. יש לציין, nהיזמים o מתוארים בו באופן ספציפי יכולה למקד תאים אלה transgenically. יכולים להיות ממוקדים אבות החלוקה עם רטרווירוס 7 אבל ייצור וירוס הוא זמן רב ודורש מיומנות להניב כותרות גבוהות הנדרשות לתמרת תא. Electroporation הוביל לתחייה בחקר התפתחות הנוירולוגית שכן היא מאפשרת לחקירה גנטית מהירה ויעילה של מסלולי איתות באבות עצביים 4, 22, 23. Electroporation כולל הזרקה של ה-DNA פלסמיד, ואחריו את המסירה של פולסים חשמליים לחלק החיצוני של הראש, לנהוג unidirectionally דנ&quot;א לתוך תאי האב מתרבים המקיפים את חדרי הלב 4, 22, 23. Electroporation מופיע לדרוש מעבר של תאים דרך שלב M של מחזור התא לביטוי של transgenes פלסמיד 24. באופן ספציפי, זה כבר נמצא כי רקתאים עוברים שלב M בתוך 8 שעות של electroporation של פלסמידים יביעו transgenes למרות המשלוח שלהם היעיל לכל התאים בתוך ~ 160 מיקרומטר של קיר חדרי 24. ישן סברה שזה נובע מצורך בפירוק מעטפת גרעין במאפשר גישה גרעינית של פלסמידים episomal, כמו כימיקלים שגורמים permeabilization הגרעיני יכולים לגרום לביטוי של פלסמידים בתאי הודעה המיטוטי 25. מועסק במקור בעובר 22, electroporation הותאם לשימוש במוח לאחר הלידה הרבה יותר מאוחר 26, 27. לאחרונה, יש לנו להתאים electroporation לשימוש במניפולציה הגנטית של אבות שטח pial 6. יתר על כן, שימוש בגישה זו שהראינו שיש כנראה שתי שושלות שונות של אבות באזור 6-איטרניורונאליים וastrocytic זה. פרוטוקול זה מפרט את דרך פשוטה, מהירה, וחזקה כדי למקד את התאים האלה לחקירהשל פיתוח ויסות מנגנונים של תאים אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

בשנים האחרונות שטח pial זוהה כנישה נבטי חשיבות בנוירו וgliogenesis עובריים, לידה ומבוגר, ביניהם לאחר פציעה. עם זאת, שיטות לחקירה גנטית אוכלוסיות אב אלה ומעקב אחר השושלות שלהם היו מוגבלות בשל חוסר ספציפי או זמן רב ייצור של וירוסים. לכן, התקדמות באזור זה הייתה איטי יחסית עם רק קומץ של חקירות של מיקום זה. Electroporation שמש במשך יותר מעשור כדי ללמוד מאפיינים של תאי גזע עצביים בעובר, ולאחרונה גם במוח לאחר הלידה. כאן אנו מתארים טכניקה יעילה, מהירה, ופשוט למניפולציה הגנטית של אבות שטח pial מבוססים על גישת electroporation מותאמת. electroporation שטח pial מאפשר תיוג קליל גנטי ומניפולציה של אבות אלה, ובכך מייצג גישת חיסכון בזמן וחסכוני לחקר תאים אלה.

תוצאות pial משטח electroporation בביטוי של ה-DNA פלסמיד בתאים, בעיקר אבות, או בסמוך לפני שטח pial 6. באופן ספציפי יותר, את הכיוון של אלקטרודות הוא קריטי במכתיב את כיוון התנועה וביטוי פלסמיד שלאחר מכן. כך, בתצורות אלקטרודה כפולה, פלסמיד מופנה בערך וקטור ישר בין האלקטרודה השלילי...

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Pial Surface Electroporation at JoVE.com

Neonatal Pial Surface Electroporation

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Electroporation שטח pial ילודים

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Views.  Cedars-Sinai Medical Center.  שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורב...

Video: Neonatal Pial Surface Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Electroporation האזור Subventricular ילודים

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying neonatal seizures and hypoxia ischemia. This manuscript describes a method for continuous video electroencephalogram (EEG) monitoring in neonatal mice to detect seizures and analyze EEG background during hypoxia ischemia. Use of video and EEG in conjunction allows description of seizure semiology and confirmation of seizures. This method also allows analysis of power spectrograms and EEG background pattern trends over the experimental time period. In this hypoxia ischemia model, the method allows EEG recording prior to injury to obtain a normative baseline and during injury and recovery. Total monitoring time is limited by the inability to separate pups from the mother for longer than four hours. Although, we have used a model of hypoxic-ischemic seizures in this manuscript, this method for neonatal video EEG monitoring could be applied to diverse disease and seizure models in rodents.

This manuscript describes a method for continuous video EEG recordings using multiple depth electrodes in neonatal mice undergoing hypoxia-ischemia.

אלקטרואנצפלוגרמה וידאו רציפה במהלך היפוקסיה-איסכמיה בעכברים יילודים

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and lifelong neurological deficits. While PHH can be treated by temporary and permanent cerebrospinal fluid (CSF) diversion procedures (ventricular reservoir and ventriculoperitoneal shunt, respectively), there are no pharmacological strategies to prevent or treat IVH-induced brain injury and hydrocephalus. Animal models are needed to better understand the pathophysiology of IVH and test pharmacological treatments. While there are existing models of neonatal IVH, those that reliably result in hydrocephalus are often limited by the necessity for large-volume injections, which may complicate modeling of the pathology or introduce variability in the clinical phenotype observed.
Recent clinical studies have implicated hemoglobin and ferritin in causing ventricular enlargement after IVH. Here, we develop a straightforward animal model that mimics the clinical phenotype of PHH utilizing small-volume intraventricular injections of the blood breakdown product hemoglobin. In addition to reliably inducing ventricular enlargement and hydrocephalus, this model results in white matter injury, inflammation, and immune cell infiltration in periventricular and white matter regions. This paper describes this clinically relevant, simple method for modeling IVH-PHH in neonatal rats using intraventricular injection and presents methods for quantifying ventricle size post injection.

We present a model of neonatal intraventricular hemorrhage using rat pups that mimics the pathology seen in humans.

דוגמנות דימום תוך חדרי ילודים באמצעות הזרקה תוך-חדרית של המוגלובין

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

עכבר מוח יילודים סריקת מיקרו-CT ועיבוד תמונה

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

מחבר זרקור: הדמיה ברזולוציה גבוהה של מוחות יילודים של עכברים – פרוטוקול מיקרו-CT עם חומר הניגוד לפתרון של לוגול

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

הדמיית מיקרו-CT וניתוח מורפומטרי של מוחות יילודים בעכברים

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...