אנו מודים למייק Vahey ממעבדת פלטשר באוניברסיטת קליפורניה, ברקלי לקבלת ייעוץ על הפרמטרים microjetting. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענק DP2 HL117748-01.

1. ייצור אינפיניטי הקאמרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את חדר האינסוף (על שם צורתו) באמצעות מחשב עיצוב בסיוע (CAD) תוכנה, ולשמור את הקובץ כך שהוא תואם עם חותך לייזר. כדי ליצור את הצורה הזו, שני מעגלים נפרדים של קוטר 0.183 במרחק של 0.15 פנימה מרכז למרכז חותכים את התא מ1/8- 3/16 באקריליק ברור עם חותך הלייזר. צורת האינסוף מאפשרת היווצרות טיפת ממשק bilayer ויציבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדחה 1/16 בחור בקצה של חדר אקריליק גם בצורת אינסוף. חזור על פעולה בצד השני. לחתוך מלבן קטן מגיליון 0.2 מ&quot;מ אקריליק עם מספריים או חותך לייזר לשמש כתחתית לבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה אך מלאה של דבק מהיר ייבוש לצד אחד של אקריליק 0.2 מ&quot;מ ולהדביק אותו לחלק התחתון של החדר. החזק אקריליק 0.2 מ&quot;מ בחוזקה במקום נגד התחתון של החדר ולוותרהדבק בממשק כדי לאפשר את הדבק ליצור חותם, אך להימנע מכסה את אזור התצוגה. הקפד ליישר אקריליק, כך שהקצה שלה הוא מיושר עם הקצה של קיר החדר והוא מכסה את נתק קאמרי אינסוף לחלוטין. זה יאפשר לחדירת מטוס מספיקה ולמנוע דליפה של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך שתי חתיכות קטנות של גומי טבעי כדי לכסות את החורים שנקדחו. החל דבק מהיר ייבוש סביב החור. הנח את הגומי מעל החור והעיתונות בכל התחומים עם זוג מלקחיים כדי לאבטח. חזור על פעולה עבור שני חורים שנקדחו. הקפד שכל חיבורים מודבקים הם חותמות מלאים כדי למנוע כל דליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות G 23, 1 במחט, לתקוע חור בגומי הטבעי בשני הצדדים של החדר כדי להקל על כניסה של קצה דיו פיזואלקטריים. </li></ol> 2. ניסיוני הכנה פתרון שומנים מניית חנות בכלורופורם ב-20 ° C במקפיא. במחקר זה, או 1,2-diphytanoי.ל.-SN-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) או 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (dOPC) היה בשימוש. 2 מיליליטר של 25 מ&quot;ג פתרון שומנים מיליליטר / מוכן בדרך כלל בפרוטוקול זה ויימשך במשך חודשים כאשר מאוחסן ב -20 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי resuspend השומנים בn-decane, להעביר ראשון אותו מבקבוקון המניה לצנצנת זכוכית קטנה, ועדינות יבשה תחת ארגון או חנקן. להחזיק את הצנצנת בזווית תוך ייבוש לחשוף יותר שטח פנים לגז, המאפשר לשומנים בדם לייבוש מהירים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הכובע של הצנצנת הדפוקה רק מעט על, לאפשר הפתרון המיובש לשבת תחת ואקום בתא ייבוש ל1-2 שעות. לאחר מכן להוסיף n-decane לresolubilize השומנים ב25 מ&quot;ג / מיליליטר. ורטקס בקצרה פתרון השומנים בדם וsonicate זה בsonicator אמבטיה במשך 15 דקות. אחסן את השומנים מחדש בn-decane ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון סוכרוז המניות. בצינור microcentrifuge 1.5-מיליליטר, להוסיף 900 ​​μl של 300 סוכרוז מ&quot;מ ו100 μlשל methylcellulose 1% (MC). Methylcellulose מתווסף להגדלת צמיגות של הפתרון, אשר מסייע בjetting. שלב אופציונאלי: הוסף 1 μl אופציונלי של צבע אוכל בצבע כהה או חרוזי ניאון להלוות יותר ניגוד או הקרינה בתחום הדמיה, בהתאמה. פתרון זה הוא פתרון 300 סוכרוז mOsm נועד להתאים osmolarity הסלולרי ולספק ניגוד במהלך microjetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הפתרון לתוך מזרק פלסטיק 1 מיליליטר חד פעמי. בעוד מחזיק את המזרק עם הקצה כלפי מעלה, קפיצי המוט שוב ​​ושוב לגרש את כל בועות לכיוון הקצה, ולדחוף את הבוכנה כדי להוציא את האוויר שנלכד. הקפד לפנות את כל האוויר מהמזרק לפני שימשיך, כפי שהוא יפריע להתכווצות פיזואלקטריים נכונה אחראית לjetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקין מסנן 0.22 מיקרומטר בסופו של המזרק. כדי למנוע מאוויר שנלכד במסנן, החזק את המזרק אנכי ולדחוף את הבוכנה עד טיפה נוצר מעל לקצה. הערה:יחידת מסנן מזרק בקוטר מ&quot;מ 33 נמצאה עבודה הטובה ביותר, אבל מסננים חלופיים קטן כמו מסנן מזרק בקוטר 3 מ&quot;מ יכולים לשמש כדי להפחית את הנפח מת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הברגת מתאם Luer הנשי של הזרקת הדיו, ובאופן מאובטח לחץ אותו במקום מעל הסוף של המסנן. שוב, להוציא את הנוזלים כדי למנוע לכידת אוויר. בורג בחלק העליון של הזרקת הדיו. נוזל צריך לנסוע לקצה לאחר הזרקת הדיו הוא מחובר לגמרי. </li></ol> 3. מכין את הציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות v-מהדק, הר ההרכבה המזרק על הבמה מיקרוסקופ. צרף את החוט מהדיו אל הבקר הזרקת הדיו. הערה: שלב מותאם אישית נבנה עבור פרוטוקול זה, ואילו העיצוב במה יכול להיקבע על ידי המשתמש, זה הוא קריטי כדי לקבל שליטת XYZ עצמאית של המזרק ובקרת XY של בעל המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ההגדלה ושילוב עדשה דרושה כדי להשיג את ההדמיה הרצויה. כאן מטרת 10X ועינית 10X משמשים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצלמה במהירות גבוהה (≥ 1,000 תמונות בשנייה) כדי להמחיש את jetting ודור שלפוחית. לפני ההדמיה, לבצע כיול מצלמה הכרחי. לנצל מבוסס תמונה אוטומטית הדק בתוך תוכנת המצלמה ליזום לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרי אינסוף לבמה מיקרוסקופ. אבטח את התא על ידי הדבקתו למקומו על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות ליישר את קצה הזרקת הדיו עם החור המנוקב בגומי הטבעי (ראה איור 1b). כדי לעשות זאת, להביא את דיו הקרוב לחדר ולהתאים את המיקום לפי העין, ולאחר מכן לבצע התאמות מדויקות יותר דרך עדשת המיקרוסקופ. להמשיך בזהירות, כתנועות גסות עלולות לגרום נזק לקצה הזרקת הדיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדיו מיושר, לגבות את מכלול המזרק מהחדר על מנת למנוע כל נזק להזרקת דיו במהלך הטעינה של הבארות. הקפד שתנועה של הזרקת הדיו היא חד כיווני, כך שהוא נשאר בקו אחד עם החור בקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעדינות על plunגר של ההרכבה המזרק עד לקבלת טיפה קטנה בנחיר הזרקת הדיו. זה יספק כמה backpressure ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט הפרמטרים jetting. לגל דו קוטבי טרפז, השתמש בפרמטרים הבאים: תדירות 20 קילוהרץ דופק, 3 זמן μsec עלייה, 35 משך μsec דופק, 3 זמן μsec סתיו, 65 V מתח להחיל (משרעת דופק), ו100 פולסים סילון להדק (מספר דופק) . עם זאת, המתח להחיל (משרעת דופק) ומספר דופק (פולסים סילון להדק) יכולים להיות מגוון כדי לשלוט בגודל שלפוחית. </li></ol> 4. שלפוחית ​​דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 25-30 פתרון השומנים μl המושעה בn-decane לתא האינסוף, המכסה את פני השטח המלא של שני הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 גלוקוז μl (של אותו osmolarity כפתרון סוכרוז) עד לקצה החיצוני של אחד טוב, pipetting באיטיות ובצורה חלקה. על התצהיר, ירידה של גלוקוז צריכה טופס, כי רמת הסוכר ושומנים בדם פתרון לא מתערבבות. הוסף 25 אחר1; ליטר של גלוקוז ולהפך, מה שיגרום עוד טיפה ויוצר את קרום bilayer שומנים באמצע החדר בתוך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את דיו דרך הגומי הטבעי, ולהדריך אותו בזהירות לכיוון bilayer ממשק טיפה. גישת bilayer לאט, כמו הזרקת הדיו הציג את מקומו של נפח ויכול להיקרע bilayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר דיו הוא בתוך ~ 200 מיקרומטר, להחיל jetting עם ההגדרות מתוארות בשלב 3.8. המרחק מ bilayer עשוי להשתנות בעיקר בהתאם למספר המתח ודופק, בין פרמטרים נוספים. פרוטוקול זה ממליץ להגדיל לאט הגדרות (מתח ומספר דופק) והתבוננות עיוות bilayer. </li></ol> 5. ניקוי הציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ההרכבה המזרק מבמת מיקרוסקופ, ולהשליך את מזרק פלסטיק 1 מיליליטר ומסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את הזרקת הדיו, לשאוב את הפתרונות הבאים לפי סדר על ידי טבילת הקצה בsolution 7-10x כל: אתנול 70%, 2% פתרון Neutrad במים חמים, 70% אתנול, וDDH 2 O. אם דיו אינו מתאים באופן מאובטח על פיפטה השאיפה, לחתוך קצה פיפטה כדי ליצור מתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את החדר עם רקמה. מניחים את חדר האינסוף בכוס 250 מיליליטר עם 2% Neutrad V / V במים חמים, וsonicate ל5-10 דק &#39;. לאחר sonication, להתייבש היטב הבארות תחת אוויר דחוס. כל לחות בבארות יכולה לסכן את היציבות של קרום bilayer השומנים בדם, ולכן מומלצת גם כי התאים ממוקמים בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li><li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry.">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li><li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments.">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li><li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).</li><li>Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles+as+Biochemical+Compartments:+The+Use+of+Microinjection+Techniques.">Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques.</a> Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).</li><li>Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+templated+monodisperse+phospholipid+vesicles.">Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles.</a> Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).</li><li>Matosevic, S., Paegel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+Synthesis+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+a+Microfluidic+Assembly+Line.">Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).</li><li>Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles.">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+formation+of+unilamellar+lipid+vesicles+for+cell-like+encapsulation.">Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation.</a> Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).</li><li>Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions.">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li><li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets.">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li><li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis.">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers.">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקות רבות פותחו עבור דור שלפוחית, כולל electroformation, תחליב, ודור אגל 14-16. עם זאת, ניסיוני בטכניקות חדשות נחוצות כדי לאפשר את העיצוב של מערכות ביולוגיות עם דמיון הולך וגדל למערכות חיות. שיטות microfluidic בפרט הציעו רמה מוגברת של שליטת שלטון unilamellarity קרום, monodispersity של גודל...

<html> זה הפך להיות יותר ויותר ברור שביולוגיה של תא היא בעיה רב היקף שיש בו שילוב של ההבנה שלנו ממולקולות לתאים. כתוצאה מכך, לדעת בדיוק כיצד מולקולות לעבוד בנפרד אינו מספיק כדי להבין התנהגויות הסלולר מורכבות. זה נובע בחלקו על קיומה של התנהגות מתהווה של מערכות מרובות רכיבים, כפי שהודגם על ידי הכינון מחדש של אינטראקציה ברשת אקטין עם שלפוחית ​​bilayer השומנים 4, הרכבה ציר mitotic בXenopus לחלץ 5, ואת הדינמיקה המרחבית של מנגנונים חלוקת תא חיידק 6. דרך אחת כדי להשלים את הגישה של הרדוקציוניסטית לנתח את התהליכים המולקולריים של מערכות חיות היא לקחת את הגישה ההפוכה של בנייה מחדש של התנהגויות הסלולר באמצעות מספר מינימלי של מרכיבים ביולוגיים. חלק קריטי של גישה זו כרוך אנקפסולציה אמינה של ביומולקולות בנפח מוגבל, תכונה מרכזית של תא. e_content &quot;&gt; מספר אסטרטגיות קיימות לencapsulating ביומולקולות ללימוד מערכות biomimetic. הרלוונטי ביותר מבחינה הביולוגית המערכת היא קרומי bilayer שומנים, המחקים את האילוצים ביוכימי ופיזיים שהוטלו על ידי קרום הפלזמה של התא. היווצרות שלפוחיות ענקית unilamellar (GUVs) על ידי electroformation 7, אחת הטכניקות הנפוצה ביותר לייצור בוס 14, בדרך כלל יש תשואת אנקפסולציה עניים בשל חוסר התאימות שלה עם חיץ מלח גבוה 8. Electroformation גם דורש כמויות מדגם גדולות (&gt; 100 μl), שעלולה להיות בעיה לעבודה עם חלבונים מטוהרים , ולא יעיל משלב מולקולות גדולות בשל קושי של דיפוזיה בין שכבות שומנים צפופות. מספר גישות microfluidic ליצירת שלפוחית ​​שומנים פותחו. שיטות התחליב כפולות, שעוברים רכיבים באמצעות שני ממשקים בין שכבות מים שמן ומים (W / O / W), מסתמך על האידוי של volatile ממס לנהוג היווצרות bilayer שומנים 9. אחרים השתמשו בקו ההרכבה microfluidic שמייצר זרם רציף של שלפוחית ​​השומנים bilayer 10 או בשני שלבים עצמאיים 11. פיתחנו טכניקה חלופית המבוססת על מהירות החלת פולסים נוזל נגד bilayer ממשק אגל 12 לייצר GUVs של גודל מבוקר, קומפוזיציה, ואנקפסולציה. הגישה שלנו, המכונה jetting microfluidic, מציעה את היתרונות בשילוב בין כמה טכניקות דור שלפוחית ​​קיימות, מתן גישה ליצירת מערכות biomolecular פונקציונליות לחקירת מגוון רחב של בעיות ביולוגיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:633px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:160px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Piezoelectric Inkjet</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">MJ-AL-01-xxx</td>
			<td style="width:160px;">xxx denotes orifice diameter in microns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Jet Drive III Controller</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">CT-M3-02</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">High-speed camera</td>
			<td style="width:163px;">Vision Research</td>
			<td style="width:157px;">MiroEX2</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">DPhPC lipid in chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:157px;">850356C</td>
			<td style="width:160px;">Ordered in small aliquots in vials</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">33mm PVDF filters, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">1ml syringes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">14823434</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">n-Decane</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">111871000</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">410950010</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7903-1KG</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9084958</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:153px;">1/8&#34; Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">8560K239</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">0.2 mm Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">Astra Products</td>
			<td style="width:157px;">Clarex clear 001</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Acrylic Cement</td>
			<td style="width:163px;">TAP Plastics</td>
			<td style="width:157px;">10693</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Loctite 495 Superglue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9011323</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td>
			<td style="width:163px;">Strobels Supply</td>
			<td style="width:157px;">30765</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Natural rubber</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">85995K14</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Custom stage</td>
			<td style="width:163px;">Home made</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs are available upon request</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה מציגה גישה חדשנית לבירור ולבנייה מחדש של מערכות ביוכימיות ו, באופן פוטנציאלי, אורגניזמים מינימאליים. תחום מתפתח זה עוסק מהנדסים, כימאים, ביולוגים, פיסיקאים ולעצב ולהרכיב רכיבים ביולוגיים בסיסיים למערכות מורכבות, פועלות מלמטה למעלה. מערכות מלמטה למעלה כזה יכול להוביל להתפתחות של תאים מלאכותיים לבירורים ביולוגיים בסיסיים וטיפולים חדשניים 1,2. שלפוחית ​​ענקית unilamellar (GUVs) יכולה לשמש כפלטפורמת מודל לביולוגיה סינתטית בשל המבנה שלהם כמו קרום תא וגודל. jetting microfluidic, או microjetting, הוא טכניקה המאפשרת לדור של GUVs עם גודל מבוקר, הרכב קרום, שילוב חלבון הטרנסממברני, ואנקפסולציה 3. העיקרון הבסיסי של שיטה זו הוא השימוש בפולסים מרובים, בתדירות גבוהה נוזל שנוצרו על ידי מכשיר הזרקת דיו ומונע piezo כדי לעוות l מושעהbilayer ipid לבוס. התהליך דומה לפיצוץ בועות סבון מסרט סבון. על ידי שינוי בהרכב הפתרון נשפו, ההרכב של הפתרון המקיף, ו / או הרכיבים הנכלל בbilayer, חוקרים יכולים ליישם טכניקה זו כדי ליצור שלפוחית ​​מותאמת אישית. מאמר זה מתאר את ההליך כדי ליצור שלפוחית ​​פשוטה מbilayer ממשק אגל ידי microjetting.

יש לנו התאספנו התקנת jetting microfluidic על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונלי עם במה מותאמת אישית מורכבת מחלקים במכונה ומיקרומטרים ידניים (איור 1). אפיון של דיו מספק תובנה על תהליך יצירת שלפוחית. משתנה המרחק בין נחיר דיו וbilayer שומנים משפיע על הכוח ליישם כדי לגרו...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting at JoVE.com

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

lipid-bilayer-vesicle-generation-using-microfluidic-jetting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Views.  University of Michigan.  jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקו?...

Video: Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

הדפסה תלת-ממדית של מיקרוקארים הידרוג'ל במבחנה על ידי סילון כוח צמיג-אינרציאלי לסירוגין

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and Pfizer/BioNTech. These vaccines have demonstrated the efficacy of mRNA-LNP therapeutics and opened the door for future clinical applications. In mRNA-LNP systems, the LNPs serve as delivery platforms that protect the mRNA cargo from degradation by nucleases and mediate their intracellular delivery. The LNPs are typically composed of four components: an ionizable lipid, a phospholipid, cholesterol, and a lipid-anchored polyethylene glycol (PEG) conjugate (lipid-PEG). Here, LNPs encapsulating mRNA encoding firefly luciferase are formulated by microfluidic mixing of the organic phase containing LNP lipid components and the aqueous phase containing mRNA. These mRNA-LNPs are then tested in vitro to evaluate their transfection efficiency in HepG2 cells using a bioluminescent plate-based assay. Additionally, mRNA-LNPs are evaluated in vivo in C57BL/6 mice following an intravenous injection via the lateral tail vein. Whole-body bioluminescence imaging is performed by using an in vivo imaging system. Representative results are shown for the mRNA-LNP characteristics, their transfection efficiency in HepG2 cells, and the total luminescent flux in C57BL/6 mice.

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Here, a protocol for formulating lipid nanoparticles (LNPs) that encapsulate mRNA encoding firefly luciferase is presented. These LNPs were tested for their potency in vitro in HepG2 cells and in vivo in C57BL/6 mice.

בדיקת יעילות In Vitro ו-In Vivo של ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים שנוסחו על ידי ערבוב מיקרופלואידי

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...